В данной статье представлен протокол направленной дифференцировки и функционального анализа β-клеточных клеток. Описаны оптимальные условия культивирования и пассажи плюрипотентных стволовых клеток человека перед получением инсулин-продуцирующих клеток поджелудочной железы. Шестиступенчатая дифференцировка прогрессирует от окончательного формирования энтодермы до функциональных β-клеточных клеток, секретирующих инсулин в ответ на глюкозу.
Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.
Методическая статья
Оптимизированный протокол генерации функциональных инсулинсекретирующих клеток поджелудочной железы из плюрипотентных стволовых клеток человека
В этой статье
Краткое содержание
Аннотация
Плюрипотентные стволовые клетки человека (ПСК) могут дифференцироваться в любой тип клеток, что делает их отличным альтернативным источником β-клеток поджелудочной железы человека. ПСК могут быть либо эмбриональными стволовыми клетками (ЭСК), полученными из бластоцисты, либо индуцированными плюрипотентными клетками (ИПСК), полученными непосредственно из соматических клеток с помощью процесса перепрограммирования. Здесь представлен видеопротокол, описывающий оптимальные условия культивирования и пассажа ПСК до их дифференцировки и последующей генерации инсулин-продуцирующих клеток поджелудочной железы. Эта методология следует шестиступенчатому процессу направленной дифференцировки β клеток, в ходе которого ПСК дифференцируются в дефинитивную энтодерму (ДЭ), примитивную кишечную трубку, заднюю часть передней кишки, предшественников поджелудочной железы, эндокринных предшественников поджелудочной железы и, в конечном счете, β-клетки поджелудочной железы. Примечательно, что данная методика дифференцировки занимает 27 дней для генерации β-клеток поджелудочной железы человека. Потенциал секреции инсулина оценивали с помощью двух экспериментов, которые включали иммуноокрашивание и стимулированную глюкозой секрецию инсулина.
Введение
Плюрипотентные стволовые клетки человека (ПСК) обладают уникальной способностью дифференцироваться в различные типы клеток, что делает их жизнеспособной альтернативой β-клеткам поджелудочной железычеловека1. Эти чПСК подразделяются на два типа: эмбриональные стволовые клетки (ЭСК), полученные из бластоцисты2, и индуцированные плюрипотентные клетки (ИПСК), полученные путем прямого перепрограммирования соматических клеток3. Разработка методов дифференцировки ЧПСК в β-клетки имеет важное значение как для фундаментальных исследований, так и для клинической практики 1,4
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Протокол
Перед началом дифференцировки рекомендуется определить необходимое количество островковых органоидов для экспериментальных целей. В 6-луночном планшете одна лунка с более чем 80% слиянием обычно состоит из 2-2,3 миллиона ПСК. Несмотря на то, что точный прогноз является сложной задачей из-за различий в линиях hPSC и эффективности дифференциации, приблизительная оценка в 1,5 раза превышает количество начальных скважин. Эффективно направленная дифференцировка обычно дает от 1,6 до 2 миллионов клеток на лунку в шестилуночных планшетах, охватывая все клетки в кластерах, а не исключительно инсулин-продуцирующие клетки. Для кластера размером 50 мкм он может содержать около 1....
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Результаты
Протокол, описанный в этой статье, предлагает высокоэффективный подход к дифференцировке β подобных клеток из ЧПСК10. В этом процессе используется легко масштабируемая система 2D-культивирования, что позволяет использовать ее в различных экспериментальных условиях, таких как дифференциация обучения, небольшие проекты и лаборатории, а также пилотные тесты для оценки потенциала линии iPSC для дифференциации.
Важно охарактеризовать функциональные свойства дифференцированны.......
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Обсуждение
Успешная дифференцировка чПСК в β-клетки поджелудочной железы зависит от оптимизации всех аспектов рутинного культивирования и пассажа выбранных ПСК. Это включает в себя обеспечение того, чтобы клеточная линия имела нормальный кариотип, была отрицательной на микоплазменную инфекцию и не содержала геномов плазмид или вирусных векторов. Кроме того, при использовании ИПСК важно избегать использования для пилотных экспериментов самых ранних пассажей, которые все еще подвергаются перепрограммированию. Эти эксперименты должны .......
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Благодарности
Инес Шеркауи была поддержана стипендией Diabetes UK (BDA 18/0005934) для GAR, которая также благодарит Wellcome Trust за награду исследователя (212625/Z/18/Z), UKRI MRC за грант программы (MR/R022259/1), грант Diabetes UK за проект (BDA16/0005485), CRCHUM за стартап-фонды, Innovation Canada за премию John R. Evans Leader Award (CFI 42649), NIH-NIDDK (R01DK135268) для проектного гранта и CIHR, JDRF для командного гранта (CIHR-IRSC:0682002550; JDRF 4-SRA-2023-1182-S-N). Камилла Дион и д-р Гарри Лейтч за помощь в создании и культивировании ИПСК человека, Имперский центр биомедицинских исследований NIHR, Лондон.
....Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Материалы
| Имя | Компания | Каталожный номер | Комментарии |
|---|---|---|---|
| Пробирка 1,5 мл Одна микроцентрифужная пробирка | Starlabs | S1615-5500 | |
| 6-луночный планшет для культивирования клеток | ThermoFisher Scientific | 165218 | |
| AggreWell 400 6-луночный планшет | STEMCELL Technologies | 34425 | |
| Антиглюкагон | Sigma-aldrich | G2654-100UL | |
| Анти-инсулин | Dako | A0564 | |
| Anti-NKX6.1 | Novus Biologicals | NBP1-49672SS | |
| Anti-PDX1 | Abcam | ab84987 | |
| Афидиколин | Сигма-Олдрич | A4487 | |
| Добавка B-27 (50X), без сыворотки | Thermo Fisher Scientific | 17504044 | |
| Бычья сыворотка Альбумин, без жирных кислот | Sigma-Aldrich | A3803-100G | |
| Дигидрат хлорида кальция | Sigma-Aldrich | C3306 | |
| Кальций/магний без D-PBS | Thermo Fisher Scientific | 14190144 | |
| циклопамин-KAAD | Calbiochem | 239804 | |
| D-(+)-глюкоза, BioXtra | Sigma-Aldrich | G7528 | |
| Динатрия гидрофосфат, безводный | Sigma-Aldrich | 94046-100ML-DMEM | |
| plus GlutaMAX | Thermo Fisher Scientific | 10566016 | для моющего средства 2: DMEM plus GlutaMAX 1% PS. |
| DMEM/F-12 (модифицированная смесь питательных веществ/питательных веществ Dulbecco's Eagle Medium F-12) | Thermo Fisher Scientific | 10565-018 | |
| Адгезионные слайды Epredi SuperFrost Plus Адгезионные стекла | Thermo Fisher Scientific | 10149870 | |
| этанол | VWR | 20821.33 | |
| Фетальная бычья сыворотка | Thermo Fisher Scientific | 10270098 | |
| ингибитор гамма-секретазы XX | Thermo Fisher Scientific | J64904 | |
| Geltrex LDEV-Free Reduced Growth Factor Base | Thermo Fisher Scientific | A1413302 | Geltrex 1:1 в холодную среду DMEM/F-12 для обеспечения окончательного разведения 1:100. |
| Козья свинка против морской свинки, Alexa Fluor 555 | Thermo Fisher Scientific | A-21435 | |
| Козья свинка против морской свинки, Alexa Fluor 647 | Abcam | ab150187 | |
| Вторичное антитело против мыши козы, Alexa Fluor 633 | Thermo Fisher Scientific | A-21052 | |
| Вторичное антитело против кролика IgG у козы, Alexa Fluor 568 | Thermo Fisher Scientific | A-11011 | |
| Гепарин | Сигма-Олдрич | H3149 | |
| HEPES буфер | Sigma-Aldrich | H3375-500G | |
| Hoechst 33342, тригидрохлорид | Thermo Fisher Scientific | H1399 | |
| Человеческий FGF-7 (KGF) Рекомбинантный белок | Thermo Fisher Scientific | PHG0094 | |
| Хлористый водород | Sigma-Aldrich | 295426 | |
| ImmEdge Гидрофобный барьер PAP Pen | Agar Scientific | AGG4582 | |
| LDN193189 | Sigma-Aldrich | SML0559-5MG | |
| Магния хлорид гексагидрат | Sigma-Aldrich | M9272-500G | |
| OCT Compound 118 мл | Agar Scientific | AGR1180 | |
| PBS таблетки, фосфатно-солевой буфер, биореагенты Fisher | Thermo Fisher Scientific | 7647-14-5 | |
| Пенициллин-стрептомицин (PS) | Thermo Fisher Scientific,15070-063 | ||
| Хлорид калия | Sigma-Aldrich | 7447-40-7 | |
| Рекомбинантный человеческий белок EGF | R& D Systems | 236-EG-200 | |
| Прямоугольные покровные стекла, 22× 50 мм | VWR | 631-0137 | |
| RepSox (гидрохлорид) | STEMCELL Technologies | 72394 | |
| RPMI 1640 Medium, добавка GlutaMAX | Thermo Fisher Scientific | 61870036 | для моющего средства 1: RPMI 1640 плюс GlutaMAX 1% PS. |
| Shandon Immu-mount | Thermo Fisher Scientific | 9990402 | |
| Бикарбонат натрия | Sigma-Aldrich | S6014-500G | |
| Хлорид натрия | Sigma-Aldrich | S3014 | |
| Дигидрофосфат натрия безводный | Sigma-Aldrich | 7558-80-7 | |
| STEMdiff Endoderm | STEMCELL Technologies | 5110 | |
| StemFlex Medium | Thermo Fisher Scientific | A3349401 | размораживание добавки StemFlex в течение ночи при температуре 4&�С; C перелейте остатки жидкости из флакона с добавкой в базальную среду StemFlex. |
| Stemolecule All-Trans ретиноевая кислота | репроцелл | 04-0021 | |
| Тормон щитовидной железы 3 (T3) | Sigma-Aldrich | T6397 | |
| Трипановый синий раствор, 0,4% | ThermoFisher Scientific | 15250061 | |
| ТрипЛ экспресс-фермент (1X) | Thermo Fisher Scientific | 12604013 | |
| TWEEN 20 | Sigma-Aldrich | P2287-500ML | |
| Сверхнизкоадгезивная пластина для суспензионной культуры | Thermo Fisher Scientific | 38071 | |
| Ультрачистая дистиллированная вода без ДНКазы/РНКазы | Thermo Fisher Scientific | 10977015 | |
| Y-27632 (дигидрохлорид) | STEMCELL Technologies | 72302 | |
| Сульфат цинка | Sigma-Aldrich | Телефон Z4750 |
Ссылки
- Kolios, G., Moodley, Y. Introduction to stem cells and regenerative medicine. Respiration. 85 (1), 3-10 (2013).
- Thomson, J. A., et al. Embryonic stem cell lines derived from human blastocysts. Science. 282 (5391), 1145-1147 (1998).
- Martin, G. R.
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Перепечатки и разрешения
