Методическая статья

Флуоресцентная гибридизация РНК in situ для длительной некодирующей локализации РНК в клетках остеосаркомы человека

DOI:

10.3791/65545

⸱

16 июня 2023 г.

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Longhua Hospital, Shanghai University of Traditional Chinese Medicine, 2Key Laboratory of Theory and Therapy of Muscles and Bones, Ministry of Education

* These authors contributed equally

В этой статье

Краткое содержание

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

В настоящем протоколе описан метод флуоресцентной гибридизации РНК in situ для локализации днкРНК в клетках остеосаркомы человека.

Аннотация

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Изучена важная роль длинных некодирующих РНК (днкРНК) в раке, такая как регуляция пролиферации, эпителиально-мезенхимального перехода (ЭМП), миграция, инфильтрация и аутофагия раковых клеток. Локализация днкРНК в клетках может дать представление об их функциях. Путем разработки последовательности антисмысловой цепи, специфичной для днкРНК, с последующим мечением флуоресцентными красителями, флуоресцентная гибридизация РНК in situ (FISH) может быть применена для обнаружения клеточной локализации днкРНК. Вместе с развитием микроскопии методы RNA FISH теперь позволяют визуализировать даже плохо экспрессируемые днкРНК. Этот метод позволяет не только обнаружить локализацию только днкРНК, но и обнаружить колокализацию других РНК, ДНК или белков с помощью двухцветной или многоцветной иммунофлуоресценции. Здесь мы включили подробную процедуру экспериментальной эксплуатации и меры предосторожности RNA FISH на примере lncRNA small nucleolar RNA host gene 6 (SNHG6) в клетках остеосаркомы человека (143B), чтобы обеспечить справочную информацию для исследователей, которые хотят проводить эксперименты с РНК FISH, особенно с lncRNA FISH.

Введение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Наше понимание генома человека значительно расширилось благодаря недавним достижениям в области полногеномных технологий. Около 93% генома человека могут быть транскрибированы в РНК, но только 2% РНК могут быть транстранслированы в белки; остальные 98% РНК, которые не имеют функции трансляции белков, называются некодирующими РНК (нРНК)1. Как класс некодирующих РНК (нРНК), длинные нРНК (днкРНК), содержащие более 200 нуклеотидов2, привлекают все большее внимание в связи с их участием во многих физиологических и патологических процессах клеток, таких как дифференцировка, контроль цикла, апоптоз, миграция и инвазия 3,4,5 . LncRNA играют свою роль через различные механизмы, такие как регуляция структуры хроматина и экспрессии ядерных генов, контроль процесса сплайсинга мРНК и посттранскрипционная модификация6. ДнкРНК регулируют возникновение, развитие и метастазирование злокачественных новообразований как на транскрипционном, так и на посттранскрипционном уровнях. Транскрипционная регуляция реализуется в ядре путем воздействия на транскрипцию РНК через связывание с хромосомными структурами, в то время как посттранскрипционная регуляция осуществляется в цитоплазме путем управления генами-мишенями через механизм эндогенной конкурентной РНК (цРНК) 5,7,8. CeRNA выявила новый механизм взаимодействия РНК, а именно, что днкРНК могут действовать как губка, адсорбируя микроРНК и ингибируя опосредованную микроРНК деградацию родственных генов-мишеней9. Таким образом, информация о субклеточной локализации днкРНК, независимо от того, находится ли конкретная днкРНК в цитоплазме или ядре, важна для определения их биологических функций.

В настоящее время локализация днкРНК в основном определяется двумя методами: методом выделения фракции ядра/цитоплазмы и РНК FISH. В первом случае выделяют РНК в цитоплазматической и ядерной фракциях соответственно, а затем проводят ПЦР-амплификацию со специфическими праймерами днкРНК для определения соотношения днкРНК в цитоплазме и ядре. Преимуществом этого метода является экономия времени, в то время как недостатком является то, что фактическая локализация днкРНК не отражается напрямую на относительной доле днкРНК в цитоплазме и ядре. РНК FISH может обнаруживать локализацию днкРНК в клетках путем разработки специфичных для днкРНК антисмысловых цепных последовательностей с последующим мечением флуоресцентными красителями10. Методы RNA FISH были усовершенствованы благодаря достижениям в области зондовых техник и методов обнаружения, включая множественные наборы олигозондов, меченные флуорофорами11, зонды LNA 12 и зонды с разветвленной ДНК (бДНК)13. RNA FISH может не только обнаруживать локализацию lncRNA, но и обнаруживать колокализацию других РНК, ДНК или белков с помощью двухцветной или многоцветной иммунофлуоресценции14.

