Метод «доения мозга» для выделения нейральных стволовых клеток и клеток-предшественников олигодендроцитов из живых крыс

Краткое содержание

Здесь в экспериментальных подробностях представлен метод выделения нейральных стволовых клеток и клеток-предшественников олигодендроцитов из мозга живых крыс. Это позволяет многократно собирать эти клетки у одних и тех же животных без ущерба для их самочувствия.

Аннотация

Тканеспецифические нейральные стволовые клетки (НСК) остаются активными в постнатальном мозге млекопитающих. Они обитают в специализированных нишах, где генерируют новые нейроны и глии. Одной из таких ниш является субэпендимальная зона (СЭЗ; также называемая желудочково-субвентрикулярной зоной), которая расположена поперек боковых стенок боковых желудочков, примыкая к эпендимальному клеточному слою. Олигодендроцитарные клетки-предшественники (OPCs) обильно распределены по всей центральной нервной системе, образуя пул пролиферативных клеток-предшественников, которые могут генерировать олигодендроциты.

Как NSC, так и OPC демонстрируют потенциал самообновления и циклы покоя/активации. Благодаря их расположению, выделение и экспериментальное исследование этих клеток проводится посмертно. В этой статье мы подробно опишем «доение мозга» — метод выделения НСК и ОПК, среди прочих клеток, от живых животных. Это двухэтапный протокол, предназначенный для использования на грызунах и протестированный на крысах. Во-первых, клетки «высвобождаются» из ткани с помощью стереотаксической интрацеребровентрикулярной инъекции «коктейль высвобождения». Основными компонентами являются нейраминидаза, которая нацелена на клетки эпендима и индуцирует оголение стенки желудочка, антитело, блокирующее интегрин-β1, и фактор роста фибробластов-2. На втором этапе «сбора» проводится жидкостная биопсия спинномозговой жидкости из большой цистерны у крыс, находящихся под наркозом, без необходимости разреза.

Представленные результаты показывают, что изолированные клетки сохраняют свой эндогенный профиль, а НБК ОЭЗ сохраняют свой покой. Денудация эпендимального слоя ограничена анатомическим уровнем инъекции, и протокол (выпуск и сбор) хорошо переносится животными. Этот новый подход открывает путь для проведения лонгитюдных исследований эндогенного нейрогенеза и глиогенеза у экспериментальных животных.

Введение

Тканеспецифические стволовые клетки представляют собой частично коммитированные клетки, которые могут давать начало всем клеточным популяциям, составляющим соответствующие ткани. Помимо того, что они мультипотентны, они являются самообновляющимися клетками и имеют решающее значение для поддержания гомеостаза и регенеративной способности тканей¹. Некоторые тканеспецифические стволовые клетки остаются в активном, сильно пролиферативном состоянии, например, кишечные или гемопоэтические стволовые клетки. Другие, такие как стволовые клетки головного мозга, остаются в основном в состоянии покоя или в спящем^{состоянии}. В мозге взрослого человека нейральные стволовые клетки (НСК) можно найти в специализированных областях, часто называемых нишами. Две такие хорошо описанные области существуют в субэпендимальной зоне (СЭЗ) боковых желудочков и в зубчатой извилине гиппокампа. Ниша СЭЗ генерирует наибольшее количество клеток, в первую очередь нейробластов, которые мигрируют к обонятельным луковицам и вносят свой вклад в локальную популяцию интернейронов; напротив, сгенерированные олигодендробласты мигрируют в соседнее мозолистое тело (CC)³. Клетки-предшественники олигодендроцитов (OPCs) являются митотически активными клетками, широко распространенными по всей центральной нервной системе, которые: i) связаны с олигодендроглиальной линией, ii) могут мигрировать в участки демиелинизации и iii) могут дифференцироваться в миелинизирующие олигодендроциты. OPC также демонстрируют потенциал самообновления и покоя⁴.

До сих пор выделение и изучение НСК и ОПК требовало посмертной диссоциации рассеченной ткани головного и спинного мозга. Чтобы обойти это экспериментальное ограничение, мы разработали метод, который впервые позволяет изолировать НСК и ОПК мозга от живых животных. Мы называем этот метод «доением», потому что он позволяет собирать несколько клеток, так как их пулы не истощаются. Протокол был разработан на крысах из-за их большого размера мозга, нацеленный в основном на СЭЗ, или КК, и включает в себя два основных этапа. Во-первых, НСК или OPC «удаляются» из тканей путем внутримышечного введения «высвобождающего коктейля», содержащего нейраминидазу, токсин, вызывающий денудацию стенок желудочков, антитело, блокирующее интегрин-β1, и фактор роста фибробластов 2 (FGF2). Коктейль стереотаксически вводится двусторонне в боковые желудочки. Если целью является изоляция НСК, то мишенью являются ростральные участки боковых желудочков. Если цель состоит в том, чтобы изолировать OPC более чисто, коктейль вводят каудально в область фимбрии гиппокампа. На втором этапе «сбора» проводится жидкостная биопсия спинномозговой жидкости (ликвора) из цистерны больших зубов крыс, находящихся под наркозом, без необходимости разреза. Жидкостную биопсию смешивают с питательной средой НСК и могут хранить при температуре 4 °C до нанесения покрытия.

