Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.

Методическая статья

Стабилизированное окно для прижизненной визуализации поджелудочной железы мышей

2.8K просмотров

⸱

DOI:

10.3791/65498

⸱

6 октября 2023 г.

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Surgery, Einstein College of Medicine / Montefiore Medical Center, 2Department of Pathology, Einstein College of Medicine / Montefiore Medical Center, 3Integrated Imaging Program for Cancer Research, Einstein College of Medicine / Montefiore Medical Center, 4Department of Anatomy and Structural Biology, Einstein College of Medicine / Montefiore Medical Center, 5Breast Center, Peking University People's Hospital, 6Department of Microbiology & Immunology, Einstein College of Medicine / Montefiore Medical Center, 7Montefiore Einstein Cancer Center, Einstein College of Medicine / Montefiore Medical Center, 8Cancer Dormancy and Tumor Microenvironment Institute, Albert Einstein College of Medicine / Montefiore Medical Center, 9Gruss-Lipper Biophotonics Center, Einstein College of Medicine / Montefiore Medical Center, 10Department of Cell Biology, Einstein College of Medicine / Montefiore Medical Center

* These authors contributed equally

В этой статье

Краткое содержание

Представлен протокол хирургической имплантации стабилизированного постоянного оптического окна для субклеточной визуализации поджелудочной железы мышей, позволяющий проводить серийные и лонгитюдные исследования здоровой и больной поджелудочной железы.

Аннотация

Физиология и патофизиология поджелудочной железы сложны. Заболевания поджелудочной железы, такие как панкреатит и аденокарцинома поджелудочной железы (PDAC), характеризуются высокой заболеваемостью и смертностью. Прижизненная визуализация (ВВИ) — это мощный метод, позволяющий получать изображения тканей с высоким разрешением как в здоровом, так и в больном состоянии, что позволяет наблюдать за динамикой клеток в режиме реального времени. ИВИ поджелудочной железы мышей представляет собой серьезную проблему из-за глубокой висцеральной и податливой природы органа, что делает его очень подверженным повреждениям и артефактам движения.

Здесь описан процесс имплантации S-табилизированного W-индудля визуализациимышиного P-ancreas(SWIP). SWIP позволяет проводить внутривенное введение поджелудочной железы мышей в нормальном здоровом состоянии, во время трансформации здоровой поджелудочной железы в острый панкреатит, индуцированный церулеином, и при злокачественных состояниях, таких как опухоли поджелудочной железы. В сочетании с генетически мечеными клетками или введением флуоресцентных красителей, SWIP позволяет измерять динамику одиночных клеток и субклеток (включая одноклеточную и коллективную миграцию), а также получать последовательные изображения одной и той же области интереса в течение нескольких дней.

Способность улавливать миграцию опухолевых клеток имеет особое значение, поскольку основной причиной смертности, связанной с раком, при PDAC является подавляющее метастатическое бремя. Понимание физиологической динамики метастазирования при ОАК является критической неудовлетворенной потребностью и имеет решающее значение для улучшения прогноза пациента. В целом, SWIP обеспечивает улучшенную стабильность визуализации и расширяет область применения IVI при здоровых заболеваниях поджелудочной железы и злокачественных заболеваниях поджелудочной железы.

Введение

Доброкачественные и злокачественные заболевания поджелудочной железы потенциально опасны для жизни, при этом существуют значительные пробелы в понимании их патофизиологии. Панкреатит – воспаление поджелудочной железы – является третьей по значимости причиной госпитализаций и повторных госпитализаций в связи с желудочно-кишечными заболеваниями в США и связан со значительной заболеваемостью, смертностью и социально-экономическим бременем. Протоковая аденокарцинома поджелудочной железы (PDAC), занимающая третье место среди основныхпричин смертности, связанной с раком, является причиной большинства злокачественных новообразований поджелудочной железы3 и предвещает низкую 5-летнюю выживаемость — всего 11%2. Основной причиной смертности, связанной с раком, при PDAC является чрезмерная метастатическая нагрузка. К сожалению, у большинства пациентов наблюдается метастатическое заболевание. Таким образом, понимание динамики метастазирования при PDAC является критической неудовлетворенной потребностью в области исследования рака.

