Этот протокол демонстрирует уникальную модель инсульта мыши с инфарктом средних размеров и отличной выживаемостью. Эта модель позволяет исследователям доклинического инсульта увеличивать продолжительность ишемии, использовать старых мышей и оценивать долгосрочные функциональные результаты.
Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.
Методическая статья
Модифицированная транскраниальная модель окклюзии средней мозговой артерии для изучения исходов инсульта у пожилых мышей
В этой статье
Краткое содержание
Аннотация
В экспериментальных исследованиях инсульта окклюзия средней мозговой артерии (MCAO) с помощью внутрипросветной нити широко используется для моделирования ишемического инсульта у мышей. Филаментная модель MCAO обычно демонстрирует массивный инфаркт головного мозга у мышей C57Bl/6, который иногда включает мозговую ткань на территории, снабжаемой задней мозговой артерией, что в значительной степени обусловлено высокой частотой атрезии задней соединительной артерии. Это явление считается основным фактором, способствующим высокой смертности, наблюдаемой у мышей C57Bl/6 во время длительного восстановления после инсульта после MCAO. Таким образом, во многих исследованиях хронического инсульта используются дистальные модели MCAO. Однако эти модели обычно вызывают инфаркт только в области коры головного мозга, и, следовательно, оценка постинсультного неврологического дефицита может быть сложной задачей. В этом исследовании была создана модифицированная транскраниальная модель MCAO, в которой MCA в туловище частично окклюзируется либо постоянно, либо временно через небольшое краниальное окно. Поскольку место окклюзии находится относительно проксимальнее начала MCA, эта модель вызывает повреждение головного мозга как в коре, так и в полосатом теле. Обширная характеристика этой модели продемонстрировала отличную долгосрочную выживаемость, даже у пожилых мышей, а также легко обнаруживаемый неврологический дефицит. Таким образом, описанная здесь модель мыши MCAO представляет собой ценный инструмент для экспериментальных исследований инсульта.
Введение
Почти 800 000 человек в США страдают от инсульта каждый год, и большинство этих инсультов имеют ишемическуюприроду. Своевременное восстановление мозгового кровотока тканевым активатором плазминогена (tPA) и/или тромбэктомией в настоящее время является наиболее эффективным методом лечения пациентов с инсультом; Однако полное восстановление неврологических функций в долгосрочной перспективе встречается редко 2,3. Таким образом, поиск новой терапии инсульта, направленной на функциональное улучшение, является интенсивной областью исследований, требующей клинически значимых моделей инсульта на животных.
Наиболее распространенная модель ишемического инсульта у грызунов использует внутрипросветную окклюзию средней мозговой артерии (MCAO) для индуцирования инсульта. В этой модели, первоначально разработанной Зеа Лонга в 1989 году, нейлоновая нить вводится во внутреннюю сонную артерию (ВСА) для блокировки кровотока к средней мозговой артерии (МЦА)4. Однако у этой модели есть ограничения. Во-первых, когда нить вводится в ВСА, приток крови к задней мозговой артерии (ППА) также может быть частично заблокирован, особенно у мышей. Важно отметить, что задняя соединительная артерия (PcomA), маленькая артерия, которая соединяет переднее и заднее мозговое кровообращение, часто недоразвита у некоторых линий мышей, таких как C57Bl/6, штамм, преимущественно используемый в экспериментальных исследованиях инсульта. Считается, что эта проходимость PcomA способствует вариабельности размера поражения у мышей после инсульта5. Действительно, когда приток крови к PCA резко падает во время MCAO, и PcomA не может обеспечить достаточный коллатеральный кровоток, инсультный инфаркт может распространиться на территорию PCA. Более того, в этой модели длительная продолжительность ишемии приводит к более высокой вероятности смертности у мышей. Следовательно, у мышей обычно используется короткая продолжительность MCAO 30-60 минут. Тем не менее, большинство пациентов, перенесших инсульт, испытывают ишемию в течение нескольких часов перед реперфузионной терапией. Таким образом, модель мышиного инсульта с увеличенной длительностью ишемии имеет высокую клиническую значимость.
