Оптимизированный протокол генерации функциональных инсулинсекретирующих клеток поджелудочной железы из плюрипотентных стволовых клеток человека

Плюрипотентные стволовые клетки человека (ПСК) обладают уникальной способностью дифференцироваться в различные типы клеток, что делает их жизнеспособной альтернативой β-клеткам поджелудочной железы^{человека1}. Эти чПСК подразделяются на два типа: эмбриональные стволовые клетки (ЭСК), полученные из бластоцисты², и индуцированные плюрипотентные клетки (ИПСК), полученные путем прямого перепрограммирования соматических клеток³. Разработка методов дифференцировки ЧПСК в β-клетки имеет важное значение как для фундаментальных исследований, так и для клинической практики ^1,4. Сахарный диабет является хроническим заболеванием, поражающим >400 миллионов человек во всем мире и возникающим в результате неспособности организма регулировать гликемию из-за сбоя или потери^{β-клеток} поджелудочной железы. Ограниченная доступность островковых клеток поджелудочной железы для трансплантации препятствует разработке клеточной заместительной терапии диабета 2,4,6,7. Способность генерировать глюкозочувствительные инсулинсекретирующие клетки с помощью чПСК служит полезной клеточной моделью для изучения развития и функционирования островков человека. Он также может быть использован для тестирования потенциальных терапевтических кандидатов для лечения диабета в контролируемой среде. Кроме того, чПСК обладают потенциалом для продуцирования островковых клеток поджелудочной железы, генетически идентичных пациенту, снижая риск иммунного отторжения после трансплантации ^2,4,7.

В последние годы были достигнуты значительные успехи в совершенствовании протоколов культивирования и дифференцировки ПСК, что привело к повышению эффективности и воспроизводимости процесса дифференцировки в направлении получения β-клеток поджелудочной железы ^8,9.

В следующем протоколе описаны основные этапы направленной дифференцировки β-клеток поджелудочной железы. Он включает в себя регуляцию специфических клеточных сигнальных путей в определенные моменты времени. Он основан на протоколе, разработанном Sui L. et ^al.10 (2018) для генерации hPSCs в β-клетки поджелудочной железы. Протокол был скорректирован с учетом недавних обновлений Sui L. et ^al.11 (2021), поскольку последние исследования подчеркивают важность использования лечения афидиколином (APH) для усиления дифференцировки β-клеток. Текущий протокол включает добавление APH в среду на более поздних стадиях процесса. Кроме того, были внесены изменения в состав среды на ранних стадиях дифференцировки по сравнению с первоначальным протоколом. Заметным изменением является добавление фактора роста кератиноцитов (KGF) на 6-й день и продолжающееся до 8-го дня. Фактор роста кератиноцитов (КГФ) вводят с 6-го по 8-й день, что незначительно отличается от исходного протокола¹⁰, где КГФ не включался в среду 4-й стадии.

Первым и важным этапом в образовании β-клеточных клеток является направленная дифференцировка ПСК в дефинитивную энтодерму (ДЭ), примитивный зародышевой слой, который дает начало эпителиальной выстилке различных органов, включая поджелудочную железу. После образования ДЭ клетки подвергаются дифференцировке в примитивную кишечную трубку, после чего следует уточнение судьбы задней части передней кишки. Затем задняя часть передней кишки развивается в клетки-предшественники поджелудочной железы, которые обладают потенциалом дифференцироваться во все типы клеток поджелудочной железы, включая эндокринные и экзокринные клетки. Последующая стадия процесса включает эндокринных предшественников поджелудочной железы, дающих начало клеткам, секретирующим гормоны, обнаруженным в островках Лангерганса. В конце концов, процесс дифференцировки достигает своей конечной стадии, образуя полностью функциональные β-клеточные клетки поджелудочной железы ^9,10. Важно отметить, что этот процесс является сложным и часто требует оптимизации условий культивирования, таких как специфические факторы роста и компоненты внеклеточного матрикса, для повышения эффективности и специфичности дифференцировки ^9,10. Кроме того, получение функциональных β-клеточных клеток из ПСК in vitro по-прежнему остается серьезной проблемой. Текущие исследования сосредоточены на совершенствовании протоколов дифференцировки и усилении созревания и функции полученных β-клеток⁹.

В этом протоколе использование щадящей диссоциации клеток во время культивирования и пассажа чПСК имеет важное значение для поддержания жизнеспособности и плюрипотентности клеток, значительно повышая эффективность дифференцировки в β-клетки поджелудочной железы. Кроме того, каждая среда, специфичная для конкретной стадии, была тщательно оптимизирована в соответствии с протоколом, разработанным Sui L. et ^al.10 для обеспечения высокого выхода инсулинсекретирующих клеток в кластерах, которые очень напоминают человеческий островок.