Механизмы, лежащие в основе воспаления и метастатического каскада поджелудочной железы, плохо изучены. Основной причиной этого пробела в знаниях является невозможность наблюдать клеточную динамику поджелудочной железы in vivo. Непосредственное наблюдение за этой клеточной динамикой обещает выявить важнейшие мишени для использования и улучшения диагностики и лечения пациентов с заболеваниями поджелудочной железы.

Прижизненная визуализация (ВВИ) — это метод микроскопии, который позволяет исследователям визуализировать и изучать биологические процессы у живых животных в режиме реального времени. IVI позволяет с высоким разрешением напрямую визуализировать динамику внутриклеточной и микроокружающей среды in vivo и в естественной среде рассматриваемого биологического процесса. Таким образом, IVI позволяет in vivo наблюдать за здоровыми и патологическими процессами.

Современные методы визуализации всего тела, такие как МРТ, ПЭТ и КТ, обеспечивают превосходное изображение целых органов и могут выявлять патологии еще до появления клинических симптомов4. Однако они не способны достичь одноклеточного разрешения или выявить самые ранние стадии заболевания – панкреатита или злокачественных новообразований.

В предыдущих исследованиях для наблюдения за доброкачественными и злокачественными заболеваниями кожи5,6, молочной железы7, легких8, печени9, головного мозга10 и поджелудочной железы 11 использовалось одноклеточное разрешение, что привело к пониманию механизмов прогрессирования заболевания12. Тем не менее, поджелудочная железа мышей создает значительные препятствия для достижения разрешения одной клетки с помощью IVI, в первую очередь из-за ее глубокого висцерального расположения и высокой податливости. Кроме того, это разветвленный, диффузно распределенный орган в брыжейке, который соединяется с селезенкой, тонкой кишкой и желудком, что затрудняет доступ к нему. Ткань также очень чувствительна к движению, вызванному прилегающей перистальтикой и дыханием. Минимизация движения поджелудочной железы имеет важное значение для микроскопии с одноклеточным разрешением, поскольку артефакты движения даже в несколько микрон могут размывать и искажать изображения, что делает невозможным отслеживание динамики отдельных клеток13.

Для проведения ВВИ хирургическим путем должно быть имплантировано окно визуализации брюшной полости (AIW) 9,11. Для хирургической имплантации AIW в брюшную стенку вшивается металлическая оконная рама. После этого интересующий орган крепится к каркасу с помощью цианоакрилатного клея. Хотя этого достаточно для некоторых жестких внутренних органов (например, печени, селезенки, ригидных опухолей), попытки визуализации здоровой поджелудочной железы мышей нарушаются из-за неоптимальной латеральной и осевой стабильности из-за податливой текстуры ткани и сложной архитектуры14. Чтобы устранить это ограничение, Park et al.14 разработали окно визуализации, специально предназначенное для здоровой поджелудочной железы. Это окно визуализации поджелудочной железы (PIW) сводит к минимуму влияние кишечника и дыхания за счет горизонтальной металлической полки в оконной раме, прямо под покровным стеклом, стабилизируя ткань и поддерживая ее контакт с покровным стеклом. Несмотря на то, что PIW обеспечивает повышенную латеральную стабильность, мы обнаружили, что это окно по-прежнему демонстрирует осевой дрейф и дополнительно препятствует визуализации крупных солидных опухолей из-за узкого зазора между металлической полкой и покровным стеклом15.

Чтобы устранить эти ограничения, мы разработали S-табилизированный W-индудля визуализации мышиного P-ancreas(SWIP), имплантируемое окно визуализации, способное обеспечить стабильную долгосрочную визуализацию как здоровой, так и больной поджелудочной железы (рис. 1)15. Здесь мы предоставляем исчерпывающий протокол хирургической процедуры, используемой для имплантации SWIP. Хотя основной целью было изучение динамических механизмов, участвующих в метастазировании, этот метод также может быть использован для изучения различных аспектов биологии и патологии поджелудочной железы.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

Все процедуры, описанные в этом протоколе, были выполнены в соответствии с руководящими принципами и правилами использования позвоночных животных, включая предварительное одобрение Институционального комитета по уходу за животными и использованию животных Медицинского колледжа Альберта Эйнштейна (IACUC).

