Здесь описан простой и быстрый подход к выполнению внутримозговых инъекций мышам с использованием свободного доступа (то есть без стереотаксического устройства).
Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.
Методическая статья
Внутримозговые инъекции в свободную руку у мышей
В этой статье
Краткое содержание
Аннотация
Исследование нейроэндокринной системы часто требует доставки лекарств, вирусов или других экспериментальных агентов непосредственно в мозг мышей. Внутримозговая инъекция (ИЦВ) позволяет широко распространять экспериментальный агент по всему мозгу (особенно в структурах вблизи желудочков). В данной статье описаны методы проведения инъекций ICV в свободной руке у взрослых мышей. Используя визуальные и тактильные ориентиры на головах мышей, инъекции в боковые желудочки можно делать быстро и надежно. Инъекции делаются стеклянным шприцем, который экспериментатор держит в руке и размещает на приблизительном расстоянии от ориентиров. Таким образом, данная методика не требует стереотаксического кадра. Кроме того, этот метод требует только кратковременной анестезии изофлураном, что позволяет впоследствии оценить поведение и/или физиологию мышей у бодрствующих, свободно ведущих себя мышей. Инъекция ICV в свободную руку является мощным инструментом для эффективной доставки экспериментальных агентов в мозг живых мышей и может сочетаться с другими методами, такими как частый забор крови, манипуляции с нейронными цепями или запись in vivo для исследования нейроэндокринных процессов.
Введение
Доставка экспериментальных агентов, таких как лекарства1, вирусы2 или клетки3, в мозг часто необходима для нейроэндокринных исследований. Если агент не может легко проникнуть через гематоэнцефалический барьер или цель эксперимента состоит в том, чтобы специально проверить центральные эффекты препарата, важно иметь надежный метод доставки инъекций в мозг. Кроме того, инъекция в внутримозговое (ВЦВ) пространство дает возможность широко распределить агент в головном мозге и обеспечивает большую целевую область, тем самым повышая вероятность успешной инъекции2.
Распространенный метод проведения инъекций ICV включает в себя установку постоянной внутренней канюли. При таком подходе стереотаксическая рама необходима для позиционирования имеющейся в продаже или изготовленной на заказ канюли, так как канюля приклеена или зацементирована на месте. Часто при выздоровлении через канюлю вводят супрафизиологическую дозу ангиотензина II, и если сразу наблюдается питьевое поведение, то канюля считается правильно поставленной4. Такой подход имеет множество преимуществ, в том числе возможность проведения длительной инфузии и возможность многократного введения одному и тому же животному; Кроме того, если используется ангиотензин II, правильное размещение может быть подтверждено до введения экспериментальных соединений. Тем не менее, существуют некоторые ограничения для установки постоянной канюли, в том числе необходимость дорогостоящего оборудования (стереотаксическая рама), возможность повреждения канюли после установки (например, мыши могут жевать канюлю соседа по клетке) и возможность инфекций вокруг постоянной канюли. Однократные инъекции ICV могут быть сделаны с использованием стереотаксического фрейма3, который, хотя и эффективен, требует значительного воздействия анестезии и, таким образом, может скрывать некоторые острые физиологические и поведенческие эффекты лечения. Кроме того, помещение мышей в стереотаксическую рамку требует существенной подготовки для достижения стабильного положения и предотвращения разрыва слуховых проходов.
Здесь описан устоявшийся метод проведения инъекций свободной рукой у мышей. Этот метод основан на предыдущих отчетах 5,6. Преимущества этой методики в том, что она проста, быстра и не требует специализированного оборудования, такого как стереотаксическая рамка. Как описано ниже, эта процедура включает в себя манипуляции со стеклянным шприцем относительно ориентиров на голове мыши для выполнения инъекций, которые могут быть сделаны быстро и, таким образом, требуют всего нескольких минут газовой анестезии в день эксперимента.
