Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.

Методическая статья

Выделение ядер из клеток-предшественников сердца мышей для профилирования эпигенома и экспрессии генов при одноклеточном разрешении

4.1K просмотров

⸱

DOI:

10.3791/65328

⸱

12 мая 2023 г.

 ,  ,  ,  ,  , 
1Center for Cardiovascular Disease & Nutrition, U1263, Aix-Marseille University, 2Marseille Medical Genetics, U1251, Aix-Marseille University

В этой статье

Краткое содержание

Здесь мы представляем протокол, описывающий подготовку ядер клеток. После микродиссекции и ферментативной диссоциации сердечной ткани на отдельные клетки клетки-предшественники замораживали с последующим выделением чистых жизнеспособных клеток, которые использовали для секвенирования одноядерной РНК и одноядерного анализа на транспозаз-доступный хроматин с высокопроизводительным анализом секвенирования.

Аннотация

Развивающееся сердце представляет собой сложную структуру, содержащую различные клетки-предшественники, контролируемые сложными регуляторными механизмами. Изучение экспрессии генов и состояния хроматина отдельных клеток позволяет идентифицировать тип и состояние клеток. Подходы к секвенированию отдельных клеток выявили ряд важных характеристик гетерогенности клеток-предшественников сердца. Однако эти методы, как правило, ограничены свежей тканью, что ограничивает исследования с различными экспериментальными условиями, поскольку свежая ткань должна быть обработана сразу в одном и том же прогоне, чтобы уменьшить техническую изменчивость. Поэтому в этой области необходимы простые и гибкие процедуры для получения данных с помощью таких методов, как секвенирование одноядерной РНК (snRNA-seq) и одноядерный анализ на транспозаз-доступный хроматин с высокопроизводительным секвенированием (snATAC-seq). Здесь мы представляем протокол для быстрого выделения ядер для последующих одноядерных двойных омиков (комбинированные snRNA-seq и snATAC-seq). Этот метод позволяет выделять ядра из замороженных образцов клеток-предшественников сердца и может быть объединен с платформами, использующими микрофлюидные камеры.

Введение

Среди врожденных дефектов наиболее распространены врожденные пороки сердца (ВПС), встречающиеся примерно у 1% живорождений каждый год 1,2. Генетические мутации выявляются лишь в меньшинстве случаев, что означает, что в этиологии ИБС 2,3 участвуют другие причины, такие как нарушения регуляции генов. Развитие сердца представляет собой сложный процесс разнообразных и взаимодействующих типов клеток, что затрудняет идентификацию причинно-следственных некодирующих мутаций и их влияния на регуляцию генов. Органогенез сердца начинается с клеточных предшественников, дающих начало различным подтипам сердечных клеток, включая клетки миокарда, фибробластов, эпикардиальных и эндокардиальных клеток 4,5. Одноклеточная геномика становится ключевым методом изучения развития сердца и оценки влияния клеточной гетерогенности на здоровье и болезни6. Разработка мультиомических методов одновременного измерения различных параметров и расширение вычислительных конвейеров облегчили открытие типов и подтипов клеток в нормальном и больном сердце6. В данной статье описывается надежный протокол выделения одного ядра для замороженных клеток-предшественников сердца, полученных из эмбрионов мышей, который совместим с нРНК-секвенированием и snATAC-секвенированием (а также snRNA-seq и snATAC-seq вместе взятыми)7,8,9.

ATAC-seq - это надежный метод, который позволяет идентифицировать регуляторные открытые области хроматина и позиционировать нуклеосомы10,11. Эта информация используется для того, чтобы сделать выводы о расположении, идентичности и активности факторов транскрипции. Таким образом, можно проанализировать активность хроматиновых факторов, в том числе ремоделиров, а также транскрипционную активность РНК-полимеразы, поскольку метод является высокочувствительным для измерения количественных изменений структуры хроматина 1,2. Таким образом, ATAC-seq обеспечивает надежный и беспристрастный подход к раскрытию механизмов, контролирующих регуляцию транскрипции в определенном типе клеток. Протоколы ATAC-seq также были проверены для измерения доступности хроматина в отдельных клетках, что выявило вариабельность архитектуры хроматина в клеточных популяциях10,12,13.