Протокол

Процедуры разведения, содержания и экспериментирования животных проводились в соответствии с Законом Великобритании о животных (научные процедуры) 1986 года, утвержденным Министерством внутренних дел, и в соответствии с Указом Президента Греческой Республики 56/2013, тщательно изученными органами по благополучию животных и этической экспертизе университетов Кембриджа и Патры, а также одобренными и тщательно изученными местным Комитетом префектуры по уходу за животными и их использованию (номер протокола: 5675/39/18-01-2021). Использовались самцы и самки крыс Спрэг-Доули, Вистар и Лонг-Эванс с возрастом от 2 до 4 месяцев и массой тела от 150 г до 250 г. Протокол графически представлен на рисунке 1.

1. Приготовление отпускательного коктейля

ПРИМЕЧАНИЕ: Приготовьте свежее в день процедуры и держите на льду. Количество указано на 2 мкл, вводимых в/в каждый боковой желудочек. Приготовьте дополнительно 1 мкл для каждой предполагаемой инъекции.

1. Приготовьте 0,5 мкл нейраминидазы 500 мЕд из Clostridium perfringens (Clostridium welchii).
   ПРИМЕЧАНИЕ: Храните его в виде массы 1 ед/мкл, разбавленной в стерильной воде при температуре -20 °C. Другие типы нейраминидаз не тестировались.
2. Приготовьте 1 мкл, содержащий 1 мкг интегрин-β1-блокирующих антител.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Храните его при температуре 4 °C.
3. Приготовьте 0,5 мкл, содержащий 0,5 мкг основного фактора роста фибробластов (рекомбинантный человеческий FGF-основной).
   ПРИМЕЧАНИЕ: Храните его в виде бульона 1 мкг/мкл, разбавленного в стерильной воде при температуре -20 °C.

2. Впрыскивание высвобождающего коктейля

ПРИМЕЧАНИЕ: Весь процесс может быть выполнен в течение 20 минут. Позаботьтесь о том, чтобы операция проводилась в асептических условиях. Очистите все поверхности антисептиком (например, 3% или 6% перекисью водорода). Используйте автоклавные или легко стерильные инструменты, перчатки, халаты и простыни.

1. Обезболивайте подопытное животное ингаляцией изофлурана (2,5% для индукции и 2% для поддерживающей). Подтвердите глубину анестезии, проверив роговичный рефлекс, реакцию на раздражители (тест с защемлением задних конечностей и хвоста), режим дыхания.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Хирургические процедуры могут проводиться под общим наркозом, вызванным внутрибрюшинной инъекционной анестезией (например, кетамином [40 мг/кг] и ксилазином [10 мг/кг]). Глубокая анестезия подтверждалась проверкой роговичного рефлекса, реакции на раздражители (щипковая проба задних конечностей и хвоста), режима дыхания.
2. Вводят обезболивающее подкожно (например, 0,3 мг/мл бупренорфина) после введения анестезии.
3. Установите крысу на стереотаксическую раму.
4. Сбрейте шерсть головы бритвой и очистите кожу антисептиком, например, 10% раствором повидон-йода, а затем спиртом. Нанесите антисептик три раза, используя стерильные ватные палочки. Втирать круговыми движениями в течение 3-5 с каждый раз. Наносите мазь для глаз, чтобы предотвратить сухость.
5. Сделайте надрез 2 см на коже головы по средней линии стерильным скальпелем.
6. Тщательно очистите череп с помощью стерильных тампонов и стерильного физиологического раствора.
7. Определите брегму с помощью края иглы шприца Hamilton объемом 10 мкл, установленного на стереотаксическом устройстве. Установите брегму как «точка 0,0».
   ПРИМЕЧАНИЕ: Брегма определяется как точка пересечения сагиттального и коронарного швов. Более подробную информацию можно найти в атласе мозга крыс Paxinos и Watson⁵.
8. Переместите прибор в координаты переднезадний (AP) = 0,3 мм, боковой (L) = +1,2 мм (для наведения на СЭЗ) или AP = 1,5 мм, L = +2,0 мм (для наведения на КК).
9. Просверлите отверстие для заусенцев диаметром 1 мм с помощью стоматологической бормашины.
   ПРИМЕЧАНИЕ: При сверлении вручную следите за тем, чтобы не повредить кортикальную поверхность. Ожидается, что кровоизлияние не будет значительным. Очистите кровь физиологическим раствором и надавите на него, чтобы остановить более стойкое кровотечение.
10. Загрузите 4 мкл выпускающего коктейля в шприц Hamilton объемом 10 мкл.
11. Опустите иглу (желательно тупой или конический край) шприца Hamilton так, чтобы она соприкоснулась с твердой мозговой оболочкой.
12. Введите иглу на нужную глубину (D = 3,5 мм).
    ПРИМЕЧАНИЕ: Налейте физиологический раствор на поверхность твердой мозговой оболочки, чтобы сохранить ткань увлажненной.
13. Влить 2 мкл разделительного коктейля со скоростью 1 мкл/мин.
14. Оставьте иглу на месте еще на 2 минуты, прежде чем медленно извлекать, чтобы избежать всплытия коктейль для высвобождения.
15. Повторите шаги 2.8-2.14 для другого полушария в координатах AP = 0.3 мм, L = -1.2 мм (для наведения на СЭЗ) или AP = 1.5 мм, L = -2.0 мм (для нацеливания на КК).
16. Зашить разрез капроном 5-0 (диаметр 0,1 мм) и обработать зашитый участок антисептиком.
17. Снимите маску, подающую анестетик, и перенесите животное в зону послеоперационного мониторинга.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Восстановление после анестезии и поддержание лежачего положения должно происходить в течение 5-10 минут, а полное восстановление (нормальное поведение) в течение 25 минут.
    1. Внимательно следите за выздоровлением (живое и беспрерывное движение, частый доступ к воде) в хорошо отапливаемом (24-25 °С), тихом месте без подстилки с мелкими частицами, которые могут закупорить дыхательные пути. Возвращайте животное в компанию его соседей по клетке (не новым животным) только после подтверждения полного выздоровления.
    2. Наблюдайте за животным в пункте технического обслуживания в течение не менее 48 часов после операции. Устраните признаки боли (скрытие головы, ненормальное положение головы или тела, гиперчувствительность и повышенная возбудимость к обращению) путем введения анальгезии (например, 0,3 мг/мл бупренорфина, подкожно). Направляйте животных с обесцвеченной или встающей шерстью к ветеринарному врачу.