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Протокол
Все процедуры были одобрены Университетом штата Колорадо (#3960) и Комитетами по институциональному уходу за животными и использованию животных Калифорнийского университета в Сан-Диего, где были собраны репрезентативные данные (S13235, PI Kellie Breen Church). Данные пяти взрослых самок и двух взрослых самцов мышей C57/BL6 (в возрасте 9-16 недель) представлены в разделе репрезентативных данных. Самкам мышей проводили овариоэктомию за 3-4 недели до инъекции ICV и забора крови, как описано ранее7. До эксперимента эти мыши содержались с циклом 12 часов света и 12 часов темного света и имели свободный доступ к корму и воде в соответствии с Руководством по уходу за лабораторными животными и их использованию.
1. Выполнение трепанации черепа
ПРИМЕЧАНИЕ: Трепанация черепа может быть выполнена за один или несколько дней до фактической инъекции, что ускоряет процесс инъекции в день эксперимента.
- Подготовьте материалы для трепанации черепа, как описано ниже.
- Положите на рабочую поверхность чистую накладку или драпировочный материал. Прикрепите носовой обтекатель испарителя изофлурана к рабочей поверхности (близко к экспериментатору, но в противоположную сторону; см. рисунок 1А).
- Наденьте силастическую трубку на конец стерильной острой иглы 18 G так, чтобы ~1 мм кончика иглы выступало. Поместите силастическую трубку на конец стерильной тупой иглы так, чтобы ~1 мм кончика иглы выступало.
ПРИМЕЧАНИЕ: Для каждой мыши следует использовать отдельные стерильные предварительно упакованные иглы (острые и тупые). - Подготовьте электробритву, йодный скраб, стерильную марлю и спиртовые салфетки для подготовки места инъекции.
- Потренируйтесь перемещать иглу на 2 мм вбок и на 1 мм в хвост, как описано ниже.
- С помощью линейки и ручки отметьте на листе бумаги начальную точку (это будет брегма), отметку в 2 мм слева или справа и еще одну отметку на 1 мм выше последней (это будет место инъекции; см. рисунок 1Б).
- Потренируйтесь перемещать иглу от начальной точки к отметке 1 к отметке 2 (брегма к месту инъекции) до тех пор, пока не убедитесь, что движение повторяется без направляющих.
ПРИМЕЧАНИЕ: Координаты, описанные здесь, эффективны для взрослых мышей C57/BL6, но другие штаммы или возрастные группы могут потребовать корректировки.
- Подготовьте мышь к трепанации черепа, как описано ниже.
- Поместите мышь в индукционную камеру и обезболите мышь 3%-4% изофлураном в медицинском кислороде. С практикой и знакомством с процедурой сократите общую продолжительность воздействия изофлурана до менее чем 10 минут для процедуры трепанации черепа.
ВНИМАНИЕ: Воздействие изофлурана опасно для здоровья человека; Используйте одобренный и проверенный испаритель изофлурана в хорошо проветриваемом помещении со средствами очистки отходящих газов. - Как только рефлекс на пальцах ног отсутствует, побрейте голову животного. Нанесите смазку для глаз.
- Поместите мышь на рабочую поверхность головой в носовой конус для поддержания анестезии.
- Вводите обезболивающее средство, такое как бупренорфин (0,6-0,8 мг/кг массы тела мыши, подкожно), в соответствии с указаниями врача.
- Очистите место укола, протерев голову стерильной марлей, смоченной в растворе йода (выполните три скраба), а затем протрите спиртовой салфеткой (выполните трижды).
ПРИМЕЧАНИЕ: Удалите шерсть и очистите кожу вокруг места инъекции и используйте стерильные инструменты и иглы, как рекомендовано Американской ветеринарной медицинской ассоциацией для предотвращения инфекций.