Несмотря на то, что в последние годы были достигнуты заметные успехи в области одиночных клеток, основная трудность заключается в обработке свежих образцов, необходимых для проведения этих экспериментов14. Чтобы обойти эту трудность, были проведены различные тесты с целью проведения таких анализов, как snRNA-seq и snATAC-seq с замороженной сердечной тканью или клетками15,16.

Для анализа данных одноклеточной геномики использовалось несколько платформ17. Широко используемые платформы для экспрессии одноклеточных генов и профилирования ATAC являются платформами для инкапсуляции множественных микрофлюидных капель17. Поскольку эти платформы используют микрофлюидные камеры, мусор или агрегаты могут засорить систему, что приведет к непригодным для использования данным. Таким образом, успех одноклеточных исследований зависит от точного выделения отдельных клеток/ядер.

Представленный здесь протокол использует подход, аналогичный недавним исследованиям с использованием snRNA-seq и snATAC-seq для понимания врожденных пороков сердца 18,19,20,21,22,23. В этой процедуре используется ферментативная диссоциация свежеиссеченной микрорассеченной сердечной ткани с последующей криоконсервацией клеток-предшественников сердца мыши. После размораживания жизнеспособные клетки очищаются и обрабатываются для ядерной изоляции. В данной работе этот протокол был успешно использован для получения данных snRNA-seq и snATAC-seq из одного и того же ядерного препарата клеток-предшественников сердца мыши.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

Процедура на животных, принятая в этом исследовании, была одобрена комитетами по этике животных Университета Экс-Марсель (C2EA-14) и проводилась в соответствии с протоколами, утвержденными назначенным национальным этическим комитетом по экспериментам на животных (Ministère de l'Education Nationale, de l'Enseignement Supérieur et de la Recherche; Авторизация Apafis N°33927-2021111715507212).

1. Настройка спаривания по времени перед вскрытием

  1. Чтобы получить эмбрионы мышей, выполните спаривание между взрослыми мышами за 9,5 дней до выделения области сердца. В этой процедуре использовались мыши дикого типа C57BL/6J в возрасте 2-6 месяцев, а спаривание проводилось в течение ночи.
  2. На следующее утро проверьте, есть ли у самок мышей вагинальная пробка. Рассмотрим день, когда пробка идентифицирована как эмбриональный день (E) 0,5.

2. Подготовка тканей и выделение клеток

  1. Усыпить беременную женщину в возрасте 2-6 месяцев C57BL/6J на 9,5-й день после зачатия с помощью CO2 с возрастающей концентрацией с последующей дисконтацией шейки матки. Очистите нижнюю часть живота 70% этанолом.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Использование анестетиков перед вывихом шейки матки не рекомендуется, так как это подвергнет эмбрионы изменениям окружающей среды, которые могут повлиять на последующие транскриптомные и эпигеномные исследования.
  2. Вскройте живот и брюшину ножницами. Визуализируйте рога матки и используйте щипцы, чтобы иссечь оба рога.
  3. Поместите рога в чашку Петри, содержащую холодную полную среду с 1% FBS. Хотя никакого конкретного объема не требуется, необходимо позаботиться о том, чтобы эмбрионы были полностью погружены в среду. Подходит приблизительный объем 10 мл на 10-сантиметровую чашку Петри.
  4. Под стереомикроскопом с 5-кратным увеличением и с помощью щипцов удалите ткань эндометрия, плаценту и желточный мешок из каждого эмбриона.
  5. Поместите эмбрионы в чашку Петри с холодной полной средой с 1% FBS. Препарируют эмбриональную область сердца, как описано на схеме эмбриона, показанной на рисунке 1, в холодной полной среде.
  6. Объедините области сердца, препарированные у пяти эмбрионов мышей, в микроцентрифужной пробирке объемом 1,5 мл. Предварительное охлаждение качающихся ковшовых центрифуг до 4 °C.
  7. Центрифуга при 300x g в течение 1 мин при RT в центрифуге с качающимся ведром. Удалите надосадочную жидкость и промойте ткани, добавив 1 мл PBS для культивирования тканей.
  8. Центрифуга при 300 x g в течение 1 мин при RT. Удалите надосадочную жидкость и повторите этапы стирки, в общей сложности две стирки. Повторите стирку дважды, заменив PBS 0,05% трипсином/ЭДТА (1x).
  9. Для тканевого переваривания добавьте 50 мкл 0,25% трипсина/ЭДТА в течение 10 мин при 37 ° C. Через 5 минут нанесите мягкую механическую диссоциацию жестами вверх и вниз с помощью наконечника фильтра с широким отверстием.
  10. Инактивируйте активность расщепления трипсина, добавляя 350 мкл полной среды к диссоциированным клеткам. Пропустите ресуспендированные клетки через клеточный фильтр размером 40 мкм.