Перед началом дифференцировки рекомендуется определить необходимое количество островковых органоидов для экспериментальных целей. В 6-луночном планшете одна лунка с более чем 80% слиянием обычно состоит из 2-2,3 миллиона ПСК. Несмотря на то, что точный прогноз является сложной задачей из-за различий в линиях hPSC и эффективности дифференциации, приблизительная оценка в 1,5 раза превышает количество начальных скважин. Эффективно направленная дифференцировка обычно дает от 1,6 до 2 миллионов клеток на лунку в шестилуночных планшетах, охватывая все клетки в кластерах, а не исключительно инсулин-продуцирующие клетки. Для кластера размером 50 мкм он может содержать около 10 000 клеток. В таблице 1 приведена сводная информация о составе среды, используемой для каждого дня/стадии направленной дифференцировки на матриксе стволовых клеток и среде, а также на стимулированном глюкозой буфере секреции инсулина.

1. Пассажирование плюрипотентных стволовых клеток человека перед дифференцировкой в 6-луночных планшетах

Примечание: Надлежащий пассаж стволовых клеток человека перед их дифференцировкой в β-клеточные клетки является решающим шагом в установлении экспериментального процесса. Неправильное разведение пассажа или количество клеток присоединения может поставить под угрозу эффективность и точность дифференцировки.

1. Приготовьте питательную среду для стволовых клеток, покрытие и растворы для диссоциации (как указано в таблице 1).
2. За 1-2 ч до пассажа шестилуночную пластину покрыть раствором для холодного покрытия (1 мл на лунку) и инкубировать при 37 °C, 5% CO₂.
3. Нагреть аликвоту питательной среды стволовых клеток при комнатной температуре (15 -25 °C) в течение 20 мин.
4. Аспирируйте среду стволовых клеток и добавьте 1 мл D-PBS, не содержащего кальция/магния.
5. Повторите шаг 1.4. дважды.
   ПРИМЕЧАНИЕ: D-PBS добавляется для промывки ячеек и удаления предыдущей среды и соединений. Важно отметить, что для этапов промывки не требуется никаких конкретных временных рамок, так как воздействие D-PBS не повреждает hPSCs, предотвращая разрыв или усадку клеток, вызванных осмосом.
6. Аспирируйте D-PBS, добавьте 500 мкл раствора диссоциации для каждой лунки и оставьте на 2-5 минут при комнатной температуре (15 - 25 °C).
7. Пока клетки диссоциируют, аспирируйте раствор для покрытия новой 6-луночной планшета и добавьте 1-2 мл D-PBS, не содержащего кальция/магния, в каждую лунку.
8. Регулярно проверяйте процесс диссоциации под инвертированным микроскопом.
9. Отсасывайте раствор диссоциации, когда 80-90% клеток округлились, но все еще прилипают.
10. Добавьте 1 мл среды стволовых клеток, содержащей 10 мкМ ингибитора ROCK.
11. Соберите диссоциированные клетки в коническую пробирку объемом 15 мл, используя 1 000 мкл стерильных фильтрованных наконечников для пипеток и пипетку P1000.
12. Медленно растирайте клеточную суспензию вверх и вниз в пипетке стерильным наконечником пипетки с фильтром на 1000 мкл, чтобы разбить колонии, но не более 10 раз.
13. Добавьте 1 мл среды стволовых клеток, содержащей ингибитор ROCK, чтобы помочь отделить оставшиеся ПСК, и перенести клеточную суспензию в ту же коническую пробирку объемом 15 мл (1.10).
14. Аспирируйте D-PBS из только что покрытой пластины и сразу же добавьте клеточную суспензию из конической пробирки объемом 15 мл. Чтобы обеспечить оптимальный рост клеток, высевайте в диапазоне 2 x 10⁵- 1 x 10⁶ жизнеспособных клеток на лунку при использовании 6-луночной пластины (от 1 из 10 до 1 из 50 расщепов).
    ПРИМЕЧАНИЕ: Для расчета объема каждая лунка 6-луночного планшета должна содержать 2 мл среды стволовых клеток с ингибитором ROCK.
15. Быстро перемещайте тарелку вперед и назад, а также из стороны в сторону 5-10 раз.
16. Поместите планшет в инкубатор с 5%_СО2 при температуре 37 °C на 24 ч.
17. На следующий день заменяют свежей средой стволовых клеток без ингибитора РОК, а затем каждые 2 дня до тех пор, пока слияние ПСК не достигнет 80 - 95%.

2. Направленная дифференцировка β-клеток стволовых клеток человека

ПРИМЕЧАНИЕ: ПСК могут быть использованы для прямого процесса дифференцировки в β-клетки поджелудочной железы при достижении 80-95% конфлюенции.