Общей целью этой процедуры является моделирование ишемического инсульта у мышей с инфарктом среднего размера и отличной выживаемостью. Эта транскраниальная модель MCAO учитывает критические признаки клинического инсульта, поскольку может быть проведена длительная ишемия, и пожилые мыши хорошо переносят эту модель, что позволяет оценить долгосрочное функциональное восстановление.
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Протокол
Все процедуры, описанные в этой работе, проводятся в соответствии с рекомендациями NIH по уходу и использованию животных в исследованиях, а протокол был одобрен Комитетом по уходу и использованию животных Института Дьюка (IACUC). Для настоящего исследования использовали молодых (8-10 недель) и пожилых (22 месяца) самцов мышей C57Bl/6. Обзор этого протокола показан на рисунке 1.
1. Хирургическая подготовка
- Осмотрите мышь на предмет грубых отклонений и поведенческих нарушений.
ПРИМЕЧАНИЕ: Перед операцией хирургам важно надеть соответствующие СИЗ (средства индивидуальной защиты), включая хирургическую маску, шапочку, перчатки и халат. - Взвесьте мышь; запрограммируйте аппарат искусственной вентиляции легких (см. Таблицу материалов) в зависимости от массы тела.
- Поместите мышь в индукционный бокс для анестезии размером 4 x 4 x 7 дюймов. Включите расходомер кислорода (см. Таблицу материалов), установленный на 30, и расходомер закиси азота, установленный на 70. Включите испаритель с 5% изофлураном.
- Вставьте направляющий провод в внутривенный катетер 20 G.
- Выньте мышь из индукционной коробки, когда ее частота дыхания снизится до 30-40 вдохов в минуту.
- Положите мышь на операционную скамью в положении лежа на спине. Вытащите язык мыши и удерживайте его пальцами левой руки. Вставьте ларингоскоп (см. Таблицу материалов) в рот животного, чтобы визуализировать голосовые связки.
- Стабилизируйте подбородок мыши на ларингоскопе с помощью среднего пальца правой руки. Освободите левую руку, чтобы держать внутривенный катетер 20 G.
- Слегка введите проводник в голосовую связку, а затем медленно протолкните внутривенный катетер 20 G в трахею до тех пор, пока крылышко катетера не станет ровным с кончиком носа.
ПРИМЕЧАНИЕ: Если мышь движется, не вставляйте провод. Это может привести к травме трахеи и кровотечению. - Включите аппарат искусственной вентиляции легких (см. Таблицу материалов) и соедините его с внутривенным катетером 20 G, интубированным мышью. Уменьшите уровень изофлурана до 1,5% и обеспечьте искусственную вентиляцию легких обоим легким.
ПРИМЕЧАНИЕ: Не забывайте снижать концентрацию изофлурана. В противном случае мышь получит передозировку анестезии. - Нанесите глазную мазь на оба глаза и введите 5 мг/кг карпрофена подкожно.
- Держите мышь в боковом положении правой височной областью вверх. Поддерживайте ректальную температуру на уровне 37 °C с помощью грелки (35 °C) и нагревательной лампы, управляемой регулятором температуры (см. Таблицу материалов).
- Побрейте поверхность между правым глазом и ухом и продезинфицируйте операционную область не менее трех раз тампонами с йодом и спиртом.
2. Хирургия MCAO
- Откройте стерильную упаковку инструментов для операции MCAO. Наденьте стерильные перчатки и сделайте хирургическими ножницами разрез кожи между правым глазом и правым ухом диаметром 1 см.
ПРИМЕЧАНИЕ: Следите за цветом кожи, температурой тела и реакцией на ущипление пальца ноги каждые 15 минут. - Рассеките нижнюю фасцию щипцами, чтобы обнажить височные и жевательные мышцы.