3. Подсчет клеток и оценка жизнеспособности

ПРИМЕЧАНИЕ: Количество клеток и жизнеспособность являются критическими параметрами для успеха экспериментов с отдельными клетками. Подход snATAC-seq чувствителен к незначительным изменениям числа ячеек. Слишком малое количество клеток приводит к чрезмерному перевариванию хроматина, что приводит к большему количеству считываний и картированию недоступных областей хроматина (шум). Точно так же наличие слишком большого количества клеток генерирует высокомолекулярные фрагменты, которые трудно секвенировать. Для точного определения концентраций клеток и ядер количество клеток и жизнеспособность оценивали двумя разными методами.

  1. Проведите анализ трипанового синего для подсчета клеток, как описано ниже.
    1. Вортекс 0,4% раствор для окрашивания трипановым синим, отжим в течение 10 с при комнатной температуре при 2,000 x g и переведите 10 мкл в микропробирку.
    2. С помощью пипетки перемешивают клеточную суспензию и добавляют 10 мкл суспензии к уже аликвотированным 10 мкл раствора трипанового синего. Тщательно перемешайте 10 раз пипеткой.
    3. Перенесите 10 мкл окрашенных клеток в счетное стекло. Поместите слайд в счетчик, чтобы автоматически рассчитать концентрацию и жизнеспособность клеток.
  2. Проведите оценку смертности на основе флуоресценции, как описано ниже.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Этот анализ основан на использовании флуоресцентных красителей (гомодимер этидия-1, EthD-1 и кальцеин AM) для оценки жизнеспособности клеток. Был использован коммерчески доступный комплект, и были соблюдены инструкции поставщика по соответствующей подготовке и использованию.
    1. Приготовьте 10 мкМ раствора EthD-1, добавив 5 мкл поставляемого 2 мМ исходного раствора EthD-1 к 1 мл стерильного D-PBS для культуры тканей и встряхните в течение 5 с, чтобы обеспечить полное перемешивание.
    2. Перенесите 2,5 мкл поставляемого 4 мМ исходного раствора кальцеина AM в уже приготовленный раствор EthD-1. Вихрь в течение 5 с для обеспечения полного перемешивания.
    3. Добавьте 10 мкл полученного рабочего раствора 10 мкМ EthD-1 и 10 мкМ кальцеина AM к 10 мкл клеточной суспензии.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Кальцеин очень чувствителен к гидролизу в водных растворах, поэтому используйте этот рабочий раствор в течение 1 дня.
    4. Перенесите 10 мкл окрашенных клеток на счетное стекло. Вставьте слайд в автоматический счетчик флуоресцентных ячеек. Подсчитайте живые клетки с помощью фильтра GFP и мертвые клетки с фильтром RFP.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Два метода подсчета дали одинаковое количество клеток и жизнеспособность, а общее количество свежедиссоциированных клеток оценивалось в среднем примерно в 20 000 клеток на эмбриональную область сердца (0,06 мм3).

