Методическая статья

Усовершенствованный метод детектирования триметиламина в медицине животного происхождения с помощью газовой хроматографии в свободном пространстве с тандемной квадрупольной масс-спектрометрией

2.7K просмотров

⸱

DOI:

10.3791/65291

⸱

10 марта 2023 г.

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1State Key Laboratory of Southwestern Chinese Medicine Resources, Pharmacy School, Chengdu University of Traditional Chinese Medicine, 2China Resources Sanjiu Modern Chinese Medicine Pharmaceutical Co., Ltd, 3Innovative Institute of Chinese Medicine and Pharmacy, Chengdu University of Traditional Chinese Medicine, 4TCM Regulating Metabolic Diseases Key Laboratory of Sichuan Province, Hospital of Chengdu University of Traditional Chinese Medicine, 5Shimadzu (China) Co., Ltd

В этой статье

Уведомление об исправлении

Important: There has been an erratum issued for this article. View Erratum Notice

Краткое содержание

В данной работе описан метод газовой хроматографии и тандемной квадрупольной масс-спектрометрии (HS-GC-MS/MS), пригодный для определения триметиламина (ТМА) в лекарственных средствах животного происхождения. Протокол включает в себя предварительную обработку образца, обработку свободного пространства, условия анализа, методологическую валидацию и определение ТМА в лекарственных средствах животного происхождения.

Аннотация

Лекарственные препараты животного происхождения обладают отличительными характеристиками и значительными лечебными эффектами, но большинство из них имеют явный рыбный запах, что приводит к плохой комплаентности клинических пациентов. Триметиламин (ТМА) является одним из ключевых компонентов рыбного запаха в медицине животного происхождения. Трудно точно идентифицировать ТМА с помощью существующего метода обнаружения из-за повышенного давления во флаконе свободного пространства, вызванного быстрой кислотно-щелочной реакцией после добавления щелочи, что приводит к выходу ТМА из флакона с свободным пространством, что замедляет прогресс в исследовании рыбного запаха лекарств животного происхождения. В этом исследовании мы предложили метод контролируемого детектирования, который вводил слой парафина в качестве изолирующего слоя между кислотой и щелочью. Скорость производства ТМА можно эффективно контролировать, медленно разжижая слой парафина с помощью термостатического нагрева печи. Этот метод показал удовлетворительную линейность, точность экспериментов и восстановление с хорошей воспроизводимостью и высокой чувствительностью. Она оказывала техническую поддержку дезодорации лекарственных средств животного происхождения.

Введение

Лечению болезней человека с использованием продуктов, полученных из частей животных и/или их побочных продуктов (здесь именуемых лекарствами животного происхождения), уделяется повышенное внимание. Они играют важную роль в лечении рака, сердечно-сосудистых заболеваний, цирроза печени, мастита и других заболеваний, обладая преимуществами сильного эффекта, небольшой дозировки и значительной и специфической клинической эффективности. Однако лекарства животного происхождения, как правило, имеют ярко выраженный рыбный запах, который сильно влияет на комплаентность пациентов и особенно неблагоприятен для детей 1,2. Рыбный запах в основном исходит от белков, аминокислот, жиров и других веществ, содержащихся в лекарстве, которые разлагаются путем окисления жирных кислот, разложения аминокислот и другими способами с образованием различных веществ с рыбным запахом 2,3,4. Среди них триметиламин (ТМА) представляет собой летучий газ с рыбным запахом, который широко распространен в гниющих или гнилых продуктах животного происхождения5.