3. Жидкостная биопсия спинномозговой жидкости (ликвора)

ПРИМЕЧАНИЕ: Весь процесс может быть выполнен в течение 10 минут. Жидкостная биопсия, описанная здесь, проводится через 3 дня после инъекции коктейля, но при необходимости может быть выполнена точно таким же образом. Позаботьтесь о том, чтобы операция проводилась в асептических условиях. Очистите все поверхности антисептиком (например, 3% или 6% перекисью водорода). Используйте автоклавные или легко стерильные инструменты, перчатки, халаты и простыни.

1. Обезболивайте животное ингаляцией изофлурана (2,5% для индукции и 2% для поддерживающей). Подтвердите глубину анестезии, проверив роговицу
   рефлекс, реакция на раздражители (защемление задних конечностей и хвоста), режим дыхания.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Хирургические процедуры могут проводиться под общим наркозом, вызванным внутрибрюшинной инъекционной анестезией (например, кетамином [40 мг/кг] и ксилазином [10 мг/кг]). Однако это не рекомендуется, так как процедура короткая, особенно если биопсия будет проводиться несколько раз подряд.
2. Вводят обезболивающее подкожно (например, 0,3 мг/мл бупренорфина) после введения анестезии.
3. Установите подопытное животное на стереотаксическую раму. Используйте ушные планки, чтобы зафиксировать голову, не препятствуя вращательному движению вперед и назад.
4. Стабилизируйте голову под углом 40° вниз, чтобы можно было добиться хорошего разгибания задней части шеи.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Одним из способов сделать это является использование ротовой планки устройства⁶.
5. Сбрейте шерсть в области шеи с помощью бритвы и очистите кожу антисептиком, например, 10% раствором повидон-йода, а затем спиртом. Нанесите антисептик три раза, используя стерильные ватные палочки. Втирать круговыми движениями в течение 3-5 с каждый раз.
6. Кончиком пальца найдите ромбовидную угнетающую область, расположенную между затылочным выступом и позвоночником атланта⁶.
7. Нарисуйте точку-метку (например, с помощью маркера).
8. Закрепите шприц объемом 1 мл или 0,5 мл на стереотаксической рамке.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Рекомендуется использовать шприцы с несъемными иглами, так как они обеспечивают лучшее всасывание и имеют меньший мертвый объем.
9. Поднесите иглу к месту соприкосновения с кожей в точку-метку.
10. Щипцами приподнимите кожу, опуская шприц через слои кожи.
11. Слегка потяните поршень, чтобы создать отрицательное давление в шприце.
12. Снова начните очень медленно погружать иглу до тех пор, пока в шприце не появится жидкость (ликвор).
13. Установите иглу в этом положении и позвольте медленному оттоку спинномозговой жидкости.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Игла может быть немного опущена или приподнята, если поток спинномозговой жидкости очень медленный.
14. Начните медленно (с шагом 40 мкл/мин) удалять ликвор до 120 мкл.
15. Медленно извлеките шприц.
16. Внутрибрюшинно вводят 1 мл нормальной сыворотки для поддержки восполнения жидкости экспериментальным животным.
17. Жидкостную биопсию (СМЖ) смешать с 400 мкл среды НСК и держать микроцентрифужную пробирку при температуре 4 °C до дальнейшего использования.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Жидкостная биопсия должна быть обработана в течение 3 часов, если она не заморожена.
18. Снимите маску, в которую подается анестетик, и перенесите животное в зону послеоперационного мониторинга.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Восстановление после анестезии и поддержание лежачего положения должно происходить в течение 5-10 минут, а полное восстановление (нормальное поведение) в течение 25 минут.
    1. Внимательно следите за выздоровлением (живое и беспрерывное движение, частый доступ к воде) в хорошо отапливаемом (24-25 °С), тихом месте без подстилки с мелкими частицами, которые могут закупорить дыхательные пути. Возвращайте животное в компанию его соседей по клетке (не новым животным) только после того, как будет подтверждено полное выздоровление.
    2. Наблюдайте за животным в пункте технического обслуживания в течение не менее 48 часов после операции. Если наблюдаются признаки боли (скрытие головы, ненормальное положение головы или тела, гиперчувствительность и повышенная возбудимость к обращению), следует ввести обезболивание (например, 0,3 мг/мл бупренорфина подкожно). Направляйте животных с обесцвеченной или встающей шерстью к ветеринарному врачу.