- Поместите мышь в индукционную камеру и обезболите мышь 3%-4% изофлураном в медицинском кислороде. С практикой и знакомством с процедурой сократите общую продолжительность воздействия изофлурана до менее чем 10 минут для процедуры трепанации черепа.
- Крепко возьмитесь за голову мыши недоминантной рукой. Расположите головку как можно ровнее на рабочей поверхности.
- Найдите место инъекции.
- С помощью подготовленной острой иглы 18 G сначала определите брегму; Для этого проведите иглой по коже головы по средней линии, двигаясь в рострально-каудальной плоскости. Представьте себе равносторонний треугольник, в котором две вершины являются глазами, а третья вершина — приблизительным расположением брегмы (см. рис. 1C).
- От брегмы переместите иглу на 2 мм латерально и на 1 мм каудально к месту инъекции.
- Держа иглу вертикально, с силой протолкните иглу через кожу и кость, пока трубка не окажется на одном уровне с кожей.
- Втяните иглу, поверните иглу и снова надавите на кожу и кость. Повторяйте процесс до тех пор, пока в кости не образуется небольшое отверстие.
- Используйте тупую иглу, чтобы убедиться, что в кости образовалось достаточное отверстие. Постарайтесь сделать отверстие в кости, достаточно большое, чтобы тупая игла могла пройти через него.
- Извлеките мышь из носового конуса, удалите кровь с места инъекции стерильной марлей и поместите мышь в клетку на обогреватель до пробуждения. Поскольку отверстие, сделанное при трепанации черепа, небольшое (игла 18 G), место не нужно закрывать швом или зажимами для раны.
ПРИМЕЧАНИЕ: Отверстие здесь небольшое (18 G), поэтому многие учреждения считают эту процедуру инъекцией, а не хирургическим вмешательством. Более того, несмотря на то, что через кожу и кости делается отверстие в мозг, натягивание кожи приводит к тому, что отверстия не совпадают, что, вероятно, помогает предотвратить контакт кожной флоры или подстилки клетки с мозгом.
2. Впрыск
- Подготовьте материалы для инъекции, как описано ниже.
- Положите на рабочую поверхность чистую накладку или драпировочный материал. Прикрепите носовой обтекатель испарителя изофлурана к рабочей поверхности (близко к экспериментатору, но в противоположную сторону; см. рисунок 1А).
- Прикрепите иглу длиной 10 мм 27 G со скосом 45° к стеклянному шприцу объемом 5 мкл. Наденьте на иглу силастическую трубку так, чтобы выступало 3,5 мм кончика иглы; используйте лабораторную ленту, чтобы прикрепить трубку к корпусу шприца (см. рисунок 1D).
- Подготовьте среду для инъекций (лекарство, вирус или другую жидкость для инъекций) в пробирке. Для получения репрезентативных результатов в этом исследовании вводили стерильный изотонический физиологический раствор.
ПРИМЕЧАНИЕ: Выберите пробирку, к которой можно получить доступ с помощью стеклянного шприца и иглы, например, пробирку для микроцентрифуги объемом 2 мл. - Наберите 3 мкл среды для инъекций в стеклянный шприц. Сначала наберите больше, чем нужно, и выталкивайте до тех пор, пока в шприце не останется 3 мкл.
- Соберите йодный скраб, стерильную марлю и спиртовые салфетки для подготовки места инъекции.
- Запустите лабораторный таймер в режиме обратного отсчета и разместите таймер так, чтобы он был виден экспериментатору во время выполнения инъекций.
- Потренируйтесь перемещать иглу на 2 мм в сторону и на 1 мм в хвост, как это делалось накануне.
- Подготовьте мышь к инъекции, как описано ниже.
- Поместите мышь в индукционную камеру и обезболивайте мышь изофлураном. Как только рефлекс пальцев ног исчезнет, нанесите смазку для глаз и поместите мышь на рабочую поверхность головой в носовом конусе.