1. Пассивация окон

ПРИМЕЧАНИЕ: Пассивация нержавеющей стали очищает металл от загрязнений и создает тонкий оксидный слой, который значительно повышает биосовместимость металла с мягкими тканями, даже по сравнению с титаном16.

  1. Начните процесс пассивации, промыв оптические оконные рамы 1% (w/v) раствором ферментативно-активного моющего средства.
  2. Погрузите рамы в 5%-ный раствор гидроксида натрия при температуре 70 °C на 30 минут в стеклянную банку.
  3. Выньте рамки и промойте их деионизированной водой.
  4. Погрузите рамы в 7%-ный раствор лимонной кислоты при температуре 55 °C на 10 минут в новую стеклянную банку.
  5. Снимите рамки и снова промойте их деионизированной водой.
  6. Повторите шаг 1.2 и, наконец, промойте оконные рамы деионизированной водой в последний раз.

2. Подготовка к имплантации опухоли или операции на окне

ПРИМЕЧАНИЕ: Для исследования опухолей поджелудочной железы опухолевые клетки должны быть имплантированы и позволить им вырасти в явные опухоли. Для визуализации опухолевых клеток in vivo рекомендуется использовать клетки, которые были генетически изменены для экспрессии флуоресцентных белков, таких как Dendra2. Использование флуоресцентных белковых меток, которые являются яркими, смягчит потенциальные проблемы с автофлуоресценцией тканей. Другие потенциальные флуоресцентные белки, красители и генетически кодируемые флуоресцентные модели мышей, которые могут быть использованы, обсуждались в других статьях17,18. Чтобы предотвратить загрязнение операционного поля, выполняйте хирургическую процедуру в вытяжке или ламинарном кабинете и убедитесь, что отдельные области используются для подготовки, операции и восстановления.

  1. Перед операцией простерилизуйте все хирургические инструменты в автоклаве и, при необходимости, используйте стерилизатор горячими шариками для последующих процедур. Убедитесь, что операция проводится только с помощью наконечников.
  2. Включите хирургическую прокладку с подогревом и стерилизатор шариков и подождите, пока они не достигнут соответствующей рабочей температуры. Температуру грелки следует контролировать с помощью поверхностного термометра, чтобы избежать возможных ожогов. Положите стерильную ткань на грелку, если температуру невозможно должным образом контролировать.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Температура тела во время коротких процедур (≤20 мин), таких как имплантация опухоли и окна, минимально снижается при использовании хирургической подушки с подогревом. Однако более длительные периоды анестезии, например, во время длительной таймлапс-визуализации, требуют, чтобы мышь была помещена в обогреваемую камеру для поддержания температуры тела.
  3. Обезболивайте мышь 5% изофлураном в наркозной камере.
  4. Критический шаг: Снизьте уровень анестезии до 2%, как только мышь потеряет сознание. Внимательно следите за уровнем анестезии и жизненно важными показателями мыши (например, с помощью пульсоксиметра)19.
  5. Нанесите маленькую каплю смазки для глаз на каждый глаз мыши, чтобы предотвратить высыхание роговицы.
  6. Перед операцией обильно нанесите крем для депиляции на левую верхнюю часть живота, чтобы удалить волосы. Через 20 секунд используйте смоченную папиросную бумагу, чтобы плотно вытереть волосы и крем для депиляции. Повторяйте процесс по мере необходимости до тех пор, пока все волосы не будут удалены из области операции.
  7. Ввести 10 мкл бупренорфина (0,1 мг/кг), разведенного в 90 мкл PBS, подкожно, для обеспечения предоперационной анальгезии.

