Здесь мы представляем протокол высокоэффективного производства трансгенных волосатых корней сои.
Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.
Методическая статья
Трансформация волосатого корня сои для анализа функции генов
В этой статье
Краткое содержание
Аннотация
Соя (Glycine max) является ценной культурой в сельском хозяйстве, которая имеет тысячи промышленных применений. Корни сои являются основным местом взаимодействия с почвенными микробами, которые образуют симбиоз для фиксации азота и патогенов, что делает исследования, связанные с генетикой корней сои, первостепенной важностью для улучшения ее сельскохозяйственного производства. Генетическая трансформация волосатых корней сои (HRs) опосредована штаммом Agrobacterium rhizogenes NCPPB2659 (K599) и является эффективным инструментом для изучения функции генов в корнях сои, занимая всего 2 месяца от начала до конца. Здесь мы приводим подробный протокол, в котором описывается метод сверхэкспрессии и подавления гена, представляющего интерес для HR сои. Эта методология включает стерилизацию семян сои, заражение семядолей K599, а также отбор и сбор генетически трансформированных HR для выделения РНК и, при необходимости, анализа метаболитов. Пропускная способность подхода достаточна для одновременного изучения нескольких генов или сетей и может определить оптимальные инженерные стратегии до перехода к долгосрочным подходам к стабильной трансформации.
Введение
Соя (Glycine max) является одной из самых ценных культур в сельском хозяйстве. Он имеет тысячи коммерческих и промышленных применений, таких как продукты питания, корма для животных, масло, а также в качестве источника сырья для производства1. Его способность формировать симбиотические отношения с азотфиксирующими почвенными микроорганизмами, а именно ризобиями, еще больше повышает важность изучения генетики сои2. Например, тонкая настройка азотфиксирующих свойств в корнях сои может привести к сокращению выбросов углерода и значительно снизить потребность в азотных удобрениях3. Таким обра....
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Протокол
ПРИМЕЧАНИЕ: Рекомендуется, чтобы все процессуальные действия проводились в стерильных условиях.
1. Стерилизация семян сои
- В шкаф биобезопасности поместите 16-20 круглых семян сои Williams 82 в первозданном состоянии (т. е. без трещин или пятен) в центрифужную пробирку объемом 50 мл.
- Добавьте 30 мл 70% изопропилового спирта, осторожно встряхните в течение 30 с, а затем сцедите спирт.
- Осторожно встряхните семена с 30 мл 10% отбеливателя в течение 10 с и оставьте семена в растворе на 5 минут при комнатной температуре (RT, 25 °C). Через 5 минут слейте отбеливатель.
- Повторите встряхивание ....
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Результаты
Репрезентативные результаты взяты из опубликованных данных19,20. Результаты колонии ПЦР (цПЦР) трансформированной K599 Agrobacterium показаны на рисунке 1. Как видно из положительных колоний на рисунке 1, интересующий ген был обнаружен с помощью кПЦР (рис. 1А). Тем не менее, от одной трети до половины колоний были отрицательными для скрининга гена VirD2 (
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Обсуждение
В течение последнего десятилетия был разработан метод HR сои в качестве мощного инструмента для изучения генов, участвующих в фиксации азота 22,23, биотической и абиотической стрессоустойчивости 24,25 и путях биосинтеза метаболитов 26,27. Знание того, как растения продуцируют метаболиты, имеет множество преимуществ для сельскохозяйственного произв.......
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Раскрытие информации
Авторам раскрывать нечего.
Благодарности
Это исследование было профинансировано Советом по естественным наукам и инженерным исследованиям Канады (NSERC) с номером гранта RGPIN-2020-06111 и щедрым пожертвованием Брэда Лейса. Мы хотели бы поблагодарить Уэйна Пэррота (Университет Джорджии) за K599 Agrobacterium и предварительный протокол, а также лабораторию Nakagawa & Hachiya (Университет Симанэ) за пустые векторы pGWB2, pGWB6 и pANDA35HK.
....Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Материалы
| Имя | Компания | Каталожный номер | Комментарии |
|---|---|---|---|
| Ацетосирингон | Кайман | 23224 | |
| Отбеливатель | лаво | 21124 | |
| ДМСО | Биореагенты Фишера | 195679 | |
| Гельзан | Фитотех | HYY3251089A | |
| Гигромицин | Фитотех | HHA0397050B | |
| Изопропиловый спирт | Фишер химический | 206462 | |
| Канамицин | Фитотех | SQS0378007G | |
| LB порошок | Биореагенты Фишера | 200318 | |
| порошок МС | Кессон лаборатории | 2210001 | |
| Na2HPO4 | Fisher биореагенты | 194171 | |
| NaCl | Fisher химический | 192946 | |
| чашки Петри | Fisherbrand | 08-757-11 | 100 мм x 25 мм |
| Фосфинотрицин | Cedarlane | P034-250MG | |
| REDExtract-N-Amp Набор для ПЦР | Sigma | R4775 | |
| Sucrose | Bioshop | 2D76475 | |
| Timentin | Caisson labs | 12222002 | |
| Vitamins | Caisson labs | 2211010 |
Ссылки
- Li, S., et al. Optimization of Agrobacterium-mediated transformation in soybean. Frontiers in Plant Science. 8, 246(2017).
- Elhady, A., Hallmann, J., Heuer, H. Symbiosis of soybean with nitrogen fixing bacteria ....
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Перепечатки и разрешения