- Очистите место укола тремя салфетками от йода и спирта. Определите место инъекции иглой 18 G (или затупленной иглой), как описано в шаге 1.8. Отверстие, созданное во время трепанации черепа, должно быть обнаруживаемым.
ПРИМЕЧАНИЕ: Если трепанация черепа не была выполнена заранее, или если отверстие в черепе не обнаруживается, трепанация черепа может быть выполнена здесь.
- Выполните инъекцию стеклянным шприцем, как описано ниже.
- Крепко возьмитесь за голову мыши недоминантной рукой. Расположите головку как можно ровнее на рабочей поверхности.
- Поместите иглу стеклянного шприца в отверстие в черепе до тех пор, пока трубка, помещенная над иглой, подготовленной на шаге 2.1.2, не упрется в кожу мыши.
- Держите шприц как можно вертикальнее, обращая внимание как на корональную, так и на сагиттальную плоскости. Медленно вводите среду в течение 1 минуты.
- Подержите шприц и иглу на месте еще минуту после завершения инъекции, чтобы свести к минимуму обратный поток. Медленно отведите иглу от головки мыши.
- Извлеките мышь из носового конуса, удалите кровь из места инъекции стерильной марлей (если она присутствует) и поместите мышь в клетку на обогреватель клетки до тех пор, пока она не проснется.
3. Подтверждение места инъекции
- Глубоко обезболивайте и перфузируйте мышь физиологическим раствором и 4% параформальдегидом в фосфатно-солевом буфере (PBS), как описано ранее8. Храните мозг в 30% сахарозе в PBS при температуре 4 °C до тех пор, пока мозг не опустится (обычно 2 дня).
- Вырежьте корональные срезы 20-50 мкм на криостате, как описано ранее9. Во время секционирования наблюдайте за инъекционным трактом в тканевом блоке. Запишите, четко ли инжекционный тракт пересекает боковой желудочек.
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Результаты
При успешном выполнении этот метод позволяет быстро доставить экспериментальный агент в желудочковую систему. На рисунке 2А показан профиль пульса лютеинизирующего гормона (ЛГ) у овариэктомированной мыши, получившей инъекцию ICV в виде 3 мкл стерильного изотонического физиологического раствора, носителя для многих фармакологических соединений. Этот пример демонстрирует, что кратковременное воздействие газовой анестезии и введение 3 мкл жидкости в желудочковую систему сами по себе не изменяли...
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Обсуждение
Здесь описано простое и эффективное средство для проведения инъекций ICV мышам. Поскольку этот метод не требует стереотаксической рамки, такой подход к централизованной доставке лекарств и экспериментальных агентов доступен большему количеству исследователей. Кроме того, этот подход является относительно высокопроизводительным, поскольку процедура подготовки и инъекции может быть выполнена быстро.
Поскольку эта процедура требует манипуляций иглами и стеклянным шприцем вручную с использованием ...
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Раскрытие информации
Авторам нечего раскрывать.
Благодарности
Мы хотели бы поблагодарить д-ра Келли Брин Черч, г-на Майкла Крайсмана и г-жу Джессику Янг за их вклад в сбор данных, представленных в репрезентативных результатах. Эта работа была поддержана Национальными институтами здравоохранения (NIH) R00 HD104994 (R.B.M.).