ПРИМЕЧАНИЕ: Будьте осторожны, чтобы не повредить околоушную железу. - С помощью щипцов коснитесь нижней части височной мышцы и определите расположение скуловой дуги. Осторожно раздвиньте ветви лицевого нерва.
- Кончиком высокотемпературной петли для прижигания (см. Таблицу материалов) сделайте поперечный разрез 5 мм на височной мышце.
- С помощью двух щипцов рассеките нижележащую скуловую дугу и обнажите сустав между верхней и скуловой костями.
- Ножницами отрежьте 3-миллиметровую часть скуловой дуги и удалите ее. Отделите жевательную мышцу от основания черепа.
ПРИМЕЧАНИЕ: Будьте осторожны, чтобы не сломать ретроорбитальный синус и поверхностную височную вену. - Примените четыре небольших ретрактора, расположенных в разных направлениях, чтобы обнажить основание черепа, при этом ветви тройничного нерва будут вытягиваться латерально одним ретрактором.
ПРИМЕЧАНИЕ: Борозда на наружной поверхности основания черепа отмечает расположение латеральной щели между лобной и височной долями. Здесь находится МКА (рис. 2А), а ее ствол и ветви видны сквозь тонкий прозрачный череп (рис. 2Б). Связь этой артерии с другими крупными мозговыми артериями показана на рисунке 2А. - Нанесите каплю 0,9% физиологического раствора на череп над стволом MCA и проксимальнее ветви коры головного мозга. Используйте электрическую шлифовальную машину, чтобы проредить череп до тех пор, пока не станет виден небольшой перелом.
ПРИМЕЧАНИЕ: Не прижимайте шлифовальную машину к черепу, так как она может проникнуть в череп и повредить подлежащую артерию. - Кончиком щипцов приподнимите истонченный череп и удалите его. Для бутафорских мышей остановитесь на этом и не перевязывайте артерию.
ПРИМЕЧАНИЕ: Образуется небольшое прямоугольное окошко поперек ствола MCA. - Поместите однониточную петлю из черного плетеного шелка поверх MCA (Рисунок 2C). Вставьте 8-0 микрохирургической иглой для подъема ствола MCA и завязывают шов (см. Таблицу материалов) под иглой, оставляя оба конца иглы на верхней части узла петли шелковой нити (рисунок 2D).
- При переходном MCAO слегка затяните узел шелковой нити под иглой, чтобы заблокировать артериальный кровоток (Рисунок 2E), представляющий начало MCAO.
- Используйте щипцы, чтобы удерживать шов, и медленно извлеките иглу в конце ишемии (например, в течение 60 минут или дольше).
ПРИМЕЧАНИЕ: Когда игла извлечена, узел шелковой нити соскальзывает с MCA, и мозг реперфузируется (Рисунок 2F). - Для постоянного MCAO плотно затяните петлю шелковой нити вокруг артерии и извлеките иглу. Обрежьте и удалите излишки шовного материала.
- Нанесите каплю 0,25% бупивакаина на разрез кожи и сшивайте мышцу и кожу отдельно, периодически используя нейлоновые нити 6-0 (см. Таблицу материалов). Нанесите мазь с антибиотиком на поверхность разреза кожи.
ПРИМЕЧАНИЕ: Разрез кожи также можно закрыть стерильными скобами или клеем.
3. Послеоперационный уход
- Выключите изофлуран, чтобы разбудить мышь. Отключите аппарат искусственной вентиляции легких, когда самопроизвольное дыхание восстановится.
- Переместите мышь в камеру восстановления (см. Таблицу материалов) с контролируемой температурой.
- Экстубируйте мышь, когда ее рефлекс выпрямления восстановится, или она начнет двигаться.
- Внимательно следите за мышью в камере с регулируемой температурой и влажностью. Верните мышь в домашнюю клетку после того, как она полностью придет в сознание (восстановительный период ~2 ч). Вводят 5 мг/кг карпрофена подкожно ежедневно в течение 3 дней.