4. Обработка тканей для иммунофлюоресценции

1. Усыпляют животное интракардиальной инфузией 20 мл ледяного физиологического раствора с последующим введением 50 мл ледяного 4% параформальдегида (PFA; в фосфатно-солевом буфере [PBS] pH = 7,4).
2. Рассечение мозговой ткани.
   1. Отделите голову от туловища с помощью ножниц, чтобы сделать надрез в шейной области. С помощью ножниц снимите кожу, а затем разрежьте кость черепа по сагиттальной средней линии, при этом кончики ножниц направлены вверх, чтобы не повредить ткани мозга. Стремитесь продолжать резать как можно больше, проходя корональную срединную линию.
   2. Используйте щипцы для удаления костей, начиная с надзатылочной и теменной костей и, наконец, лобных костей.
   3. Как только мозговая ткань будет обнажена, используйте щипцы или шпатель, чтобы извлечь ее из черепа. Чтобы облегчить это, перережьте нервы у основания мозга и обонятельные луковицы, если это нежелательно.
3. После фиксации ткани на ночь в 2% PFA при температуре 4 °C.
4. Криозащитите ткань в 30% сахарозе (в PBS) в течение не менее 48 ч при 4 °C, пока ткань не опустится на дно.
5. Заморозьте ткань при температуре -80 °C.
6. Разрежьте ткань мозга на корональные срезы толщиной 14 мкм с помощью криостата.
7. Выполняют иммунофлуоресцентное окрашивание по стандартным протоколам ^3,7
   1. Инкубируют срезы с блокирующим буфером (3% бычий сывороточный альбумин [BSA], 0,1% Triton X-100, в PBS) в течение 2 ч при комнатной температуре.
   2. Проводят забор антигена (кипячение в течение 15 мин в цитратном буфере 10 мМ, рН = 6,0, используя стеклянные банки).
      ПРИМЕЧАНИЕ: Этот шаг необязателен, но необходим для ядерных антигенов.
   3. Довести до комнатной температуры и инкубировать с первичными антителами против глиального фибриллярнокислого белка (GFAP), двойного кортина (Dcx), S100β и β-катенина (см. таблицу материалов) в блокирующем буфере в течение ночи при 4 °C.
   4. Инкубируют в течение 2 ч со вторичными антителами в PBS с 4',6-диамидино-2-фенилиндолом (DAPI) для ядерного противоокрашивания при комнатной температуре (см. таблицу материалов).
   5. Установите покровные стекла.

5. Обработка изолированных клеток для иммунофлюоресценции

1. Поместите клетки в 96-луночные планшеты, совместимые с микроскопией, покрытые поли-D-лизином (100 мкг/мл).
2. Зафиксируйте клетки в ледяной 2% PFA в течение 10 минут и промойте 3 раза PBS.
3. Проводят иммунофлюоресценцию по стандартным методикам^3,7 для PDGFRα, GFAP, Dcx^, SOX2 и ID3 (см. таблицу материалов).
4. Хранят ячейки в PBS + NaN₃ (0,1%) при температуре 4 °C в темноте.

6. Микроскопия и анализ изображений

1. Делайте снимки с помощью эпифлуоресценции или конфокальной микроскопии и выполняйте подсчет клеток с помощью стандартных программных инструментов анализа изображений, таких как счетчики клеток.