До сих пор для обнаружения ТМА в окружающей среде, пищевых продуктах и моче широко использовались газовая хроматография (ГХ), жидкостная хроматография (ЖХ), ионная хроматография, спектрофотометрия, жидкостная хромато-масс-спектрометрия (ЖХ-МС) и сенсорные методы 6,7,8,9. Ввиду низкой загрязненности колонки ГХ и системы впрыска, а также высокой чувствительности, воспроизводимости и низкого предела обнаружения (0,1-1 мг/кг) для анализа пищевых продуктов и биологического анализа был отдан предпочтение методу газовой хромато-масс-спектрометрии в свободном пространстве (HS-GC-MS)8. В настоящее время только в Китае установлен национальный стандарт для ТМА в пищевых продуктах, и HS-GC-MS является первым методом в стандарте GB5009.179-201610. Поэтому для выявления ТМА в медицине животного происхождения был выбран вышеуказанный метод HS-GC-MS. На ранней стадии наша исследовательская группа обнаружила, что стандарт обнаружения HS-GC-MS для ТМА в пищевых продуктах может обнаруживать рыбный запах в нескольких лекарствах животного происхождения. В сочетании с результатами исследований11,12 можно доказать, что ТМА является распространенным ключевым веществом рыбного запаха в лекарствах животного происхождения. Тем не менее, было обнаружено, что воспроизводимость экспериментальных результатов была низкой, и были такие проблемы, как побег ТМА и плохая стабильность, которые не могли быть проверены методологией. Это могло быть связано с тем, что щелочь вводилась во флакон свободного пространства, и быстрая кислотно-щелочная реакция приводила к повышению давления во флаконе, таким образом, ТМА выходила из поры инъекции, препятствуя стабильному и точному обнаружению ТМА. Таким образом, в данном исследовании был предложен усовершенствованный метод обнаружения газовой хроматографии с тандемной квадрупольной масс-спектрометрией (HS-GC-MS/MS) для решения этих проблем.

Протокол улучшает предварительную обработку образца за счет разделения кислотно-щелочных реагентов в предварительной обработке с помощью твердого парафина, хорошего материала для фазового перехода твердой и жидкой фаз. По мере того, как парафин медленно разжижался с повышением температуры термостатической печи, ТМА также медленно высвобождался в герметичном флаконе, избегая повышения давления, вызванного бурной и быстрой кислотно-щелочной реакцией, и обеспечивая стабильное и точное обнаружение ТМА. Кроме того, инжекция свободного пространства в сочетании с режимами множественного мониторинга реакций (MRM) в ГХ-МС/МС эффективно подавляла матричные химические интерференции и обеспечивала достоверность результатов. Результаты методологической валидации доказали, что линейность, точность испытаний и скорость восстановления усовершенствованного метода обнаружения могут соответствовать требованиям, с хорошей воспроизводимостью и высокой чувствительностью.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

В таблице 1 приведена информация о лекарственных материалах Pheretima, Periplaneta americana и Hirudo. Они были идентифицированы профессором Сюй Жуньчунем из Чэндуского университета традиционной китайской медицины как высушенные тела Pheretima aspergillum (E.Perrier), Periplaneta americana L. и Whitmania pigra Whitman.

1. Извлечение образцов

  1. Измельчите Pheretima, Periplaneta americana и Hirudo с помощью травяной мельницы (см. Таблицу материалов), просейте лекарственный порошок через стандартные лекарственные сита No 2 (отверстие сита: 0,8 мм) и No 4 (отверстие сита: 0,25 мм) и соберите порошок между двумя ситами для получения требуемого образца порошка.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Феретима после измельчения пушистая, поэтому ее порошок не нужно просеивать.
  2. Возьмите 1 г порошка (с точностью до 0,001 г) в пластиковую центрифужную пробирку объемом 50 мл, добавьте 20 мл 5% раствора трихлоруксусной кислоты (ТСА) (см. таблицу материалов) и гомогенизируйте при 1000 rmin-1 в течение 1 мин с помощью высокоскоростного дисперсионного гомогенизатора.
  3. После гомогенизации центрифугу при 1,717 x g в течение 5 мин при комнатной температуре, добавьте немного впитывающей ваты в стеклянную воронку и отфильтруйте надосадочную жидкость в мерную колбу объемом 50 мл.
  4. Повторите описанный выше процесс экстракции дважды с 15 мл и 10 мл 5% раствора ТСА. Соедините фильтрат и разбавьте его до 50 мл 5% раствором ТСА.

2. Приготовление реагента

  1. Приготовьте 20% раствор гидроксида натрия: взвесьте 20 г гидроксида натрия и с помощью деионизированной воды закрепите объем в мерной колбе объемом 100 мл.
  2. Приготовьте 5% раствор ТСА: взвесьте 25 г ТСА и используйте деионизированную воду для фиксации объема в мерной колбе объемом 500 мл.