4. Лазерная спекл-контрастная визуализация (LSCI)
- Через 6 и 24 ч после MCAO установите анестезирующую мышь на стереотаксическую рамку. Побрейте верхнюю часть головы и очистите ее тремя чередующимися тампонами йода и спирта.
ПРИМЕЧАНИЕ: Анестезия была выполнена, как указано в шаге 1.3. LSCI также выполняется перед MCAO. - Сделайте разрез кожи по средней линии длиной 3 см и рассеките кожу с черепа. Примените четыре маленьких игольчатых ретрактора, чтобы обнажить верхнюю часть черепа.
- Переместите лазерную спекл-камеру (см. Таблицу материалов) над головой и отрегулируйте фокусировку камеры. Изображение мозгового кровотока.
5. Окрашивание 2,3,5-трифенилтетразолия хлорида (ТТС)
- Глубоко обезболивайте мышь 5% изофлураном в конце эксперимента, обычно на 1, 3 или 28-й день после инсульта. Зажмите хвост, чтобы убедиться в отсутствии болевой реакции.
- Обезглавьте мышь хирургическими ножницами и соберите мозг. Инкубируйте мозг в ледяном физиологическом растворе в течение 20 минут.
- Положите мозг в матрицу слайсера на лед и капните на мозг холодный физиологический раствор. Нарежьте мозг ломтиками по 1 мм с помощью тонких бритвенных лезвий.
- Погрузите срезы мозга в той же ориентации в чашку с 2%-ным раствором ТТС (см. таблицу материалов). Держите блюдо в темноте при комнатной температуре в течение 15 минут.
ПРИМЕЧАНИЕ: Нормальная ткань головного мозга становится красной, а ишемизированная ткань остается белой. - Переведите срезы мозга в 10% формалин на 24 ч фиксации. Визуализируйте срезы головного мозга и измерьте область инфаркта.
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Результаты
При прямом просмотре под операционным микроскопом можно визуально подтвердить, что при ишемии блокируется кровоток MCA. Наше предыдущее исследование показало снижение кровотока в области ишемии на >80% при использовании лазерного допплеровского монитора6. Для того, чтобы определить изменения кровотока после MCAO, LSCI может быть использован для дальнейшего подтверждения ишемического инсульта и реперфузии (рис. 1). Действительно, на рисунке 3А
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Обсуждение
Первая транскраниальная модель окклюзии MCA была создана у крыс в 1981 г.11,12 и заменена моделью MCAO без краниэктомии в 1989 г.4. Первоначальная транскраниальная окклюзия MCA имела широкое хирургическое поле, так что вся скуловая дуга была удалена, а мышцы вытянуты латерально. Местные ткани после операции опухли, что вызвало стресс и снижение потребления пищи для животных. В нашей модифицированной транскраниальной модели MCAO разрез мене...
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Раскрытие информации
Все авторы не имеют конфликта интересов.
Благодарности
Авторы благодарят Кэти Гейдж за редакционную поддержку. Схемы фигур были созданы с помощью BioRender.com. Это исследование было поддержано средствами кафедры анестезиологии (Медицинский центр Университета Дьюка) и грантами NIH (NS099590, HL157354, NS117973 и NS127163).