3. Имплантация опухоли поджелудочной железы

  1. Готовят аликвоты опухолевых клеток в нужной концентрации (исходя из времени удвоения опухолевых клеток). Поместите клеточную суспензию в инсулиновый шприц и держите на льду. Для следования этому протоколу используют 106 сингенных опухолевых клеток KPC 20, взвешенных в максимуме 50 мкл PBS, в соответствии с протоколом ортотопической инъекции, адаптированным из Erstad etal.21
    ПРИМЕЧАНИЕ: Эта клеточная линия, введенная в такой концентрации, обычно вызывала пальпируемые или соответственно большие опухоли к 10-14 дням. Субклоны этой клеточной линии и других клеточных линий поджелудочной железы должны быть оценены на наличие соответствующих концентраций и сроков для получения опухолей соответствующего размера.
  2. Вымойте руки с использованием антисептического мыла.
  3. Перед каждой новой операцией надевайте новые стерильные перчатки.
  4. Перенесите мышь в стерильный хирургический капюшон и поместите ее в положение частичного правого бока пролежни.
  5. Закрепите конечности бумажной лентой.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Правильное использование инструментов важно на протяжении всей процедуры. Примеры того, как держать щипцы, ножницы Кастровьехо и вакуумный захват, показаны на рисунке 2A-C.
  6. Простерилизуйте брюшную полость антисептиком (рисунок 2D).
  7. Убедитесь, что животное полностью обезболино, выполнив тест на защемление пальца ноги.
  8. Сделайте левый подреберный разрез на коже диаметром 10-15 мм с помощью щипцов и ножниц Кастровьехо (рис. 2E).
  9. Контролируйте гемостаз с помощью ватных палочек или шприц-ручки для прижигания, когда это необходимо.
  10. Осторожно разделите нижележащую мышцу щипцами и ножницами Кастровьехо, чтобы войти в брюшину (Рисунок 2F).
  11. С помощью стерильных ватных тампонов атравматично экстернализовать поджелудочную железу и селезенку.
  12. Растопырите поджелудочную железу так, чтобы не было складок (рис. 2G).
  13. Определите желаемое место инъекции опухоли в теле или хвосте поджелудочной железы (вдали от кровеносных сосудов).
  14. Критический шаг: После тщательного позиционирования поджелудочной железы используйте щипцы, чтобы обеспечить натяжение ткани, и введите наконечник инсулинового шприца скосом вверх в нужный участок поджелудочной железы на глубину 4-5 мм (Рисунок 2H).
  15. Медленно вводят раствор опухолевых клеток. Найдите небольшой пузырь, подтверждающий успешную инъекцию (рисунок 2I).
  16. Осторожно верните поджелудочную железу в брюшную полость, не нарушая пузырь для инъекции опухолевых клеток (рис. 2J).
  17. Используя рассасывающиеся полидиоксаноновые нити 5-0, сначала закройте мышечный слой, а затем кожу прерывистыми швами (рис. 2K-N).
  18. Покройте разрез цианоакрилатным клеем (рис. 2O), затем верните мышь в чистую клетку под нагревательной лампой для восстановления. Добавляйте антибиотики в питьевую воду, чтобы предотвратить инфекцию. Наблюдайте за мышами и дайте им полностью восстановиться после операции.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Антибиотики назначаются в соответствии с требованиями протокола IACUC. Все животные размещаются индивидуально.
  19. Дайте опухоли развиваться в течение 10-14 дней, пока она не пропальпируется через брюшную стенку.