Результаты

Выпуск и сбор НБК
НСК ОЭЗ отделены от ликвора только монослоем эпендимальных клеток, хотя и остаются в непосредственном контакте с желудочковым содержимым посредством интеркалирующих монореснитчатых отростков ^8,9. Нейраминидаза действует специфически на эпендимальные клетки путем расщепления остатков сиаловой кислоты и может индуцировать оголение стенки желудочка. Это приводит к скоплению нейробластов на поверхности желудочка^10,11. Кроме того, поток нейробластов наблюдался в ликворе после внутримышечного введения интегрин-β1-блокирующего антитела, вероятно, из-за ослабления межэпендимальных клеточных соединений¹². Эти наблюдения привели к разработке протокола, который позволяет изолировать стволовые клетки и клетки-предшественники головного мозга путем контролируемого нарушения целостности стенок бокового желудочка. На первом этапе высвобождение из паренхимы и последующий поток НСК или ОПК внутри ликвора индуцируются путем внутримышечного введения высвобождающего коктейля. Коктейль вводится стереотаксически со скоростью 1 мкл/мин, двусторонне (2 мкл на инъекцию) в боковые желудочки (координаты для НБК ОЭЗ: AP = 0,3 мм, L = ± 1,2 мм, D = 3,5 мм; координаты для КК OPC: AP = 1,5 мм, L = ± 2 мм, D = 3,5 мм). Второй («сбор») этап включает в себя проведение жидкостной биопсии ликвора из cisterna magna. Крысы должны быть обезболины, а биопсия может быть проведена шприцами объемом 1 мл. Использование стереотаксического устройства позволяет практически полностью получить около 100 мкл ликвора без необходимости разрезов. Жидкостную биопсию добавляют в ледяную питательную среду и хранят при 4 °C до нанесения покрытия в течение <3 ч (питательная среда NSC содержит модифицированную среду Eagle [DMEM] компании Dulbecco, добавку B27 [2%], добавку N2 [1%], FGF2 [20 нг/мл] и эпидермальный фактор роста [EGF; 20 нг/мл]).

Гистологическая оценка перивентрикулярной области после введения релиз-коктейля
Первая когорта экспериментов показала, что при введении более 3 мкл жидкости желудочки могут быть повреждены из-за неспецифического механического повреждения (рис. 2B, C). Медленное введение 2 мкл релиз-коктейля приводило к возникновению кластеров Dcx-иммунопозитивных нейробластов на поверхности желудочков. Эти кластеры оставались видимыми даже через 8 месяцев после инъекции (рис. 2D). Поскольку метод предназначался для лонгитюдных исследований, нацеленных на длительное наблюдение за животными, оценивали повреждение тканей, вызванное коктейлем высвобождения. Иммуноокрашивание проводили на криостатных срезах мозга толщиной 14 мкм для выявления маркеров эпендимальных клеток, таких как S100β и β-катенин¹³, и оценивали общую целостность эпендимального слоя. Участки денудации эпендимального слоя присутствовали только близко к рострокаудальному уровню инъекций, с постепенным снижением возмущений эпендимального слоя, выявленных в более задних и более передних областях СЭЗ (рис. 2E, F) и отсутствовавших после расстояния ±2 мм от места инъекции. Вышеупомянутые результаты показывают, что частичная денудация эпендимального слоя, вызванная внутримышечным введением высвобождающего коктейля, является очаговой, сдерживается в непосредственной близости от места инъекции и оставляет остальную часть перивентрикулярного эпендимального слоя нетронутой.

Маркерный профиль и поведение in vitro собранных клеток
В дальнейшем оценивали поведение in vitro и маркерный профиль клеток, выделенных по протоколу доения. Средний выход клеток при каждой жидкой биопсии составляет примерно 300 ± 45 клеток (на одну биопсию 100 мкл)⁷. Биопсия доения привела к посевам НСК в среднем с потенциалом пассажа 3,17 ± 0,45. Клетки, выделенные от крыс, которым вводили физиологический раствор, можно было пассировать в среднем 1,92 ± 0,76 раза; напротив, те, кто был изолирован с помощью доения, достигли даже девяти пассажей (p = 0,038, t-критерий) (рис. 3A)⁷. Средняя пропускная способность стандартных посмертных культур нейросферы, полученных из СЭЗ, превышает 12 пассажей в наших руках. Поскольку потенциал расширения НСК ОЭЗ in vivo, как показали эксперименты по картированию клеточной судьбы in vivo ¹⁴, был ограничен, при доении образуются клетки со значительно отличным поведением in vitro, чем клетки в стандартных культурах, хотя и гораздо более близкими к поведению эндогенных НСК. Собранные клетки помещали на лунки, покрытые поли-D-лизином, где они росли как в виде адгезивных монослоев, реже в виде нейросфер (рис. 3Б). Свежевыделенные клетки (собранные через 3 дня после инъекции и зафиксированные через 24 ч после нанесения пластины), которые были иммунопозитивны для астроглиального маркера GFAP, также были иммунопозитивны для ID3, маркера покоя, и имели характерную для биполярной морфологии NSC (рис. 3C). Более того, как сообщалось ранее⁷, более детальное иммуноцитохимическое сравнение клеток, полученных из биопсии, и клеток, полученных из посмертного периода, от тех же животных, через 3 дня после инъекции (в поисках астроцитов GFAP+, нейробластов Dcx+, предшественников олигодендроцитов PDGFRa+ и клеток SOX2+ нейронной линии) показало, что профиль собранных клеток был сходен с профилем эндогенных клеток СЭЗ (рис. 3D). Примечательно, что при сравнении биопсийных и тканевых клеток в различных условиях (например, при введении высвобождательного коктейля с FGF2 и без него) было обнаружено, что фактор роста приводил к сопутствующему и значимому увеличению присутствия клеток SOX2+, а также к значительному снижению присутствия нейробластов Dcx+ в обоих образцах (рис. 3D). Эти данные подтвердили, что любые изменения, появляющиеся в профиле эндогенных популяций НСК, отражаются в образцах клеток, полученных при доении.