1. День -1: Пассаж клеток День -1 дифференцировки:
   1. За 1-2 ч до прохода 6-луночную пластину покрыть раствором для холодного покрытия в инкубаторе с температурой 37 °C, 5% CO₂ в течение 1 ч.
   2. Выполните шаги с 1.1 по 1.10 и перейдите к подсчету ячеек.
   3. Загрузите 10 мкл клеточной смеси, добавьте равный объем трипанового синего и аккуратно перемешайте.
   4. Рассчитайте концентрацию клеток. Используйте 0,8 × 10⁶ клеток/мл - 1,0 x 10⁶ клеток/мл среды стволовых клеток, содержащей ингибитор ROCK 10 мкМ, для покрытия покрытой 6-луночной пластины 2 мл среды на лунку.
   5. Быстро перемещайте пластину вперед и назад, из стороны в сторону три раза.
   6. Поместите планшет в инкубатор с температурой 37 °C, 5%_CO2 . Быстро перемещайте пластину вперед и назад, а затем снова из стороны в сторону 10 раз. Затем выдерживают планшет в течение 4 ч.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Убедитесь, что максимальное прикрепление и равномерное распределение клеток не нарушают клетки, перемещая пластину после помещения в инкубатор. Открывайте и закрывайте инкубатор очень аккуратно.
   7. Поместите бутылку с базальной средой на дни 0-4 при температуре 4 °C, чтобы она оттаяла на ночь.
2. День 0
   ПРИМЕЧАНИЕ: ПСК должны быть на 80 - 95% сливающимися, не запускайте процесс дифференцировки в окончательную энтодерму под этим слиянием.
   1. На льду размораживают как базальную среду в дни 0-4, так и добавки (см. Таблицу материалов).
   2. Приготовьте в двух конических пробирках только необходимый объем для использования в 1-й день (2 мл на лунку 6-луночного планшета), а в отдельной пробирке удвойте объем на 2,5-й день 4 (2 x 2 мл на лунку 6-луночного планшета). Храните среду со 2,5 по 4 день при температуре 4 °C.
   3. Прогрейте аликвоту необходимого объема среды Day 1 и средства для стирки 1 на водяной бане с температурой 37 °C в течение 5 мин.
   4. Аспирируйте среду стволовых клеток и добавьте 2 мл промывочного средства 1.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Промывочная среда, используемая в протоколе, состоит из базальной среды, специфичной для каждого дня/этапа, дополненной 1% антибиотиками. Этапы промывки, предусмотренные протоколом прямой дифференциации, включают в себя только добавление назначенной промывочной среды (называемой «промывочная среда 1 или 2», Таблица материалов) и последующую аспирацию в соответствии с описанной процедурой 2.2.4. Важно отметить, что для этих этапов стирки не указаны конкретные временные рамки.
   5. Отсасывайте промывочное средство 1 и сразу же добавьте 2 мл средства 1-го дня к стенке лунки.
   6. Инкубируют клетки при 37 °C и 5% CO₂ в течение 24 ч.
3. День 1
   1. Предварительно прогрейте аликвоту необходимого объема среды 2,5-4 дня на водяной бане с температурой 37 °С в течение 5 мин.
   2. Аспирируйте среду 1-го дня и сразу же добавьте 2 мл среды 2,5-4 дня к стенке лунки. Не мойте клетки.
   3. Поместите пластину обратно при температуре 37 °C и 5%_CO2 на 36 часов.
4. Дни с 2,5 по 4
   1. Предварительно подогрейте аликвоту оставшегося объема 2,5-4 суток на водяной бане с температурой 37 °С в течение 5 мин.
   2. Аспирируйте среду и сразу же добавьте 2 мл свежеприготовленной среды 2,5-4 дня к краю лунки.
   3. Поместите пластину обратно при температуре 37 °C и 5%_CO2 на 36 часов.
5. День 4
   ПРИМЕЧАНИЕ: На этой стадии экспрессия окончательных маркеров энтодермы максимальна, и клетки могут инициировать примитивную дифференцировку кишечных трубок.
   1. Приготовьте аликвоту необходимого объема среды 4-го дня примитивной кишки (2 мл на лунку шестилуночной пластины) и прогрейте ее при комнатной температуре (15 °С -25 °С) в течение 20 мин.
   2. Аспират со 2,5 по 4 день и добавьте 2 мл промывочного средства 1.
   3. Аспирируйте промывочное средство 1 и сразу же добавьте 2 мл примитивной кишки на 4-й день в стенку лунки.
   4. Поместите пластину обратно при температуре 37 °C и 5%_CO2 на 48 часов.
6. Дни с 6 по 8
   ПРИМЕЧАНИЕ: На этой стадии клетки инициируют дальнейшую дифференцировку в заднюю часть передней кишки.
   1. На 6-8 дни приготовьте необходимый объем среды для задней кишки (2 мл на лунку 6-луночной пластины) и прогрейте среду при комнатной температуре (15 °C -25 °C) в течение 20 минут.
   2. Аспирируйте среду на 4-й день и сразу же добавьте 2 мл среды для 6-8-го дня задней кишки сбоку от лунки.
   3. Поместите планшет в инкубатор с температурой 37 °C, содержащий 5%_CO2 , на 48 ч.
7. Дни с 8 по 12
   ПРИМЕЧАНИЕ: Клетки готовы к дифференцировке предшественников поджелудочной железы.
   1. Приготовьте необходимый объем среды стадии панкреатических предшественников с 8 по 12 день (2 мл на лунку 6-луночного планшета) и прогрейте среду при комнатной температуре (15 °C -25 °C) в течение 20 мин.
   2. Аспират на 6-8 дни и сразу же добавьте 2 мл среды для 6-8 дней задней кишки к краю лунки.
   3. Поместите планшет в инкубатор при температуре 37 °C, содержащий 5%_CO2 , на 48 ч.
8. День 12: Выполнение шага кластеризации