4. Замораживание ячеек

  1. Центрифугируют клеточную суспензию при 500 x g в течение 5 мин при 4 °C. Осторожно удалите надосадочную жидкость, не касаясь дна пробирки, и ресуспендируйте гранулу в 1 мл охлажденной морозильной среды.
  2. Перенесите клеточную суспензию в предварительно охлажденный криовиал и поместите криовиальную в предварительно охлажденный морозильный контейнер.
  3. Поместите контейнер при температуре −80 °C на срок от 4 до 8 часов. Переведите криовиал на жидкий азот для последующих экспериментов по секвенированию одноядерных РНК и ATAC.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Криовиал следует транспортировать на сухом льду перед использованием. По нашему опыту, клетки могут храниться в жидком азоте не менее 6 месяцев без потери жизнеспособности клеток. Температура хранения должна постоянно поддерживаться ниже −150 °C, чтобы предотвратить образование кристаллов льда.

5. Размораживание клеток и удаление мертвых клеток

  1. Поместите криовиалы на водяную баню с температурой 37 °C на 1-2 минуты. Удалите его, когда крошечный кристалл останется в криовиале.
  2. Добавьте 1 мл предварительно подогретой (37 °C) готовой среды. Смешайте пипеткой три раза. Перенесите суспензию в коническую пробирку объемом 15 мл, содержащую 10 мл теплой полной среды.
  3. Пропустите всю клеточную суспензию через сетчатый фильтр 30 мкм. Промойте ситечко 1-2 мл теплой полной среды и соберите проточный фильтр в ту же коническую трубку.
  4. Центрифугу при 300 х г в течение 5 мин и удалить надосадочную жидкость. Промойте один раз PBS и перенесите клеточную суспензию в микропробирку объемом 1,5 мл.
  5. Центрифугу при 300 x g в течение 5 мин и удалите надосадочную жидкость, не разрушая клеточную гранулу.
  6. Добавьте 100 мкл прилагаемых магнитных микрошариков в гранулированные ячейки и гомогенизируйте пять раз, используя наконечник пипетки с широким отверстием. Инкубировать в течение 15 минут при РТ.
  7. Тем временем промойте колонну магнитной сепарации (емкость: от 1 x 107 до 2 x 108 ячеек) 500 мкл 1x связывающего буфера.
  8. После завершения инкубации разбавьте клеточную суспензию, содержащую микрогранулы, 500 мкл 1x связывающего буфера.
  9. Нанесите суспензию ячейки (0,6 мкл) на подготовленную магнитную сепарационную колонну. Проточная фракция представляет собой отрицательно выбранную фракцию живых клеток, а магнитно-удерживаемая фракция представляет собой положительно отобранные мертвые клетки.
  10. Соберите стоки живых клеток в центрифужную пробирку объемом 15 мл. Промойте микропробирку объемом 1,5 мл, содержащую клеточную суспензию, и колонку 2 мл 1x связывающего буфера и соберите сточные воды в ту же пробирку объемом 15 мл.
  11. Центрифуга при 300 х г в течение 5 мин. Удалите надосадочную жидкость, не нарушая клеточную гранулу.
  12. Добавьте 1 мл раствора PBS-BSA и аккуратно перемешайте, пипеткой пять раз с помощью наконечника пипетки с широким отверстием. Перенесите клеточную суспензию в микропробирку объемом 1,5 мл.
  13. Центрифуга при 300 х г в течение 5 мин. Удалите надосадочную жидкость, не нарушая клеточную гранулу.
  14. Добавьте 1 мл PBS-BSA, чтобы ресуспендировать гранулы, и повторите этап промывки, в общей сложности две стирки.
  15. Ресуспендируют клетки в 100 мкл раствора PBS-BSA. Аккуратно перемешайте, пипеткой 10 раз.
  16. Определяют концентрацию и жизнеспособность клеток с помощью ранее описанных методов (этап 3.1 и шаг 3.2). Чтобы перейти к следующему шагу, убедитесь, что количество ячеек составляет ≥100 000 ячеек. Репрезентативные результаты см. на рисунке 2 .
    ПРИМЕЧАНИЕ: Криоконсервация приводит к потере примерно 40% исходного материала живых клеток. В зависимости от начального количества ячеек разделение шариков на магнитном столбе приводит к высокой жизнеспособности клеток, но делит общее количество клеток в два-пять раз. Использование магнитного комплекта на основе колонки для удаления мертвых клеток рекомендуется только при наличии достаточного исходного материала.