3. Приготовление стандартного исходного раствора ТМА

  1. Приготовьте стандартный исходный раствор ТМА: взвесьте 0,0162 г стандартного образца гидрохлорида ТМА, растворите его в 5% растворе ТСА и установите объем 100 мл, равный концентрации 100 мкг/мл стандартного исходного раствора ТМА. Хранить при температуре 4 °C.
  2. Приготовьте стандартный раствор ТМА: возьмите определенный объем стандартного исходного раствора ТМА и постепенно разбавьте его 5% раствором ТСА до концентраций 0,1 мкг/мл, 0,5 мкг/мл, 1 мкг/мл, 2 мкг/мл, 5 мкг/мл и 10 мкг/мл стандартного раствора ТМА.

4. Обработка свободного пространства образца

  1. Точно взвесьте 2 мл раствора гидроксида натрия и 0,5 г твердого парафина (температура плавления: 58-60 °C) во флаконе объемом 20 мл (см. Таблицу материалов).
  2. Поместите флакон в духовку при температуре 70 °C примерно на 30 минут. Твердый парафин полностью плавится.
  3. Выньте его, и дайте остыть до комнатной температуры, чтобы парафин затвердел. Затвердевший парафин запечатает гидроксид натрия.
  4. Возьмите 2 мл раствора для экстракции каждого образца и положите его поверх слоя парафина, прижмите крышку и запечатайте.
  5. Поместите герметичный флакон свободного пространства на машину (см. Таблицу материалов) для измерения.

5. Задание условий анализа HS-GC-MS/MS

  1. В таблице 2 приведены условия свободного пространства и условия ГХ-МС.
  2. Информацию об ионах см. в таблице 3 .

6. Стандартный чертеж кривой

  1. Обратитесь к обработке свободного пространства образца на шагах 4.1-4.3, чтобы подготовить флакон с свободным пространством, содержащий щелок и парафиновый герметизирующий слой.
  2. Отсасывайте 2 мл стандартного раствора ТМА 0,1 мкг/мл, 0,5 мкг/мл, 1 мкг/мл, 2 мкг/мл, 5 мкг/мл и 10 мкг/мл стандартного раствора ТМА во флакон объемом 20 мл, закрывайте крышку и измеряйте на аппарате.

7. Прецизионный тест

  1. Обратитесь к обработке свободного пространства образца на шагах 4.1-4.3, чтобы подготовить флакон с щелочью и парафиновым герметизирующим слоем.
  2. Аспирировать 2 мл стандартного раствора ТМА 0,1 мкг/мл в флакон объемом 20 мл и запечатать крышку. Выполните шесть параллельных испытаний в машине в соответствии с инструкциями производителя (см. Таблицу материалов).

8. Эксперимент по оценке скорости восстановления

  1. Возьмите партию Pheretima, Periplaneta americana и Hirudo (S02, S05, S07; Таблица 1) в качестве репрезентативных лекарственных средств для эксперимента по скорости выздоровления.
  2. Возьмите несколько партий образца порошка (S02, S05, S07) и запекайте их в духовке при температуре 50 °C в течение 72 ч до тех пор, пока не будет обнаружено ТМА.
  3. Для определения содержания ТМА в запеченном медицинском порошке обратитесь к методу пробоподготовки в разделах 4-6.
  4. Возьмите 1 г разрыхленного порошка (с точностью до 0,001 г), поместите его в пластиковую центрифужную пробирку объемом 50 мл и добавьте 50 мкл стандартного раствора ТМА.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Концентрация стандартного раствора ТМА составляет 100 мкг/мл, 1000 мкг/мл и 10000 мкг/мл.
  5. Добавьте 20 мл 5% раствора ТСА и гомогенизируйте при 1000 rmin-1 в течение 1 мин.
  6. После гомогенизации центрифугу при 1717 x g в течение 5 мин, добавьте немного впитывающей ваты в стеклянную воронку и отфильтруйте надосадочную жидкость в мерную колбу объемом 50 мл.
  7. Повторите описанный выше процесс экстракции дважды с 15 мл и 10 мл 5% раствора ТСА; соединить фильтрат и разбавить его до 50 мл 5% раствором ТСА.