   ПРИМЕЧАНИЕ: На этом этапе клетки образуют плотный монослой и будут переведены в 3D-клеточную культуру для формирования кластеров. Этот этап имеет решающее значение для дифференцировки, чтобы усилить структурное сходство β подобных клеток с нативными человеческими островками, а также улучшить их функциональное сходство как на клеточном, так и на кластерном уровнях¹¹ (рис. 1).
   1. Обработайте 6-луночную планшет, содержащую микролунки размером 400 мкм (как указано в таблице материалов: направленная дифференцировка β-клеток стволовых клеток человека, день 12) 2 мл раствора для промывки против адгезии при комнатной температуре (15 °C - 25 °C).
      ПРИМЕЧАНИЕ: Микролунка предотвращает прикрепление клеток к дну скважины и облегчает механическое формирование 3D-кластеров.
   2. Центрифужная пластина при 1 300 x g в течение 5 мин.
   3. Проверьте наличие пузырьков под инвертированным микроскопом. Если пузырьков не наблюдается, отсасывайте антиадгезионный промывочный раствор и немедленно добавляйте 2 мл моющего средства 2 (Таблица материалов).
   4. Повторите шаг 1.8.3. два раза.
   5. Подготовьте необходимый объем кластерной среды и прогрейте ее при комнатной температуре (15 -25 °C) в течение 20 мин. Убедитесь, что две лунки 6-луночной планшета входят в одну лунку 6-луночной микролунки 6-луночной планшета с 4 мл кустовой среды.
   6. Аспират панкреатической среды-предшественника и добавление диссоциационного буфера (0,5 мл на лунку).
   7. Выдерживают при комнатной температуре (15 °C - 25 °C) в течение 2-5 мин. Регулярно проверяйте процесс диссоциации под инвертированным микроскопом и аспирируйте диссоциационный буфер, когда большинство клеток округлились, но все еще адгезивны.
   8. Аспирируйте диссоциационный буфер и сразу же добавляйте по 1 мл кластерной среды в каждую лунку.
   9. Диссоциируйте клетки, осторожно пипетируя вверх и вниз шесть раз с помощью пипетки P1000 и наконечников фильтра объемом 1 000 мкл.
   10. Переложите клетки и смесь кластерной среды в коническую пробирку объемом 50 мл.
   11. Добавьте 1 мл кластерной среды, чтобы собрать все оставшиеся клетки.
   12. Добавьте кластерную среду к общему необходимому объему, чтобы в каждой лунке планшета микролунок было 4 мл смеси кластерной среды/ячеек.
   13. Отсасывают промывное средство 2 из микролунок 6-луночной пластины и переносят суспензию ячейки. Инкубируйте планшет при 37 °C в течение 24 ч.
9. День 13: Работа с клетками после кластеризации и смена их среды, начиная с 13-го дня.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Кластеры очень чувствительны и требуют осторожного обращения, чтобы обеспечить их целостность и жизнеспособность в последующие дни. Поэтому крайне важно внимательно следить за кластерами в течение периода после кластеризации после 12-го дня. Регулярная оценка и корректировка необходимы для достижения успешных результатов в экспериментальном процессе.
   1. Готовят необходимый объем среды 13-го дня (2 мл на лунку 6-луночного планшета) и в отдельной конической пробирке по 50 мл на 15-20 сутки эндокринной среды-предшественника поджелудочной железы.
   2. Медленно собирайте кластеры из планшета с 6 лунками в коническую пробирку объемом 50 мл с помощью пипетки p1000 и фильтрованных наконечников объемом 1 000 мкл.
   3. Добавьте 1 мл среды на 13-й день, чтобы собрать оставшиеся кластеры и перенести кластеры в пробирку.
   4. Дайте клеткам естественным образом застыть под действием силы тяжести на дно конической трубки в течение 5 минут.
   5. Отсасывайте как можно больше надосадочной жидкости из пробирки, не нарушая клеточные кластеры. Наконечники пипеток не должны касаться и аспирировать кластеры, а только надосадочную жидкость.
   6. Добавьте необходимый объем среды на 13-й день следующим образом: 1 лунка микролунки 6-луночная пластина входит в три лунки низкоприкрепленной 6-луночной пластины (2 мл среды на лунку).
   7. Осторожно поднимайте и опускайте пипетку, избегая аспирационных кластеров.
   8. Переложите суспензию на 6-луночную пластину с очень низкой адгезией.
   9. Быстро перемещайте тарелку вперед и назад, из стороны в сторону шесть раз.
   10. Инкубируйте планшет при 37 °C в течение 48 ч.
   11. Выполняйте изменения среды на всех последующих шагах до конца дифференцирования, как описано в разделе 2.9.
10. Дни с 15 по 20
    1. Каждые 48 ч до 21-го дня дифференцировки переходят на эндокринную среду эндокринной стадии поджелудочной железы, собирая клеточную суспензию в коническую пробирку объемом 50 мл и выполняя шаги 2.9.4–2.9.10 в течение 13-го дня.
11. Дни с 21 по 27
    ПРИМЕЧАНИЕ: На этом этапе кластеры дифференцируются в β-клетки поджелудочной железы.
    1. Подготавливают среду β-клеточной стадии поджелудочной железы.
    2. Меняйте носитель через день, как описано в течение 15-21 дней.
       ПРИМЕЧАНИЕ: После 25-го дня островковые органоиды могут быть подвергнуты анализу, чтобы подтвердить, что они полностью функциональны.