Рисунок 1: Графическая сводка доения. Корональный срез одного полушария головного мозга с основными анатомическими ориентирами (латеральный желудочек, вышележащее мозолистое тело и передняя комиссура снизу [тракты белого вещества выделены серым цветом] и субэпендимальная зона у боковых стенок [синим цветом]). Коктейль вводится в боковой желудочек, что приводит к нарушению целостности ткани и высвобождению постнатальных нейральных стволовых клеток головного мозга в спинномозговую жидкость, из которой они могут быть собраны с помощью жидкостной биопсии. Сокращения: СЭЗ = субэпендимальная зона; ЛЖ = боковой желудочек; спинномозговая жидкость = спинномозговая жидкость; pbNSCs = постнатальные нейральные стволовые клетки головного мозга; β1-int = бета1-интегрин. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этого рисунка.

Рисунок 2: Гистологическая оценка эффектов внутримышечных инъекций. (A-D) Изображения дорсальной половины бокового желудочка после иммуноокрашивания на Dcx (красным цветом, для обозначения нейробластов). (А) Простое внутривенное введение шприца Гамильтона не нарушает цитоархитектуру СЭЗ, в то время как внутримышечное введение 10 мл (скорость инфузии 1 мл/мин) приводит к тяжелому повреждению стенки желудочка независимо от ее содержимого. (Б) Физраствор и (В) коктейль для высвобождения. (D) Введение 2 мкл релиз-коктейля приводит к контролируемой компрометации стенки желудочка, наблюдаемой даже через 8 месяцев после операции. Детализация стенки ОЭЗ с большим увеличением на 7 и 14 сутки после инъекции показана на рисунках (E) и (F) соответственно. Существует дезорганизованная структура, в которой нейробласты Dcx+ (зеленого цвета) покоятся на поверхности стенки, а другие клетки ниши (Sox2+, белый цвет) покоятся глубже. Перивентрикулярная ткань повреждается на рострокаудальном уровне инъекции через 2 месяца (в G), в то время как ткань неповреждена на более каудальном уровне (в H) у того же животного. Стенку желудочка оценивают методом иммуноокрашивания на эпендимальные маркеры S100β и β-катенин. Деталь типичной архитектуры стены показана на рисунке (I). Ядерное окрашивание выполняется с помощью DAPI (показано синим цветом). Масштабные линейки = 300 мкм (A-C, G, H, вставки), 150 мкм (D), 30 мкм (E, F) и 50 мкм (I). Эта цифра видоизменена из McClenahan et ^al.13. Сокращения: СЭЗ = субэпендимальная зона; i.c.v = внутримозговерный; Dcx = даблкортин; DAPI = 4',6-диамидино-2-фенилиндол. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этого рисунка.

Рисунок 3: Оценка клеток, выделенных при доении. (A) График, показывающий максимальное количество пассажей, полученных на один образец жидкой биопсии от животных, которым вводили физиологический раствор (серые полосы, всего 12 образцов) или после доения (черные полосы, всего 29 образцов, коктейль из нейраминидазы и антител, блокирующих интегрин-β1). (B) Репрезентативное конфокальное микроскопическое изображение первичных клеток, полученных в результате доения, через 3 дня после инъекции, иммуноокрашенных против GFAP и ID3. (С,Д) Светлопольные изображения клеток, выделенных через 3 дня после инъекции, нанесены на лунки, покрытые поли-D-лизином, и оставлены для роста в среде пролиферации НБК в течение 7 дней. (E) График, показывающий клеточный профиль клеток, выделенных в результате доения ОЭЗ, и эндогенной популяции НБК ОЭЗ от одних и тех же экспериментальных животных. Фракции SOX2+ и Dcx+ значительно увеличивались и уменьшались, соответственно, после совместного введения FGF2. (Односторонний анализ ANOVA для каждого маркера с последующим анализом post hoc; n = 4-6 животных в экспериментальной группе.) Масштабные линейки = 100 мкм (C,D) и 10 мкм (B). Эта цифра видоизменена из McClenahan et ^al.13. Сокращения: СЭЗ = субэпендимальная зона; DPI = дни после инъекции; NSC = нейральные стволовые клетки; Dcx = даблкортин; GFAP = глиальный фибриллярный кислый белок. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этого рисунка.