4. Операция на окне поджелудочной железы

  1. Когда животные будут готовы к визуализации, начните операцию по имплантации окна. Для начала вымойте руки с антисептическим мылом.
  2. Перед каждой новой операцией надевайте свежие стерильные перчатки.
  3. На хирургической подставке с подогревом поместите мышь в положение правого бокового пролежня, чтобы обнажить левый живот.
  4. Прикрепите передние и задние конечности мыши к нагретому операционному этапу краниально и каудально с помощью бумажной ленты. Убедитесь, что селезенка (под кожей) видна в пределах операционного поля (Рисунок 3A).
  5. Для сохранения стерильности распакуйте все хирургические инструменты в капюшоне.
  6. Продезинфицируйте место операции, промыв кожу мыши обильным антисептиком.
  7. Убедитесь, что животное полностью обезболино, выполнив тест на защемление пальца ноги.
  8. Критический шаг: Приподнимите кожу левого верхнего квадранта живота щипцами и сделайте круговой разрез на коже и мускулатуре диаметром ~10 мм с помощью ножниц Кастровьехо (рис. 3B, C).
  9. Остановите кровотечение и поддерживайте гемостаз с помощью ватных палочек или шприца, если это необходимо.
  10. Локализовать поджелудочную железу, которая прикреплена к селезенке, и определить направление, в котором поджелудочная железа лежит внутри разреза, чтобы решить, где следует разместить поддерживающую вышивку крестом.
  11. Используя шелковый шов 5-0, поместите первый стежок в нужном месте в мышечном слое. Завяжите этот конец 3-5 узлами. (Рисунок 3D,E)
  12. Продолжайте накладывать швы непосредственно поперек разреза. Отрежьте и оставьте хвостик ~5 см (Рисунок 3F).
  13. Повторите шаги 4.11 и 4.12 перпендикулярно первому стежку (рис. 3G,H).
  14. Критический шаг: Осторожно приподнимите и расположите поджелудочную железу над вышивкой крестиком (рис. 3I, J). Следите за тем, чтобы не повредить поджелудочную железу во время манипуляции.
  15. Критический этап: Используя шелковый шов 5-0, выполните кисетный стежок на расстоянии ~1 мм от отверстия по окружности, переплетая слой кожи и мышц (Рисунок 3K).
  16. Расположите оконную раму так, чтобы края круглого разреза находились в пазе окна (Рисунок 3L).
  17. Закрепите имплантированное окно, плотно завязав шелк 5-0.
  18. В шприц объемом 1 мл налить 100 мкл жидкого цианоакрилатного клея.
  19. Высушите ткань, применяя деликатный поток сжатого воздуха в течение ~10 с.
  20. Обхватите оконную раму за внешний край щипцами и осторожно приподнимите, чтобы обеспечить отделение поджелудочной железы от нижней поверхности оконной рамы.
  21. Критический шаг: Нанесите тонкий слой жидкого цианоакрилатного клея вдоль ниши окна (Рисунок 3M). Следите за тем, чтобы клей не попал на ткани поджелудочной железы.
  22. С помощью вакуумных звукоснимателей поднимите 5-миллиметровый покровный щиток.
  23. Осторожно поместите защитное стекло внутрь углубления в центре оптической оконной рамы. Удерживайте с легким давлением, позволяя цианоакрилатному клею схватиться (~25 с).
  24. Отделите покровный листок от вакуумных пикапов с помощью щипцов.
  25. Затяните швы для вышивки крестиком, чтобы поджелудочная железа плотно прилегала к покровному стеблю (Рисунок 3N, O). Примечание: Не перетягивайте вышивку крестиком, так как это может привести к повреждению и ишемии поджелудочной железы.
  26. Обрежьте концы шва.
  27. Снимите скотч с мыши.
  28. Выключите испаритель изофлурана.
  29. Переместите мышь в чистую клетку или непосредственно к прижизненному микроскопу.
  30. Поместите животных в индивидуальное жилище после операции на окне и наблюдайте за ними до полного выздоровления.
  31. Затем визуализация выполняется на двухлазерном многофотонном микроскопе, как мы описали ранее 22,23,24 Для длительных сеансов визуализации мышь помещается в обогреваемую камеру для поддержания температуры тела и снабжается поддерживающими жидкостями в соответствии со стандартами IACUC.

5. Церулеин для индукции панкреатита

  1. Чтобы исследовать начало панкреатита, лечат здоровых мышей церулеином после имплантации SWIP. Убедитесь, что мышей голодают в течение 14-18 ч и дают им воду вволю перед введением церулеина.
  2. Вводят 50 мкг/кг церулеина в 100 мкл стерильного 1x DPBS внутрибрюшинно с интервалом в 1 ч до восьми инъекций. Вводят контрольным мышам эквивалентный объем 1x DPBS, вводимый внутрибрюшинно.
  3. После визуализации жертвуют мышей через 24 ч после первой инъекции при вывихе шейки матки в соответствии со стандартами IACUC.
  4. Выполните визуализацию на двухлазерном многофотонном микроскопе, как описано ранее 22,23,24. Во время длительных сеансов визуализации поместите мышь в обогреваемую камеру, чтобы поддерживать температуру тела и обеспечить ее поддерживающими жидкостями в соответствии со стандартами IACUC.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