3. Окрашивание β-клеточных кластеров поджелудочной железы

ПРИМЕЧАНИЕ: Выполните этот шаг для изучения функциональной оценки кластеров после дифференцировки

1. Соберите от пяти до десяти кластеров в пробирку микроцентрифуги объемом 1,5 мл в конце дифференцировки.
2. Зафиксируйте клеточные кластеры 200 мкл 4% PFA в течение 15 мин при комнатной температуре.
3. Добавьте 1 мл PBS к кластерам и удалите PBS наконечником пипетки объемом 1 000 мкл, не повредив кластеры.
4. Добавьте 200 мкл 30% сахарозы к кластерам и инкубируйте в течение ночи при 4 °C.
5. Переложите кластеры в криоформу, удалите лишнюю сахарозу, добавьте каплю среды O.C.T. и смешайте кластеры со средой O.C.T.
6. Заморозьте криомолд на сухом льду и храните при температуре -80 °C.
7. Вырежьте срезы размером 5 мкм из замороженного блока на предметных стеклах микроскопа с помощью микротома/или криостата.
8. Храните предметные стекла при температуре -80 °C в морозильной камере до появления пятен.
9. В день окрашивания достаньте предметные стекла из морозильной камеры с температурой -80 °C.
10. Осторожно удалите лед вокруг секций криоформы.
11. Обведите скопления клеток на предметных стеклах гидрофобной ручкой.
12. Регидратируйте предметные стекла в банке для окрашивания предметных стекол, содержащей PBS, в течение 15 минут.
13. Добавьте холодный метанол в банку для окрашивания предметных стекол и поместите банку с предметными стеклами при температуре -20 °C на 10 минут.
14. Погрузите слайды в банку PBS.
15. Повторите шаг 3.14 три раза.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Используйте этот метод для всех последующих этапов стирки.
16. Снимите ПБС с предметных стекол и немедленно накройте 100 мкл блокирующего раствора с 2-5% БСА в ПБС-Т.
17. Добавьте блокирующий раствор на каждое предметное стекло и накройте парафиновой пленкой.
18. Выдерживают 1 ч при комнатной температуре (15 -25 °С).
19. Разведите первичные антитела в блокирующем растворе, используя соотношения, указанные в разделе «Реагенты и растворы».
20. Снимите блокирующий раствор с направляющих.
21. Сразу же добавьте разбавленные антитела и накройте предметные стекла парапленкой, чтобы предметное стекло не высохло.
22. Инкубировать в течение ночи при температуре 4 °C.
23. На следующий день промойте предметные стекла 3 - 5 раз ПБС-Т.
24. Приготовьте разбавленные вторичные антитела и краситель ДНК.
25. Удалите излишки PBS-T с предметных стекол.
26. Добавьте разбавленные вторичные антитела и краситель ДНК. Выдерживать 45 мин при комнатной температуре (15 -25 °C).
27. Вымойте предметные стекла 3 - 5 раз с помощью PBS-T.
28. Удалите жидкость с предметных стекол.
29. Добавьте по капле гистологической монтажной среды в каждый срез.
30. Накройте предметное стекло крышкой.
31. Сфотографируйте окрашенные предметные стекла с помощью флуоресцентного микроскопа.