6. Выделение ядер

ПРИМЕЧАНИЕ: snATAC и snRNA-seq в сочетании выполняются с помощью суспензии чистых и интактных ядер. Рекомендуется оптимизация условий лизиса (время лизиса и концентрация NP40) для используемого типа клеток. Оптимальные сроки лизиса и концентрация детергента - это те, которые приводят к лизиру максимального количества клеток без нарушения ядерной морфологии. Потеря клеток/ядер может быть уменьшена с помощью центрифуги с качающимся ведром вместо центрифуги с фиксированным углом. Чтобы свести к минимуму задержку ядер на пластмассах, рекомендуется использовать наконечники пипеток с низким удержанием и центрифужные пробирки. Это может увеличить восстановление ядер. Покрытие наконечников пипеток и центрифужных пробирок 5% BSA является менее дорогой, но более трудоемкой альтернативой.

  1. Очистите рабочее место и материалы 70% раствором для удаления этанола и РНКазы.
  2. Предварительное охлаждение качающихся ковшовых центрифуг до 4 °C. Свежеприготовленный буфер для лизиса, буфер для разбавления лизиса, буфер для лизиса 0,1x и буфер для промывки (см. Таблицу 1). Поддерживайте буферы на льду.
  3. Центрифугируйте клеточную суспензию при 500 x g в течение 5 минут при 4 °C в центрифуге с качающимся ведром. Аккуратно удалите всю надосадочную жидкость, не касаясь дна трубки, чтобы избежать смещения клеточной гранулы.
  4. Добавьте 100 мкл охлажденного 0,1-кратного лизисного буфера. Аккуратно перемешайте, пипеткой 10 раз. Инкубировать 5 минут на льду.
  5. Добавьте 1 мл охлажденного буфера для стирки и аккуратно перемешайте пипеткой пять раз. Центрифуга при 500 x g в течение 5 мин при 4 °C. Удалите надосадочную жидкость, не нарушая гранулу ядер.
  6. Повторите стирки с охлажденным буфером для стирки, всего три стирки. Приготовьте буфер для разбавленных ядер. После ресуспендирования держите раствор запаса ядер на льду.

7. Качественные и количественные оценки выделенных ядер

ПРИМЕЧАНИЕ: Основываясь на исходном количестве клеток и оценивая потерю примерно 50% ядер во время лизиса клеток, ресуспендируйте соответствующее количество клеток в буфере ядер холодного разбавления. Расчет объема ресуспензии с буфером охлажденных разбавленных ядер основан на целевом извлечении ядер и соответствующих концентрациях запасов ядер, рекомендованных руководством пользователя завода-изготовителя. Пример этого расчета приведен в Дополнительном протоколе 1.

  1. Основываясь на исходном количестве клеток и оценивая примерно 50% потери ядер во время лизиса клеток, ресуспендируют соответствующее количество клеток в буфере ядер холодного разбавления.
  2. Определите фактическую концентрацию ядер. Смешайте 2 мкл исходного раствора ядер с 8 мкл разбавленного буфера ядер и добавьте смесь к предварительно аликвотированным 10 мкл трипанового синего или рабочего раствора EthD-1 / кальцеина. Подсчитайте ядра с помощью автоматического счетчика клеток. Менее 5% клеток должны быть жизнеспособными. Репрезентативные результаты см. на рисунке 3 .
  3. Рассчитайте объем запаса ядер и объем буфера разбавленных ядер, чтобы получить общий объем 5 мкл при рекомендуемой концентрации для реакции транспозиции (см. Руководство пользователя производителя). Немедленно приступайте к реакции транспозиции в соответствии с руководствомпользователя 17.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Все этапы от реакции транспозиции до построения библиотек ATAC и GEX были выполнены в соответствии с руководством пользователя набора, используемого для snRNA-seq и snATAC-seq вместе17.