На рисунке 1, адаптированном из Du et al.15, показаны кадры из покадрового видеоролика IVI мышиной поджелудочной железы. Некоторое движение тканей можно наблюдать в течение начального периода успокоения (первый час визуализации, рис. 1А). Однако при продолжении визуализации после этого периода успокоения (>75 мин) мы наблюдали увеличение латеральной и осевой стабильности (рис. 1B). Сравнение стабильности S...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

Протокол SWIP, описанный здесь, обеспечивает улучшенный метод стабилизации тканей поджелудочной железы с использованием техники вышивки корзиной крестиком. Ранние окна визуализации брюшной полости (AIW) позволяли проводить прижизненную визуализацию (IVI) внутренних органов брюшной полости, но не ограничивали адекватно движение мягких тканей, таких как поджелудочная железа. В ответ на это Park et al. разработали окно визуализации поджелудочной железы (PIW), которое включает в себя горизонтальную металлическую полку и позв...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

У авторов нет конфликта интересов, который можно было бы раскрыть.

Благодарности

Благотворительный фонд Эвелин Липпер, Центр биофотоники Грусса-Липпера, Программа комплексной визуализации для исследования рака, стипендия NIH T-32 (CA200561) и грант Программы исследования рака поджелудочной железы Министерства обороны США (PCARP) PA210223P1.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
1% (в/об) раствор ферментно-активного моющего средстваAlconox IncNAКонцентрированное, анионное моющее средство с протеазными энзимами для ручной и ультразвуковой очистки
5% (в/об) раствор гидроксида натрияSigma-AldrichS8045Пассивация реагента
5 мм покровное стеклоЭлектронная микроскопия Sciences72296-05Круглое стекло Coverslips 
7% (w/v) раствор лимонной кислотыSigma-Aldrich 251275Пассивационный реактив
28G 1 мл BD Инсулиновый шприцBD329410Шприц для клеточных инъекций
Байтрил 100 (энрофлоксацин)Bayer (Santa Cruz Biotechnology)sc-362890RxАнтибиотик
Настольная термолампа ТермолампаMcMaster-Carr3349K51Тепловая лампа
Бупренорфин 0,3 мг/млCovetrus Северная Америка059122Бупренорфин Analgesia
Castroviejo Изогнутые ножницыWorld Precision InstrumentsWP2220Ножницы для резки ткани
C57BL/6J MouseJackson Laboratory000664 Мышь C57BL/6J
Раствор хлоргексидинаDurvet7-45801-10258-3Раствор дезинфицирующего средства хлоргексидина
Канистра сжатого воздухаFalconDPSJB-12Сжатый воздух для сушки тканей
Цианоакрилат - Гель СуперклейСкобы 234790-6Клей для кожи
Цианоакрилат - Жидкий суперклейСкобыLOC1647358Клей Coverslip
DPBS 1xCorning21-031-CVDPBS для инъекций церуелина/клеток
Gemini Cautery KitHarvard Apparatus726067Cautery Pen
Germinator 500CellPoint ScientificGER  5287-120Встерилизатор шариков
Graefe микрорассекающие щипцы; Зубчатый; небольшой изгиб; Ширина наконечника 0,8 мм; Длина 4 дюймаRoboz SurgicalRS-5135 Graefe Микродиссекционные щипцы
Микроскоп для визуализацииNANA See Entenberg et al. 2011 [27]
Программное обеспечение для визуализацииNANASee Entenberg et al. 2011 [27]
Изоэтезия (изофлуран)Henry Schein Animal Health50033Изофлурановая анестезия
Kim WipesFisher Scientific06-666-A Салфетки Ким
Лабораторная лентаFisher Scientific159015RЛабораторная лента
Набор для препарирования мышиWorld Precision InstrumentsMOUSEKITХирургические инструменты
Мышиная лапа Пульсоксиметр ДатчикKent Scientific CorpoMSTAT Датчик-MSEПульсоксиметр
мыши SurgisuiteKent ScientificSURGI-M04Платформа с подогревом
Nair Эпиляция ЛосьонAmazonB001RVMR7KЛосьон для депиляции
КислородTechAirOX TMКислород
PERMA-HAND Черные плетеные шелковые швы, ETHICON Размер 5-0VWR95056-872Шелковый шовный материал
фосфатный буферный физиологический раствор 1xLife Technologies10010-023PBS
PhysioSuite SystemKent ScientificPhysioSuite Платформа с подогревом Контролер
PuralubeHenry Schein Animal Health008897Eye Lubricant
Puritan Нестерильные ватные тампоны Fisher Scientific867WCNOGLUEВатные палочки
SHARP Прецизионные барьерные наконечники, для P-100, 100 и микро; LDenville Scientific Inc.P1125100 &микро; L Наконечники для пипеток
тетраметилродамина изотиоцианат– DextranSigma-AldrichT1287-500MGСосудистая этикетка
Пластина для крепления окнаNANA Изготовленная на заказ пластина для размещения окна на предметном столике микроскопа. Пластина изготовлена из прокладки из нержавеющей стали толщиной 0,008. Размеры пластины см. в Entenberg et al., 2018 [8].
Оконная рамаNANAОкно состоит из стальной рамы с центральным отверстием, которое принимает покровное стекло толщиной 5 мм. Канавка 1,75 мм по окружности рамы обеспечивает пространство для прилегания мышц брюшины и слоев кожи. См.: Entenberg et al., 2018 [8].