4. GSIS (глюкозостимулированный анализ секреции инсулина)

1. Приготовьте три разных раствора: раствор KREBS с низким содержанием глюкозы, раствор KREBS с высоким содержанием глюкозы и раствор KREBS с низким содержанием глюкозы и KCl.
2. Подогрейте все растворы на водяной бане 37 °C.
3. Осторожно отоберите около 10–15 кластеров одинакового размера с помощью наконечника для пипетки на 1000 мкл и переложите их в пробирку объемом 1,5 мл вместе с небольшим количеством дифференцированной среды, чтобы избежать высыхания кластеров.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Кластеры должны быть видны невооруженным глазом, но если нет, поместите планшет с дифференцированными кластерами под инвертированный микроскоп, чтобы выбрать кластеры и перенести их в пробирку объемом 1,5 мл.
4. Поместите пробирку с гроздьями и средой на решетку для пробирок и подождите, пока грозди опустятся на дно пробирки.
5. Медленно аспирируйте надосадочную жидкость с помощью пипетки объемом 200 мкл и добавьте 200 мкл раствора KREBS с низким содержанием глюкозы.
6. Островки инкубируют в растворе с низким содержанием глюкозы в течение 1 ч при 37 °C.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Для обеспечения точной оценки числа кластеров и согласованности в экспериментах рекомендуется проверять наличие всех кластеров в растворе во время переноса, так как они имеют тенденцию прилипать к пробирке.
7. Извлеките пробирку из инкубатора и медленно аспирируйте 200 мкл раствора KREBS, не аспирируя кластеры.
8. Добавьте 200 мкл раствора KREBS с низким содержанием глюкозы и инкубируйте в течение 30 минут при 37 °C.
9. Аспирируйте объем 200 мкл раствора KREBS с низким содержанием глюкозы в пробирку объемом 500 мкл и немедленно храните ее при температуре -80 °C для измерения инсулина. Повторите эти действия для отдельных процедур.
10. Для промывки кластеров добавьте в пробирку, содержащую кластеры, 200 мкл раствора KREBS без глюкозы. Дайте кластерам осесть на дно пробирки и осторожно удалите надосадочную жидкость, не потревожив кластеры.
11. Добавьте 200 мкл раствора KREBS с высоким содержанием глюкозы и инкубируйте в течение 30 минут при 37 °C.
12. Аспирируйте 200 мкл KREBS с высоким содержанием глюкозы в пробирку объемом 500 мкл и немедленно храните ее при температуре -80 °C для измерения уровня инсулина. Повторите эти действия для отдельных процедур.
13. Для промывки кластеров добавьте в пробирку, содержащую кластеры, 200 мкл раствора KREBS без глюкозы. Дайте кластерам осесть на дно пробирки и осторожно удалите надосадочную жидкость, не потревожив кластеры.
14. Добавьте 200 мкл раствора KCl KREBS и повторите для отдельных обработок.
15. Выдерживать 30 мин при температуре 37 °C.
16. Аспирируйте 200 мкл раствора KCl KREBS в пробирку объемом 500 мкл и немедленно храните ее при температуре -80 °C для измерения уровня инсулина. Повторите эти действия для других процедур.
17. Добавьте 50 мкл сверхчистой воды и приступайте к измерению общего содержания инсулина.
18. Добавьте 150 мкл кислого раствора этанола в пробирку с островками и сверхчистой водой.
19. Хранить образцы при температуре 4 °C в течение ночи (12 - 15 ч).
20. На следующий день перемешайте каждый образец.
21. Выполняйте ультразвуковую терапию с помощью электрического ультразвукатора, установленного на мощность 20% в течение 1 с, чтобы обеспечить полный лизис островковой ткани.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Повторяйте шаг 4.21 до тех пор, пока не исчезнут оставшиеся кластеры.
22. Центрифугируют все образцы при 10 000 × г в течение 10 мин и выдерживают надосадочную жидкость.
23. Измерьте концентрацию ДНК с помощью нанокапельного спектрофотометра, который затем можно использовать для нормализации показателей инсулина.

Протокол, описанный в этой статье, предлагает высокоэффективный подход к дифференцировке β подобных клеток из ЧПСК10. В этом процессе используется легко масштабируемая система 2D-культивирования, что позволяет использовать ее в различных экспериментальных условиях, таких как дифференциация обучения, небольшие проекты и лаборатории, а также пилотные тесты для оценки потенциала линии iPSC для дифференциации.

Важно охарактеризовать функциональные свойства дифференцированных β-клеток в островках, чтобы получить представление о гомеостазе глюкозы. Обычно это достигается с помощью различных экспериментов, таких как иммуноокрашивание на маркеры β-клеток и экспрессию инсулина, а также анализы глюкозостимулированной секреции инсулина (GSIS), которые проверяют функцию островков в ответ на низкие и высокие концентрации глюкозы12,13. β-клетки обладают сигнатурными генами, включая Nkx2-2, Pdx1, Nkx6-1 и Neurod1, которые имеют решающее значение для установления иподдержания идентичности β-клеток9. Методы иммуноокрашивания полезны для исследования экспрессии и локализации белка в срезах тканей. Иммуноокрашивание для маркеров β-клеток позволяет оценить уровни экспрессии ключевых маркеров линии поджелудочной железы, что дает представление о точности и оптимизации процесса дифференцировки для конкретных применений 9,12.