В данной работе в качестве примера был включен подробный протокол обнаружения внутриклеточной локализации малоядрышковой РНК гена хозяина 6 (SNHG6) lncRNA в клетках остеосаркомы (143B) с помощью РНК FISH. SNHG6 представляет собой 600-730 нуклеотидную днкРНК в зрелой сплайсированной форме и идентифицирован как новый онкоген при различных видах рака человека, включая колоректальный рак, рак желудка, светлоклеточную карциному яичников, остеосаркому и гепатоцеллюлярную карциному15,16,17,18. Исследования подтвердили участие SNHG6 в биологическом поведении раковых клеток, таком как пролиферация, ЭМП и аутофагия, и показали цитоплазматическую локализацию SNHG6, где он может влиять на гены-мишени путем связывания (губирования) микроРНК15,16,17. В статье представлен подробный протокол детектирования внутриклеточной локализации SNHG6 с помощью РНК FISH.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

См. Таблицу материалов для получения подробной информации обо всех материалах, реагентах и инструментах, используемых в этом протоколе. На рисунке 1 показан общий протокол для RNA FISH; Таблица 1 содержит состав всех растворов, а таблица 2 содержит последовательности праймеров, используемые в этом протоколе.

1. Подготовка зонда

  1. Идентификация и получение последовательности FASTA интересующей вас целевой днкРНК, например, из GenBank (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/genbank/). Следуя указаниям на веб-сайте, спроектируйте датчики ISH онлайн19 и ознакомьтесь с предложениями алгоритма проектирования, чтобы перечислить датчики, которые необходимо заказать, с маркировкой Cy3.
  2. Инкубируйте гибридизационный буфер при температуре 37 °C в течение 2 ч.
  3. Растворите 4 зонда оптической плотности (OD) в 160 мкл обработанного диэтилпирокарбонатом (ДЭПК) ddH2O в концентрации 1 мг/мл вдали от света.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Оптическая плотность (OD) представляет собой единицу измерения ДНК и РНК. Обычно 1 единица OD = 33 мкг/мл ДНК.
  4. Приготовьте 200 мкл зондовой смеси для каждой лунки (1,2–10 мкл зонда, 70 мкл гибридизационного буфера, дополните объем обработанным ДЭПК ddH2O до 200 мкл) и установите серию 50 мкг/мл, 25 мкг/мл, 12,5 мкг/мл и 6 мкг/мл.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Концентрация зонда должна быть предварительно исследована экспериментально. Высокая концентрация зонда приведет к неспецифическому связыванию днкРНК, в то время как низкая концентрация зонда приведет к нечувствительному или неудачному обнаружению днкРНК.
  5. Денатурировать смесь зонда при 73 °C в течение 5 мин.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Если зонд ДНК с мечением Cy3 является двухцепочечным, денатурируйте зонд до одноцепочечной ДНК при 95 °C в течение 5 минут, затем быстро охладите в течение 2 минут на льду.

2. Подготовка клеток

  1. Высевают 50 000 клеток 143B на лунку на стерильные стеклянные покровные стекла в 12-луночный планшет для клеточных культур и инкубируют их в течение 24 ч (37 °C, 5%CO2) в DMEM.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Конкретное количество клеток, засеянных здесь, зависит от размера клеток, что подходит для того, чтобы засеянные клетки достигали слияния 50% после инкубации в течение 24 часов. Стерильные стеклянные покровные стекла имеют круглую форму, что подходит для 12-луночной пластины.
  2. Удалите средство и промойте в течение 2 x 5 минут 1x фосфатно-солевым буфером (PBS).
    ПРИМЕЧАНИЕ: Приготовьте 1x PBS с обработанным DEPC ddH2O. PBS без обработки DEPC нельзя использовать, поскольку он содержит РНКазу. Выполните все следующие действия в условиях, свободных от РНКазы.
  3. Удалите 1x PBS и добавьте 200 мкл 100% этанола в каждую лунку, чтобы зафиксировать на 15 минут при комнатной температуре.
  4. Удалите этанол, добавьте 200 мкл 0,1% Triton X-100 (в 1 PBS) в каждую лунку и инкубируйте в течение 15 минут при комнатной температуре.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Время должно строго контролироваться с помощью пермеабилизации Triton X-100, и оно не может быть слишком длинным.
  5. Удалите 0,1% Triton X-100 и постирайте 2 x 5 мин с 1x PBS.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Если здесь протокол необходимо приостановить, замените PBS 70% этанолом (разбавление 100% этанола безРНКазным ddH2O) и храните образец при 4 °C до 3 месяцев.
  6. Удалите 1x PBS, добавьте 200 мкл 2x буфера солевого раствора натрия (SSC) (разведение 20x SSC с ddH2O, не содержащим РНКазы) в каждую лунку и инкубируйте в течение 30 минут при 37 °C.
  7. Удалите 2 буфера SSC, добавьте 200 мкл 70% этанола в каждую лунку и инкубируйте в течение 3 минут при комнатной температуре.
  8. Выбросьте 70% этанол, добавьте 200 мкл 85% этанола (разбавление 100% этанола свободным РНКазой ddH2O) в каждую лунку и инкубируйте в течение 3 минут при комнатной температуре.
  9. Выбросьте 85% этанол, добавьте 200 мкл 100% этанола в каждую лунку и инкубируйте в течение 3 минут при комнатной температуре.
  10. Абсорбировать и отбросить 100% этанол; Дайте лункам высохнуть.