Ссылки

  1. Peery, A. F., et al. Burden and cost of gastrointestinal, liver, and pancreatic diseases in the United States: Update 2021. Gastroenterology. 162 (2), 621-644 (2022).
  2. Siegel, R. L., Miller, K. D., Wagle, N. S., Jemal, A. Cancer statistics, 2023. CA: A Cancer Journal for Clinicians. 73 (1), 17-48 (2023).
  3. Adamska, A., Domenichini, A., Falasca, M. Pancreatic ductal adenocarcinoma: Current and evolving therapies. International Journal of Molecular Sciences. 18 (7), 1338(2017).
  4. Coste, A., Oktay, M. H., Condeelis, J. S., Entenberg, D. Intravital imaging techniques for biomedical and clinical research. Cytometry A. 97 (5), 448-457 (2020).
  5. Peters, N. C., et al. In vivo imaging reveals an essential role for neutrophils in leishmaniasis transmitted by sand flies. Science. 321 (5891), 970-974 (2008).
  6. Alexander, S., Koehl, G. E., Hirschberg, M., Geissler, E. K., Friedl, P. Dynamic imaging of cancer growth and invasion: a modified skin-fold chamber model. Histochemistry and Cell Biology. 130 (6), 1147-1154 (2008).
  7. Harney, A. S., et al. Real-time imaging reveals local, transient vascular permeability, and tumor cell intravasation stimulated by TIE2hi macrophage-derived VEGFA. Cancer Discovery. 5 (9), 932-943 (2015).
  8. Entenberg, D., et al. A permanent window for the murine lung enables high-resolution imaging of cancer metastasis. Nature Methods. 15 (1), 73-80 (2018).
  9. Ritsma, L., et al. Intravital microscopy through an abdominal imaging window reveals a pre-micrometastasis stage during liver metastasis. Science Translational Medicine. 4 (158), 158ra145(2012).
  10. Park, K., You, J., Du, C., Pan, Y. Cranial window implantation on mouse cortex to study microvascular change induced by cocaine. Quantitative Imaging in Medicine and Surgery. 5 (1), 97-107 (2015).
  11. Beerling, E., Oosterom, I., Voest, E., Lolkema, M., van Rheenen, J. Intravital characterization of tumor cell migration in pancreatic cancer. Intravital. 5 (3), e1261773(2016).
  12. Entenberg, D., Oktay, M. H., Condeelis, J. S. Intravital imaging to study cancer progression and metastasis. Nature Reviews: Cancer. 23 (1), 25-42 (2023).
  13. Entenberg, D., et al. time-lapsed, large-volume, high-resolution intravital imaging for tissue-wide analysis of single cell dynamics. Methods. 128, 65-77 (2017).
  14. Park, I., Hong, S., Hwang, Y., Kim, P. A novel pancreatic imaging window for stabilized longitudinal in vivo observation of pancreatic islets in murine model. Diabetes & Metabolism Journal. 44 (1), 193-198 (2020).
  15. Du, W., et al. SWIP-a stabilized window for intravital imaging of the murine pancreas. Open Biology Journal. 12 (6), 210273(2022).
  16. DeBold, T. A. M., James, W. How To Passivate Stainless Steel Parts. , https://www.mmsonline.com/articles/how-to-passivate-stainless-steel-parts (2003).
  17. Drobizhev, M., Makarov, N. S., Tillo, S. E., Hughes, T. E., Rebane, A. Two-photon absorption properties of fluorescent proteins. Nature Methods. 8 (5), 393-399 (2011).
  18. Ueki, H., Wang, I. H., Zhao, D., Gunzer, M., Kawaoka, Y. Multicolor two-photon imaging of in vivo cellular pathophysiology upon influenza virus infection using the two-photon IMPRESS. Nature Protocols. 15 (3), 1041-1065 (2020).