В этом исследовании репортерная линия Mel1 InsGFP/w (Mel1 INS-GFP)14 hESC была использована для дифференциации кластеров, содержащих различные типы клеток, включая β-клетки, напоминающие те, которые обнаружены в нативных островках человека. На рисунке 2 в этой статье представлены важные выводы относительно эффективности и точности процесса дифференциации. Результаты демонстрируют высокое обогащение инсулин-экспрессирующих клеток в пределах линии поджелудочной железы, и эти клетки демонстрируют глюкозостимулированную секрецию инсулина. Это указывает на успешную генерацию функциональных β подобных клеток в процессе дифференцировки.

Дифференцированные клетки стимулировали низкими и высокими концентрациями глюкозы, и результаты GSIS показали, что кластеры, полученные из клеток Mel1, функционировали аналогично островкам в их реакции секреции инсулина на глюкозу. Было обнаружено, что кластеры, полученные из Mel1, секретируют в 100 раз больше инсулина в ответ на высокие концентрации глюкозы по сравнению с низкими концентрациями глюкозы. В частности, содержание инсулина составляло 0,003 ± 0,002% при низком содержании глюкозы 3,3 мМ и 0,236 ± 0,197% при высоком содержании глюкозы 16,7 мМ.

Кластеры, полученные из ЭСК Mel1 INS-GFP, были подвергнуты дальнейшему анализу для определения их состава и функциональности в дополнение к анализу GSIS. В частности, была исследована экспрессия β-клеточных сигнатурных генов и присутствие различных типов клеток в кластерах. Результаты показали, что панкреатическая линия, полученная в результате этого процесса, высоко обогащена инсулин-положительными клетками, что свидетельствует о высоком уровне успешности процесса дифференцировки чЭСК в β-клеточные клетки. Кроме того, была изучена экспрессия сигнатурных генов, таких как Nkx6.1 и Pdx1, важных для установления и поддержания идентичности β-клеток. Анализ показал, что примерно 25% и 40% клеток экспрессировали Nkx6.1 и Pdx1 соответственно, что дает дополнительные доказательства того, что кластеры содержат дифференцированные β-подобные клетки (среднее количество клеток Nkx6.1+ на кластер 24,9% ± 6,2%, n=9 кластеров, клетки Pdx1+ 40,2% ± 6,2%, n=9, SEM, рис. 2). Кроме того, кластеры содержали другие типы клеток, такие как глюкагон-положительные клетки, которые составляли около 15% от общей клеточной популяции. Эти клетки, как правило, обнаруживаются в альфа-клетках нативных островков Лангерганса, что позволяет предположить, что кластеры очень похожи на человеческие островки с точки зрения клеточного состава.

Рисунок 1: Дифференцировка чПСК в сторону β-клеток поджелудочной железы. (А) Схематическое изображение направленной дифференцировки ПСК in vitro в β-клетки поджелудочной железы, которая включает шесть последовательных стадий: окончательная индукция энтодермы, формирование примитивной кишечной трубки, спецификация судьбы задней части передней кишки, генерация предшественника поджелудочной железы, формирование эндокринного предшественника поджелудочной железы и, в конечном счете, дифференцировка β-клеток поджелудочной железы. Дифференцировка β-клеток поджелудочной железы использует ключевые стадии развития островков человека с регуляцией специфических сигнальных путей клеток в определенное время. B27: Дополнение B-27; Ri: ро-ассоциированный ингибитор протеинкиназы или ингибитор РОК; Т3: гормон щитовидной железы; KGF: человеческий белок KGF/FGF-7; RepSox: ингибитор пути активина/нода/TGF-β; Ингибирует ALK5; RA: Ретиноевая кислота; ZS: сульфат цинка; НФГ: нефракционированный гепарин; XX: ингибитор гамма-секретазы XX; APH: афидиколин; EGF: эпидермальный фактор роста; LDN: Ингибитор BMP III, LDN-212854; Цикло: Циклопамин - KAAD. (B) Изображения клеточной морфологии, полученные на различных стадиях дифференцировки от плюрипотентных стволовых клеток до β-клеток поджелудочной железы. На первом изображении показаны плюрипотентные стволовые клетки человека в первый день дифференцировки (монослой HPSCs). (C) На 11-й день клетки находятся в стадии предшественника поджелудочной железы. Масштабная линейка 100 мкм. (D) На 12-е сутки после диссоциации клеток на стадии предшественника поджелудочной железы в микролунках 6-луночного планшета образуются кластеры. (E) На 13-й день кластеры находятся в 6-луночном планшете с низким прикреплением. Масштабная линейка 100 мкм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Рисунок 2: Кластеры, полученные из дифференцированной репортерной линии14 Mel1 InsGFP/w hESC, были оценены на наличие инсулин-продуцирующих клеток, экспрессирующих маркеры зрелости β-клеток. (A) Иммунофлуоресцентные изображения кластеров были получены из криомольдных срезов (5 мкм) с помощью конфокальной микроскопии с вращающимся диском, которая выявила преобладание инсулин-продуцирующих клеток (около 60%) по сравнению с глюкагон-продуцирующими клетками (примерно 15%) (n=9 кластеров, примерно 18 000 ячеек, SEM). (B) Иммунофлуоресцентные изображения кластеров были получены из криомольдных срезов (5 мкм) с помощью конфокальной микроскопии вращающихся дисков, которые показали преобладание инсулин-продуцирующих клеток, совместно экспрессирующих маркеры β-клеток поджелудочной железы Nkx6,1 (n=9 кластеров, приблизительно 18 000 клеток). (C) Для определения процентного содержания инсулин-позитивных, глюкагон-положительных и β-клеточных маркеров Nkx6.1-положительных клеток и β-клеточных маркеров Pdx1-положительных клеток использовали макрос ImageJ, специально разработанный для иммуноокрашивания маркеров. (D) Была оценена глюкозо-стимулированная секреция инсулина кластеров, полученных из Mel1 InsGFP/w hESC, которая продемонстрировала увеличение в 100 раз в ответ на высокую стимуляцию глюкозы (16,7 мМ глюкозы) в дифференцированных кластерах (n=9, SEM). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этого рисунка.