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Материалы
| Имя | Компания | Каталожный номер | Комментарии |
|---|---|---|---|
| Тупые иглы 18-го калибра | SAI Infusion | B18-150 | |
| Иглы 18-го калибра | BD Medical | 305195 | |
| Спиртовые салфетки | Fisher Scientific | 22-363-750 | |
| Настольные прокладки | Fisher Scientific | 14-206-62AC22 | |
| Бетадиновый раствор | Fisher Scientific | NC1696484 | |
| Бупренорфин | Patterson Vet Supply | 07-892-5235 | Контролируемое вещество |
| Eyelube | Fisher Scientific | 50-218-8442 | |
| Стеклянный шприц | Hamilton | 7634-01 | |
| Игла для инъекций | Hamilton | 7803-01 | 27 калибр, Маленькая игла Hub RN, тип точки: 4, Длина иглы: 10 см, Угол: 45 |
| Изофлуран | Patterson Vet Supply | 07-893-8441 | |
| Изофлуран вапорайзер | Vet Equip | V-10 | |
| Лабораторная лента | VWR | 89098-128 | |
| Медицинский кислород Воздух | OX USPEA | ||
| параформальдегид | Millipore-Sigma | 8.18715.1000 | |
| Фосфат буферизованный физиологический раствор | Fisher Scientific | J67802. K2 | |
| PulsaR Software | с открытым исходным кодом, Университет Отаго | См. ссылку 9 | |
| Ruler | Fisher Scientific | 12-00-152 | |
| Силастическая трубка (0,040" I.D.) | DOW | 508-005 | |
| Силастическая трубка (внутренний диаметр 0,078 дюйма) | DOW | 508-009 | |
| Стерильный физиологический раствор | VWR | 101320-574 | |
| Сахароза | Фишер Сайентифик | С5-500 |
Ссылки
- Roseweir, A. K., et al. Discovery of potent kisspeptin antagonists delineate physiological mechanisms of gonadotropin regulation. Journal of Neuroscience. 29 (12), 3920-3929 (2009).
- Kim, J. Y., Grunke, S. D., Levites, Y., Golde, T. E., Jankowsky, J. L. Intracerebroventricular viral injection of the neonatal mouse brain for persistent and widespread neuronal transduction. Journal of Visualized Experiments. (91), e51863(2014).
- Taylor, Z. V., Khand, B., Porgador, A., Monsonego, A., Eremenko, E. An optimized intracerebroventricular injection of CD4(+) T cells into mice. STAR Protocols. 2 (3), 100725(2021).
- Russo, K. A., et al. Circadian control of the female reproductive axis through gated responsiveness of the RFRP-3 system to VIP signaling. Endocrinology. 156 (7), 2608-2618 (2015).
- Laursen, S. E., Belknap, J. K. Intracerebroventricular injections in mice. Some methodological refinements. Journal of Pharmacological Methods. 16 (4), 355-357 (1986).
- Haley, T. J., McCormick, W. G. Pharmacological effects produced by intracerebral injection of drugs in the conscious mouse. British Journal of Pharmacology and Chemotherapy. 12 (1), 12-15 (1957).
- McCosh, R. B., et al. Insulin-induced hypoglycaemia suppresses pulsatile luteinising hormone secretion and arcuate Kiss1 cell activation in female mice. Journal of Neuroendocrinology. 31 (12), e12813(2019).
- Wu, J., et al. Transcardiac perfusion of the mouse for brain tissue dissection and fixation. Bio-Protocol. 11 (5), e3988(2021).
- Comba, A., et al. Laser capture microdissection of glioma subregions for spatial and molecular characterization of intratumoral heterogeneity, oncostreams, and invasion. Journal of Visual Experiments. (158), e60939(2020).
- Porteous, R., et al. Reformulation of PULSAR for analysis of pulsatile LH secretion and a revised model of estrogen-negative feedback in mice. Endocrinology. 162 (11), (2021).
- Hohmann, J. G., et al. Differential role of melanocortins in mediating leptin's central effects on feeding and reproduction. American Journal of Physiology: Regulatory, Integrative, and Comparative Physiology. 278 (1), R50-R59 (2000).
- Gottsch, M. L., et al. A role for kisspeptins in the regulation of gonadotropin secretion in the mouse. Endocrinology. 145 (9), 4073-4077 (2004).
- Krasnow, S. M., et al. A role for galanin-like peptide in the integration of feeding, body weight regulation, and reproduction in the mouse. Endocrinology. 144 (3), 813-822 (2003).
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Перепечатки и разрешения