8. Анализ качества библиотек snRNA-seq и snATAC-seq

  1. Прежде чем приступить к секвенированию следующего поколения, проверьте качество и распределение по размерам окончательных библиотек snATAC-seq и экспрессии генов GEX. Оцените качество и количество последовательностей, идентифицированных в библиотеках, с помощью систем анализа фрагментов. Репрезентативные результаты оценки качества см. на рисунке 4 .
    ПРИМЕЧАНИЕ: Окончательная трассировка библиотек snATAC-seq должна показывать периодичность намотки нуклеосом, а размеры должны варьироваться от 200.н. до нескольких Кбит/с, тогда как размеры в библиотеке экспрессии генов должны варьироваться от 300.н. до 600.н.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

По сравнению с приготовлением одноклеточных суспензий для одноклеточных подходов, приготовление одноядерных суспензий является гораздо более сложным и требует более высокой степени разрешения и обработки. Ключевым фактором успешного комбинирования snRNA-seq и snATAC-seq является чистая и неповрежденная суспензия ядер. Протокол эффективного выделения ядер должен быть адаптирован к каждому типу и состоянию ткани (свежей или замороженной). Здесь описан оптимизированный протокол выделения ядер из замороженных эмбриональных с...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

Анализ клеточного состава развивающегося сердца с помощью комбинированных исследований snRNA-seq и snATAC-seq обеспечивает более глубокое понимание происхождения врожденных пороков сердца26. Несколько исследовательских лабораторий изучили влияние криоконсервации сердечной ткани на snRNA-seq27. Проведение snRNA-seq и snATAC-seq с использованием свежей микрорассеченной ткани из мышиных моделей заболеваний человека может быть логистически сложным при сравнении различных экспер...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

Авторам раскрывать нечего.

Благодарности

Это исследование было поддержано ERA-CVD-2019 и ANR-JCJC-2020 SS. Мы благодарим Центр геномики и биоинформатики (GBiM) из лаборатории U 1251 / Marseille Medical Genetics и анонимных рецензентов за предоставленные ценные комментарии.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
2100 Биоанализатор ПриборAgilentNo каталожный
5M Sodium chloride (NaCl)Sigma59222C-500ML 
BSA 10% SigmaA1595-50ML
Chromium Next GEM Chip J Single Cell Kit, 16 наборов10X Genomics1000230
Chromium Next GEM Single Cell Multiome ATAC + пучок реагентов экспрессии генов, 4 rxn (включая буфер ядер 20X)10X Genomics1000285
Камеру подсчета клеток CountessInvitrogenC10283
Countess III FLThermofisherNo Каталожный номер
Digitonin (5%)ThermofisherBN2006
DMSOSigmaD2650-5x5ML
DNA LoBind Tubes Eppendorf22431021
D-PBSThermofisher14190094стерильный и безРНКазный
двойной индексный набор TT Set A 96 rxns10X Genomics1000215
Falcon 15 мл конические центрифужные пробирки Fisher Scientific 
Falcon 50 мл конические центрифужные пробирки Fisher Scientific 
HI-FBSThermofisherA3840001Термоинактивированный Высокочувствительный
набор ДНКAgilent5067-4626
Igepal CA-630SigmaI8896-50ML
ЖИВОЙ/МЕРТВЫЙ Набор для жизнеспособности/цитотоксичностиThermofisherL3224
MACS Набор для удаления мертвых клеток: Микрогранулы Dead Cell Romoval, связывающий буфер 20XMiltenyi Biotec130-090-101
MACS SmartSits (30 & микро; m)Miltenyi Biotec130-098-458
Хлорид магния (MgCl2)SigmaM1028-100ML
Milieu McCoy 5A Thermofisher16600082
MSКолонки Miltenyi Biotec130-042-201
NovaSeq 6000 S2IlluminaNo каталожного номера
Пенициллин Стрептомицин (Pen/Strep)Thermofisher15070063
PluriStrainer Mini 40&микро; mPluriSelectV-PM15-2021-12
Ингибитор горных породEnzo Life SciencesALX-270-333-M005
Single Index Kit N Set A, 96 rxn10X Genomics1000212
Стандартная чашка Петри 90мм SterilinThermofisher101R20
Стерильная вода двойной дистилляцииThermofisherR0582
Тризма гидрохлорид раствор (HCl)SigmaT2194-100ML 
Трипан Синий морилка (0.4%)InvitrogenT10282
Трипсин 0.05% - EDTA 1XThermofisher25300054
Tween20SigmaP9416-50ML 
Наконечники для пипеток с широким отверстием и фильтром 200 мкм; lLabcon1152-965-008-9
ZEISS SteREO Discovery.V8ZEISSНет каталожного номера
35209610788561