Обсуждение

Стволовые клетки и клетки-предшественники относительно редки в тканях мозга млекопитающих. Кроме того, НСК располагаются в местах, недоступных для легкой и безопасной биопсии (стенки желудочков, гиппокамп). Поэтому единственным способом экспериментальной работы с такими клетками до сих пор была их посмертная изоляция. Метод, позволяющий однократно или многократно собирать НСК и ОПК у живых крыс, называемый доением, описан здесь шаг за шагом. Метод основан на двух ключевых особенностях: i) НСК или ОПК отделены монослоем эпендимальных клеток от ликвора, протекающего в желудочковой системе головного мозга; ii) эпендимальные клетки и нейральные предшественники сохраняют контакт между собой и с другими соседними типами клеток через интегрины. Таким образом, коктейль высвобождения, вводимый в определенные области желудочков, чтобы обеспечить отделение НСК, или OPC, от паренхимы головного мозга, содержит нейраминидазу, токсин, который специфически нацелен на эпендимальные клетки^10,11 и убивает их, и антитела^, блокирующие интегрин-β1. Он также содержит FGF2, так как этот фактор роста необходим для выживания и поддержания НСК в нише и в культуре^15,16. Ранее^{было показано,} что этот протокол хорошо переносится животными; В этом отчете также подтверждается, что повреждение эпендимальных клеток, индуцированное коктейлем высвобождения в качестве предпосылки для высвобождения NSC/OPC в ликворе, ограничено вокруг рострокаудального уровня инъекции. Это имеет ключевое значение, поскольку протокол должен сохранять гомеостатическую функцию мозга, включая саму нишу стволовых клеток, и не должен ставить под угрозу долгосрочное благополучие животных. Стереотаксическая инъекция высвобождающего коктейля имеет легкую степень тяжести и никогда не приводила к летальному исходу. Кроме того, проведение жидкостной биопсии из cisterna magna является быстрой и минимально инвазивной процедурой, которую можно повторять несколько раз подряд.

Важно отметить, что образцы НБК, выделенные при доении, точно отражают эндогенный пул НСК. На профиль предшественников ОЭЗ может влиять внутримышечная инъекция FGF2. Когда это происходит, профиль клеток, полученных в результате доения, изменяется таким же образом. Более того, предыдущая экспериментальная работа показала, что НСК, выделенные в результате доения в ОЭЗ, имеют ограниченный потенциал самообновления, поведение, сходное с поведением эндогенных НСК, выявленное при использовании стратегий in vivo, трансгенных, клеточной судьбы^14,17. Постнатальные НСК головного мозга сохраняются в состоянии покоя, редко переходя в сторону митотической активации с образованием нейрогенного и глиогенного потомства^18,19,20. В данной работе приводятся доказательства того, что доля клеток, полученных от доения, которые экспрессируют GFAP и, как ожидается, включает в себя добросовестные НСК, коэкспрессируют ID3, маркер покоящихся НСК²¹. Обогащенное присутствие покоящихся НСК, которые затем помещаются в среду НСК, обычно используемую для культивирования НСК, изолированных посмертно, по-видимому, ограничивает потенциал экспансии собранных НСК (например, процесс, имеющий решающее значение для использования клеток для аутологичной трансплантации). Это связано с тем, что эти среды разработаны специально для выживания и митотического расширения активированных НСК; Таким образом, создание протоколов, обеспечивающих эффективную и быструю митотическую активацию покоящихся НСК, увеличит ценность и сферу использования доения.