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Материалы
| Имя | Компания | Каталожный номер | Комментарии |
|---|---|---|---|
| 0,25% бупивакаин | Hospira | NDC 0409-1159-18 | |
| 0,9% хлорид натрия | ICU Medical | NDC 0990-7983-03 | |
| 2,3,5-трифенилтетразолия хлорид (TTC) | Sigma или любой доступный поставщик | ||
| 20 G Внутривенный катетер | BD | 381534 | 20 GA 1.6 IN |
| 30 G игла | BD | 305106 | |
| 4-0 шелковый шов | Look | SP116 | Черный плетеный шелковый |
| 8-0 шов с иглой | Ethilon | 2822G | |
| Спиртовые тампоны | BD | 326895 | |
| Индукционная коробка для анестезии | Любой подходящий поставщик | Pexiglass make | |
| Электрическая шлифовальная машина | JSDA | JD 700 | |
| Высокотемпературный петлевой наконечник для прижигания | Bovie | AA03 | |
| Изофлуран | Covetrus | NDC 11695-6777-2 | |
| Лазерный допплеровский монитор перфузии | Moor Instruments | moorVMS-LDF1 | |
| Лубрикантная глазная мазь | Bausch + Lomb | 339081 | |
| Mouse ректальный зонд | Physitemp | RET-3 | |
| Закись азота | Аэрогаз | UN1070 | |
| Отоскоп | Welchallyn | 728 | 2,5 мм Зеркало Отоскоп служил ларингоскопом для визуализации голосовых связок у мышей |
| Кислород | Воздушный газ | UN1072 | |
| Повидон-йод | CVS | 955338 | |
| Рекуперация бокс | Brinsea | TLC eco | |
| Rimadyl (карпрофен) | Zoetis | 6100701 | Инъекционный 50 мг/мл |
| Аппарат искусственной вентиляции легких для грызунов | Kent Scientific | Rodent Jr. | |
| Регулятор температуры | Physitemp | TCAT-2DF | |
| Тройной антибиорик и обезболивающий | CVS | NDC 59770-823-56 | |
| Испаритель | RWD | R583S |
Ссылки
- Tsao, C. W., et al. Heart disease and stroke statistics-2022 update: a report from the American Heart Association. Circulation. 145 (8), e153(2022).
- Nogueira, R. G., et al. Thrombectomy 6 to 24 hours after stroke with a mismatch between deficit and infarct. The New England Journal of Medicine. 378 (1), 11-21 (2018).
- Fisher, M., Savitz, S. I. Pharmacological brain cytoprotection in acute ischaemic stroke-renewed hope in the reperfusion era. Nature Reviews Neurology. 18 (4), 193-202 (2022).
- Longa, E. Z., Weinstein, P. R., Carlson, S., Cummins, R. Reversible middle cerebral artery occlusion without craniectomy in rats. Stroke. 20 (1), 84-91 (1989).
- Knauss, S., et al. A semiquantitative non-invasive measurement of PcomA patency in C57BL/6 mice explains variance in ischemic brain damage in filament MCAo. Frontiers in Neuroscience. 14, 576741(2020).
- Yang, Z., et al. Post-ischemia common carotid artery occlusion worsens memory loss, but not sensorimotor deficits, in long-term survived stroke mice. Brain Research Bulletin. 183, 153-161 (2022).
- Wang, Z., et al. Increasing O-GlcNAcylation is neuroprotective in young and aged brains after ischemic stroke. Experimental Neurology. 339, 113646(2021).
- Jiang, M., et al. XBP1 (X-box-binding protein-1)-dependent O-GlcNAcylation Is neuroprotective in ischemic stroke in young mice and its impairment in aged mice is rescued by thiamet-G. Stroke. 48 (6), 1646-1654 (2017).
- Li, X., et al. Single-cell transcriptomic analysis of the immune cell landscape in the aged mouse brain after ischemic stroke. Journal of Neuroinflammation. 19 (1), 83(2022).
- Li, X., et al. Beneficial effects of neuronal ATF6 activation in permanent ischemic stroke. Frontiers in Cellular Neuroscience. 16, 1016391(2022).
- Tamura, A., Graham, D. I., McCulloch, J., Teasdale, G. M. Focal cerebral ischaemia in the rat: 2. Regional cerebral blood flow determined by [14C]iodoantipyrine autoradiography following middle cerebral artery occlusion. Journal of Cerebral Blood Flow & Metabolism. 1 (1), 61-69 (1981).
- Tamura, A., Graham, D. I., McCulloch, J., Teasdale, G. M. Focal cerebral ischaemia in the rat: 1. Description of technique and early neuropathological consequences following middle cerebral artery occlusion. Journal of Cerebral Blood Flow & Metabolism. 1 (1), 53-60 (1981).
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Перепечатки и разрешения