Ссылки

  1. vander Bom, T., et al. The changing epidemiology of congenital heart disease. Nature Reviews. Cardiology. 8 (1), 50-60 (2011).
  2. Bouma, B. J., Mulder, B. J. Changing landscape of congenital heart disease. Circulation Research. 120 (6), 908-922 (2017).
  3. Postma, A. V., Bezzina, C. R., Christoffels, V. M. Genetics of congenital heart disease: The contribution of the noncoding regulatory genome. Journal of Human Genetics. 61 (1), 13-19 (2016).
  4. Buijtendijk, M. F. J., Barnett, P., vanden Hoff, M. J. B. Development of the human heart. American Journal of Medical Genetics. Part C, Seminars in Medical Genetics. 184 (1), 7-22 (2020).
  5. Sylva, M., vanden Hoff, M. J., Moorman, A. F. Development of the human heart. American Journal of Medical Genetics. Part A. 164 (6), 1347-1371 (2014).
  6. Gromova, T., Gehred, N. D., Vondriska, T. M. Single-cell transcriptomes in the heart: When every epigenome counts. Cardiovascular Research. 119 (1), 64-78 (2022).
  7. Tanay, A., Regev, A. Scaling single-cell genomics from phenomenology to mechanism. Nature. 541 (7637), 331-338 (2017).
  8. Schwartzman, O., Tanay, A. Single-cell epigenomics: Techniques and emerging applications. Nature Reviews. Genetics. 16 (12), 716-726 (2015).
  9. Macaulay, I. C., Ponting, C. P., Voet, T. Single-cell multiomics: Multiple measurements from single cells. Trends in Genetics. 33 (2), 155-168 (2017).
  10. Buenrostro, J. D., Wu, B., Chang, H. Y., Greenleaf, W. J. ATAC-seq: A method for assaying chromatin accessibility genome-wide. Current Protocols in Molecular Biology. 109, 1-9 (2015).
  11. Stefanovic, S., et al. Hox-dependent coordination of mouse cardiac progenitor cell patterning and differentiation. Elife. 9, e55124(2020).
  12. Xu, W., et al. A plate-based single-cell ATAC-seq workflow for fast and robust profiling of chromatin accessibility. Nature Protocols. 16 (8), 4084-4107 (2021).
  13. Buenrostro, J. D., et al. Single-cell chromatin accessibility reveals principles of regulatory variation. Nature. 523 (7561), 486-490 (2015).
  14. Denisenko, E., et al. Systematic assessment of tissue dissociation and storage biases in single-cell and single-nucleus RNA-seq workflows. Genome Biology. 21 (1), 130(2020).
  15. Safabakhsh, S., et al. Isolating nuclei from frozen human heart tissue for single-nucleus RNA sequencing. Current Protocols. 2 (7), e480(2022).
  16. Pimpalwar, N., et al. Methods for isolation and transcriptional profiling of individual cells from the human heart. Heliyon. 6 (12), 05810(2020).
  17. 10x Genomics. Chromium Next GEM Single Cell Multiome ATAC + Gene Expression Reagent Kits User Guide. 10x Genomics. , CG000338_ChromiumNextGEM_Multiome_ATAC_GEX_User_Guide_RevF.pdf (2022).
  18. Jia, G., et al. Single cell RNA-seq and ATAC-seq analysis of cardiac progenitor cell transition states and lineage settlement. Nature Communications. 9 (1), 4877(2018).
  19. Wang, L., et al. Single-cell dual-omics reveals the transcriptomic and epigenomic diversity of cardiac non-myocytes. Cardiovascular Research. 118 (6), 1548-1563 (2022).
  20. Wang, Z., et al. Cell-type-specific gene regulatory networks underlying murine neonatal heart regeneration at single-cell resolution. Cell Reports. 35 (8), 109211(2021).