В целом, эти данные указывают на то, что доение позволяет отбирать у живых крыс постнатальные НСК и ОПК головного мозга (в зависимости от рострокаудального уровня введения коктейля высвобождения). Эта работа указывает на целесообразность проведения последовательных жидкостных биопсий у одного и того же животного, даже через значительные промежутки времени после введения высвобождательного коктейля (таким образом, для планирования и проведения лонгитюдных экспериментальных исследований), поскольку нейробласты остаются сгруппированными на стенках желудочков даже через 8 месяцев после инъекции. Такие методы имеют решающее значение, поскольку они позволяют исследовать события, происходящие внутри отдельных животных, что приводит к уменьшению биологического шума, порождаемого физиологическими изменениями. Это, в свою очередь, приводит к повышению точности и реализации принципов «3R» (замена, сокращение и уточнение). Будущими ключевыми шагами по совершенствованию метода будут определение максимального количества и временных рамок, в течение которых жидкостная биопсия может быть выполнена после одной процедуры высвобождения, хотя выполнение дополнительных процедур высвобождения должно быть осуществимым, если это необходимо.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье

Имя	Компания	Каталожный номер	Комментарии
<коктейль с сильным>релизом
β 1-интегрин-блокирующее антитело	BD Biosciences	#555002	очищенное NA/LE Hamster Anti-Rat CD29 Clone Ha2/5, 1 мг/мл. Любая активность блокировки должна быть уместной.
Нейраминидаза из Clostridium perfringens (Clostridium welchii)	Sigma-Aldrich	#N2876	нейраминидазы из других источников (например, из Vibrio cholerae) не были исследованы.
Рекомбинантный человеческий FGF-basic (154 а.а.)	Peprotech	#100-18B	хранится как 1 μ g/μ Л бульона, разведенного в стерильной воде при -20°Г; C
<стронг>Хирургические процедуры
10 и микро; L Шприц	Hamilton	#80330	Model 701 RN, маленькая съемная игла, калибр 26s, 2 дюйма, тип точки 2
BD Micro-fine 1 мл инсулиновые шприцы	BD biosciences	04085-00	29 г x 12,7 мм
BETADINE CUT. SOL 10% FLx30ML	LAVIPHARM-CASTALIA	АРТИКУЛ:
Bupaq	RICHTERPHARMA	1021854AF	10 мл (бупренофин 0,3 мг/мл)
Digital New Standard Stereotaxic, Rat and Mouse	Stoelting	51500D
Гомеотермическая система мониторинга	Harvard Apparatus	55-7020
ISOFLURIN 1,000 мг/г для ингаляций, жидкость	Vetpharma Animal Health	32509/4031
Кетамидор	RICHTER PHARMA	АРТИКУЛ:	Кетамин 100 мг/мл
Нейлоновый шовный материал, Ethilon	Ethicon	D9635	Прозрачный, размер 5-0
Аккумуляторные аккумуляторные хирургические триммеры	Toelting	Item:51472
Лезвия скальпеля, стерильные	Swann Morton	AW050
Scopettes Jr.  8-дюймовые тампоны	Birchwood Laboratories	34-7021-12P
Стереотаксическая высокоскоростная дрель	Foredom	1474w/o1464
Stoelting' s Набор стереотаксических инструментов	Stoelting	Item: 52189
Xylan 2%	Chanelle Pharmaceuticals	13764/03/19-5-2004	Ксилазин, 25 мл
обработка тканей и клеток и иммуноокрашивание
96-луночные планшеты подходят для микроскопии	Greiner	#655866	Screen star microplate
B27 добавка	ThermoFisher Scientific	A1486701
Сывороточный альбумин крупного рогатого скота (БСА)	Merck	P06-1391100	Фракция V, тепловой шок
Цитрат Цитрат	натрия		одноосновной
Криостат	Leica	CM1510S
DAPI	Merck, Calbiochem	28718-90-3	Ядерное окрашивание, разведение: 1/1,000
DMEM	ThermoFisher Научное	11995065	Высокий уровень глюкозы, пируват
ослик против коз	Biotium	20016 или 20106 или 20048	Разведение: 1/1,000
осла против мышей	Biotium	20014 или 20105 или 20046	Разведение: 1/1,000
осла анти-кролика	Biotium	20015 или 20098 или 20047	Разведение: 1/1,000
EGF	Peprotech	315-09
FGF-2 (или bFGF)	Peprotech	100-18B
козий анти-GFAP	Abcam	ab53554	Разведение: 1/500
козы анти-SOX2	Santa Cruz Biotecnology	sc-17320	Разведение: 1/200
мышиный анти-ID3	Santa Cruz Biotecnology	sc-56712	Разведение: 1/200
мышиный анти-S100&бета;	Sigma	S2532	Разведение: 1/200
Mowiol	Merck, Calbiochem	475904	Монтажная среда
N2 добавка	ThermoFisher Scientific	17502048
парафолмадегид	Merck	158127
поли-D-лизин	Merck, раствор миллипоры	A-003-E	, 1,0 мг/мл
кролика анти-даблкортин (DCX)	Abcam	ab18723	Разведение: 1/500
кролика анти-PDGFR&альфа;	Abcam	ab51875	Разведение: 1/200
кроличий анти-&бета;- катенин	Abcam	ab16051	Разведение: 1/500
Triton X-100	Merck	X100
><сильная микроскопия и анализ изображений
конфокальный микроскоп	Leica	SP6 и SP8
Анализ изображений	NIH, США	ImageJ
Анализ изображений	Leica	LasX