  19. Ewald, A. J., Werb, Z., Egeblad, M. Monitoring of vital signs for long-term survival of mice under anesthesia. Cold Spring Harbor Protocols. 2011 (2), pdb prot5563(2011).
  20. Moral, J. A., et al. ILC2s amplify PD-1 blockade by activating tissue-specific cancer immunity. Nature. 579 (7797), 130-135 (2020).
  21. Erstad, D. J., et al. Orthotopic and heterotopic murine models of pancreatic cancer and their different responses to FOLFIRINOX chemotherapy. Disease Models & Mechanisms. 11 (7), dmm034793(2018).
  22. Harney, A. S., Wang, Y., Condeelis, J. S., Entenberg, D. Extended time-lapse intravital imaging of real-time multicellular dynamics in the tumor microenvironment. Journal of Visualized Experiments. (112), e54042(2016).
  23. Entenberg, D., et al. Imaging tumor cell movement in vivo. Current Protocols in Cell Biology. Chapter 19, 19.7.1-19.7.19 (2013).
  24. Entenberg, D., et al. Setup and use of a two-laser multiphoton microscope for multichannel intravital fluorescence imaging. Nature Protocols. 6 (10), 1500-1520 (2011).
  25. Rodriguez-Tirado, C., et al. Long-term high-resolution intravital microscopy in the lung with a vacuum stabilized imaging window. Journal of Visualized Experiments. (116), 54603(2016).
  26. Seynhaeve, A. L. B., Ten Hagen, T. L. M. Intravital microscopy of tumor-associated vasculature using advanced dorsal skinfold window chambers on transgenic fluorescent mice. Journal of Visualized Experiments. (131), 55115(2018).
  27. Gorelick, F. S., Lerch, M. M. Do animal models of acute pancreatitis reproduce human disease. Cellular and Molecular Gastroenterology and Hepatology. 4 (2), 251-262 (2017).
  28. Dolai, S., et al. Depletion of the membrane-fusion regulator Munc18c attenuates caerulein hyperstimulation-induced pancreatitis. Journal of Biological Chemistry. 293 (7), 2510-2522 (2018).
  29. Niederau, C., Ferrell, L. D., Grendell, J. H. Caerulein-induced acute necrotizing pancreatitis in mice: protective effects of proglumide, benzotript, and secretin. Gastroenterology. 88 (5 Pt 1), 1192-1204 (1985).
  30. Dunphy, M. P., Entenberg, D., Toledo-Crow, R., Larson, S. M. In vivo microcartography and subcellular imaging of tumor angiogenesis: a novel platform for translational angiogenesis research. Microvascular Research. 78 (1), 51-56 (2009).
  31. Shanja-Grabarz, X., Coste, A., Entenberg, D., Di Cristofano, A. Real-time, high-resolution imaging of tumor cells in genetically engineered and orthotopic models of thyroid cancer. Endocrine-Related Cancer. 27 (10), 529-539 (2020).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Больше статей

Стабилизация поджелудочной железыаденокарцинома поджелудочной железымодель панкреатитамиграция опухолевых клетоквизуализация отдельных клетокимплантация окнасубклеточная динамикасерийная визуализация
Стабилизированное окно для прижизненной визуализации поджелудочной железы мышей
Связаться с нами
Порекомендовать библиотеке

Конфиденциальность

Условия использования

Политики

© 2026 MyJoVE Corporation. Все права защищены.