  21. Ameen, M., et al. Integrative single-cell analysis of cardiogenesis identifies developmental trajectories and non-coding mutations in congenital heart disease. Cell. 185 (26), 4937-4953 (2022).
  22. Gao, R., et al. Pioneering function of Isl1 in the epigenetic control of cardiomyocyte cell fate. Cell Research. 29 (6), 486-501 (2019).
  23. Manivannan, S., et al. Single-cell transcriptomic profiling unveils dysregulation of cardiac progenitor cells and cardiomyocytes in a mouse model of maternal hyperglycemia. Communications Biology. 5 (1), 820(2022).
  24. Cao, Y., et al. Integrated analysis of multimodal single-cell data with structural similarity. Nucleic Acids Research. 50 (21), e121(2022).
  25. What is CellRanger. 10x Genomics. , Available from: https://support.10xgenomics.com/single-cell-gene-expression/software/pipelines/latest/what-is-cell-ranger (2023).
  26. Hill, M. C. Integrated multi-omic characterization of congenital heart disease. Nature. 608 (7921), 181-191 (2022).
  27. Chen, Z., Wei, L., Duru, F., Chen, L. Single-cell RNA sequencing: In-depth decoding of heart biology and cardiovascular diseases. Current Genomics. 21 (8), 585-601 (2020).
  28. Machado, L., Relaix, F., Mourikis, P. Stress relief: Emerging methods to mitigate dissociation-induced artefacts. Trends in Cell Biology. 31 (11), 888-897 (2021).
  29. Tabula Muris, C., et al. Single-cell transcriptomics of 20 mouse organs creates a Tabula Muris. Nature. 562 (7727), 367-372 (2018).
  30. Machado, L., et al. Tissue damage induces a conserved stress response that initiates quiescent muscle stem cell activation. Cell Stem Cell. 28 (6), 1125-1135 (2021).
  31. Haghverdi, L., Lun, A. T. L., Morgan, M. D., Marioni, J. C. Batch effects in single-cell RNA-sequencing data are corrected by matching mutual nearest neighbors. Nature Biotechnology. 36 (5), 421-427 (2018).
  32. Yang, Y., et al. SMNN: Batch effect correction for single-cell RNA-seq data via supervised mutual nearest neighbor detection. Briefings in Bioinformatics. 22 (3), 097(2021).
  33. Stefanovic, S., Christoffels, V. M. GATA-dependent transcriptional and epigenetic control of cardiac lineage specification and differentiation. Cellular and Molecular Life Sciences. 72 (20), 3871-3881 (2015).
  34. Gunthel, M., Barnett, P., Christoffels, V. M. Development, proliferation, and growth of the mammalian heart. Molecular Therapy. 26 (7), 1599-1609 (2018).
  35. Stefanovic, S., Etchevers, H. C., Zaffran, S. Outflow tract formation-embryonic origins of conotruncal congenital heart disease. Journal of Cardiovascular Development and Disease. 8 (4), 42(2021).
  36. Hao, Y., et al. Integrated analysis of multimodal single-cell data. Cell. 184 (13), 3573-3587 (2021).
  37. Bai, H., Lin, M., Meng, Y., Bai, H., Cai, S. An improved CUT&RUN method for regulation network reconstruction of low abundance transcription factor. Cellular Signalling. 96, 110361(2022).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Теги

ATAC
Выделение ядер из клеток-предшественников сердца мышей для профилирования эпигенома и экспрессии генов при одноклеточном разрешении
Связаться с нами
Порекомендовать библиотеке

Конфиденциальность

Условия использования

Политики

© 2026 MyJoVE Corporation. Все права защищены.