Таблица 1: Сводная информация о составе сред для направленной дифференциации. В этой таблице представлена сводная информация о составе среды, используемой для каждого дня/стадии направленной дифференцировки на матриксе стволовых клеток и среде, а также на глюкозостимулируемом буфере секреции инсулина. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы скачать эту таблицу.

The successful differentiation of hPSCs into pancreatic β-cells depends on optimizing all aspects of routine culturing and passage of the selected hPSCs. This includes ensuring that the cell line has a normal karyotype, is negative for mycoplasma infection, and is free of plasmid or viral vector genomes. Furthermore, when using hiPSCs, it is important to avoid using the earliest passage which are still undergoing reprogramming, for pilot experiments. These experiments should be conducted on a small scale to identify the hPSC line with the best differentiation potential and the optimal number of passages.

Other parameters that can influence differentiation efficiency include the quality of the stem cell medium used, the coating density, and the number of passages^10,12. This protocol has been optimized to maximize the efficiency of differentiation by ensuring that all relevant parameters are optimized¹⁰.

Differentiation media with specific formulations are used at each stage to support the differentiation of hPSCs into β-cells. Activin A and a Wnt agonist are used in the differentiation medium to initiate the transition to definitive endoderm cells. During the primitive gut tube stage, KGF is added to the medium to promote further differentiation into β-cells¹⁵, and this inclusion of KGF is maintained from day 6 to 8, differing from the original protocol by Sui, Egli, et al.¹⁰. During the pancreatic progenitor stage, the specific media composition is optimized to enhance the expression of the Pdx1 transcription factor. This is achieved by using a high concentration of retinoic acid (RA), KGF, and LDN193189, which inhibits the bone morphogenetic protein (BMP) pathway⁸. As the differentiation progresses to the endocrine stage, the culture medium is modified to downregulate Notch signaling. This is achieved by incorporating XXI, a γ-secretase inhibitor, along with T3 (thyroid hormone), RA, and RepSox, an inhibitor of the Activin/BMP/TGF-β pathway⁸. This specific combination of compounds is used to promote the differentiation of pancreatic progenitors into endocrine progenitors. Finally, to optimize the direct differentiation process, aphidicolin (APH) is introduced during the differentiation from pancreatic progenitors into endocrine progenitors. This addition of APH aims to further enhance β-cell differentiation, and it represents a distinct modification from the initial protocol proposed by Sui, Egli, et al.^10,11.

During the differentiation process, it is crucial to monitor cell density and prevent over-confluence, as this can hinder proper differentiation. High-density cultures can maintain high Oct4 expression, inhibiting differentiation to definitive endoderm. Removing the ROCK inhibitor during the first washing step is essential for initiating differentiation and allowing the pluripotent state of hPSCs to be altered. Using a fluorescence marker, such as Mel1 INS-GFP with a GFP integrated at the insulin locus, facilitates the assessment of differentiation progress at the pancreatic progenitor and β-cell stages, aiding downstream experiments¹⁴.

The current protocol for differentiating human pluripotent stem cells into pancreatic β-like cells has demonstrated variability in efficiency among different hPSC lines¹⁰. Additionally, the resulting β-like cells exhibit functional immaturity compared to human pancreatic islets, showing lower insulin secretion per cell. To address this limitation further, in vivo maturation of β-like cells can be achieved by transplantation of islet organoids into animal models during the final stages of differentiation^6,7.

Despite these limitations, the differentiation of hPSCs into pancreatic β-cells has significant potential with respect to existing methods^8,9,10. This technique allows to produce large numbers of β-cell-like cells that are responsive to glucose and express β-cell markers (Pdx1 and Nkx6.1, see Figure 2). This is done without the ethical, technical, and source limitations associated with the use of human pancreatic islets. In addition, this technique has the potential to be applied to personalized medicine, as patient-specific β-cells can be generated for drug testing and disease modeling^4,6,7. The technique may also have future applications in treating diabetes that involve the loss or dysfunction of pancreatic β-cells^4,6,7.