9. Определение пределов обнаружения (LOD) и количественной оценки (LOQ)

  1. Определите уровень детализации по соответствующей концентрации, когда отношение сигнал/шум (S/N) = 3.
  2. Определите LOQ по соответствующей концентрации, когда S/N = 10.

10. Определение содержания ТМА в образце

  1. Берут около 1 г мелкодисперсного порошка Pheretima, Periplaneta americana и Hirudo соответственно, извлекают пробу по вышеописанной методике и определяют ее на машине.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

Принципиальные схемы принципа предварительной обработки и работы этого протокола приведены на рисунке 1 и рисунке 2 соответственно. Пиковое время ТМА составило 2,3 мин, с острой формой пика и отсутствием помех от других примесей (рис. 3). При измерении линейного диапазона 0,1-10 мкг/мл стандартного раствора ТМА с концентрацией ТМА в качестве абсцисс и площадью пика в качестве ординаты была построена стандартная кривая. Уравнение лин...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

Лекарственные препараты животного происхождения получают из всего организма, органов или тканей, физиологических или патологических продуктов, выделений или выделений, а также продуктов переработки животных. ТМА является важным источником рыбного запаха в лекарствах животного происхождения; это типичное дурнопахнущее вещество с очень низким обонятельным порогом (0,000032 × 10-6 В/В) и сильным рыбным запахом13. В настоящее время широко используемый метод HS-GC-MS не может стабильно и точ...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

Авторам нечего раскрывать.

Благодарности

Эта работа была поддержана грантами Национального фонда естественных наук Китая (82173991) и Сычуаньской научно-технической программы (2022YFS0442).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
ЦентрифугаBeckman Coulter Trading (China) Co.SSC-2-0213
Китайская кофемолка для травяной медициныZhejiang Yongkang Сианьская аппаратно-фармацевтическая фабрикаHX-200K
Конвекционная печьSanyo Electric Co., LtdMOV-112F
Декаппер для алюминиевых колпачков 20 ммANPEL Laboratory Technologies (Shanghai) IncV1750004
Электронные весыShimadzu Corporation Япония
Газовая хроматография масс-спектрометрияShimadzu Corporation ЯпонияTQ-8050 NX NX
Флакон для свободного пространстваANPEL Laboratory Technologies (Shanghai) Inc25760200
гомогенизаторShanghai biaomo FactoryFJ200-SH
Предварительно собранная крышкаANPEL Laboratory Technologies (Shanghai) Inc L4150050
образец ситоZhenxing Sieve Factory/
SH-летучий аминChengdu Meimelte Technology Co., Ltd227-3626-01
Гидроксид натрияChengdu Chron Chemicals Co., Ltd2022101401
Твердый парафин воскШанхайский завод аппаратов Hualing Kangfu20221112
трихлоруксусной кислотойChengdu Chron Chemicals Co., Ltd
Триметиламина гидрохлоридChengdu Aifa Biotechnology Co., LtdAF22022108
Система сверхчистой водыSichuan Youpu Ultrapure Technology Co., LtdUPR-11-5T
AUW220D2022102001

Ссылки

  1. Fan, H., et al. Material basis of stench of animal medicine: a review. China Journal of Chinese Materia Medica. 47 (20), 5452-5459 (2022).
  2. Deng, Y. J., et al. Progress on formation and taste-masking technology of stench of animal medicines. China Journal of Chinese Materia Medica. 45 (10), 2353-2359 (2020).
  3. Casaburi, A., Piombino, P., Nychas, G. J., Villani, F., Ercolini, D. Bacterial populations and the volatilome associated to meat spoilage. Food Microbiology. 45 (Pt A), 83-102 (2015).
  4. Rouger, A., Tresse, O., Zagorec, M. Bacterial contaminants of poultry meat: sources, species, and dynamics. Microorganisms. 5 (3), 50(2017).
  5. Baliño-Zuazo, L., Barranco, A. A novel liquid chromatography-mass spectrometric method for the simultaneous determination of trimethylamine, dimethylamine and methylamine in fishery products. Food Chemistry. 196, 1207-1214 (2016).
  6. Zhao, C., et al. Ultra-efficient trimethylamine gas sensor based on Au nanoparticles sensitized WO3 nanosheets for rapid assessment of seafood freshness. Food Chemistry. 392, 133318(2022).
  7. Bota, G. M., Harrington, P. B. Direct detection of trimethylamine in meat food products using ion mobility spectrometry. Talanta. 68 (3), 629-635 (2006).
  8. Neyer, P., Bernasconi, L., Fuchs, J. A., Allenspach, M. D., Steuer, C. Derivatization-free determination of short-chain volatile amines in human plasma and urine by headspace gas chromatography-mass spectrometry. Journal of Clinical Laboratory Analysis. 34 (2), e23062(2020).
  9. Mitsubayashi, K., et al. Trimethylamine biosensor with flavin-containing monooxygenase type 3 (FMO3) for fish-freshness analysis. Sensors & Actuators B: Chemical. 103 (1-2), 463-467 (2004).
  10. National Health and Family Planning Commission of the People's Republic of China. GB 5009. 179-2016. , 12(2016).
  11. Liu, X. M., et al. Study on material basis and processing principle of fishy smell of Pheretima aspergillum by electronic nose and HS-GC-MS. Chinese Journal of Experimental Traditional Medical Formulae. 26 (12), 154-161 (2020).
  12. Zheng, X., Sun, F., Du, L., Huang, Y., Zhang, Z. Comparison on changes of volatile components in Gecko before and after processing by HS-SPME-GC-MS. Chinese Journal of Experimental Traditional Medical Formulae. 28 (15), 145-152 (2022).
  13. Yoshiharu, I. Odor olfactory measurement. , Japan Association on Odor Environment. Tokyo. (2004).
  14. Jia, Z. W., Mao, B. P., Miao, S., Mao, X. H., Ji, S. Determination of sulfur dioxide residues in sulfur fumigated Chinese herbs with headspace gas chromatography. Acta Pharmaceutica Sinica. 49 (2), 277-281 (2014).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на повторное использование текста или иллюстраций этой статьи JoVE

Запросить разрешение

Исправление


Formal Correction: Erratum: An Improved Technique for Trimethylamine Detection in Animal-Derived Medicine by Headspace Gas Chromatography-Tandem Quadrupole Mass Spectrometry
Posted by JoVE Editors on 11/28/2023. Citeable Link.

An erratum was issued for: An Improved Technique for Trimethylamine Detection in Animal-Derived Medicine by Headspace Gas Chromatography-Tandem Quadrupole Mass Spectrometry. The Authors section was updated from:

Hui Ye1
Xuemei Liu1
Haozhou Huang2
Lin Huang1
Yang Bao1
Hongyan Ma1
Junzhi Lin3
Xiaoming Bao4
Dingkun Zhang1
Runchun Xu1
1State Key Laboratory of Southwestern Chinese Medicine Resources, Pharmacy School, Chengdu University of Traditional Chinese Medicine
2Innovative Institute of Chinese Medicine and Pharmacy, Chengdu University of Traditional Chinese Medicine
3TCM Regulating Metabolic Diseases Key Laboratory of Sichuan Province, Hospital of Chengdu University of Traditional Chinese Medicine
4Shimadzu (China) Co., Ltd

to:

Hui Ye1
Xuemei Liu1
JiaBao Liao2
Haozhou Huang3
Lin Huang1
Yang Bao1
Hongyan Ma1
Junzhi Lin4
Xiaoming Bao5
Dingkun Zhang1
Runchun Xu1
1State Key Laboratory of Southwestern Chinese Medicine Resources, Pharmacy School, Chengdu University of Traditional Chinese Medicine
2China Resources Sanjiu Modern Chinese Medicine Pharmaceutical Co., Ltd
3Innovative Institute of Chinese Medicine and Pharmacy, Chengdu University of Traditional Chinese Medicine
4TCM Regulating Metabolic Diseases Key Laboratory of Sichuan Province, Hospital of Chengdu University of Traditional Chinese Medicine
5Shimadzu (China) Co., Ltd

Теги

Похожие статьи