3. Флуоресцентная гибридизация in situ (FISH)

  1. Добавьте 200 мкл смеси зондов (денатурированной, как на этапе 1.5) в каждую лунку и инкубируйте при 37 °C в течение ночи (16-18 ч).
    ПРИМЕЧАНИЕ: Существует сильная положительная корреляция между температурой гибридизации и концентрацией зонда; Поэтому для оптимизации фона следует снизить как температуру гибридизации, так и концентрацию зонда.
  2. На следующий день выньте пробы с температурой от 37 °C и выбросьте смесь зондов. Добавьте 200 мкл 0,4x SSC/0,3% Tween-20 буфера в каждую лунку (предварительно нагретого до 65 °C) и промывайте в течение 2 минут при комнатной температуре.
  3. Удалите буфер 0,4x SSC/0,3% Tween-20, добавьте 200 мкл 2x буфера SSC/0,1% Tween-20 в каждую лунку и промывайте в течение 2 минут при комнатной температуре.
  4. Удалить 2x SSC/0,1% Tween-20 буфера, добавить 200 мкл раствора для окрашивания 4',6-диамидино-2-фенилиндола (DAPI) (1 мкг/мл) и окрашивать в течение 20 минут вдали от света.
  5. Выбросьте раствор красителя DAPI и промойте 1x PBS в течение 2 минут при комнатной температуре.
  6. Добавьте 50 мкл монтажной среды, содержащей камедь, на предметное стекло и поместите стеклянный покровный стекло на предметное стекло для фиксации.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Обязательно положите покровный листок на предметное стекло стороной ячейки вниз.
  7. Наблюдение под флуоресцентным микроскопом.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Используйте флуоресцентный микроскоп или лазерный конфокальный микроскоп; Последний обеспечивает более высокую чувствительность и четкость изображения.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Представлены репрезентативные изображения SNHG6 FISH в клетках остеосаркомы человека (рис. 2). Отрицательный элемент управления обрабатывается отрицательным зондом Ctrl; положительный контроль обрабатывается зондом U6 20. Зонд SNHG6 и зонд U6 помечены Cy3, который излучает красную флуоресценцию. DAPI — это краситель, окрашивающий ДНК, который излучает синюю флуоресценцию. Этот результат показывает, что SNHG6 в основном локализуется в цитоплазме, и эта информация может...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Этот протокол RNA FISH может не только обнаруживать локализацию днкРНК в клетках, но и обнаруживать колокализацию других РНК, ДНК или белков в клетках, что также может быть использовано для обнаружения местоположения днкРНК в тканях, погруженных в парафин. Однако конкретный протокол в таких случаях отличается, поскольку ткани, залитые парафином, должны быть депарафинизированы21. Эта экспериментальная процедура может быть применена к 48- или 96-луночным планшетам, но 384-луночные планшеты слишком м...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Авторы заявляют, что у них нет конкурирующих финансовых интересов.

Благодарности

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Эта работа поддержана грантами (1) Национальной программы ключевых исследований и разработок Китая (2020YFE0201600); (2) Национальный фонд естественных наук (81973877 и 82174408); (3) Шанхайский совместный инновационный центр промышленной трансформации подготовки к ТКМ в больницах; (4) Исследовательские проекты в рамках бюджета Шанхайского университета традиционной китайской медицины (2021LK047).

    

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
Автоматический счетчик клетокShanghai Simo Biological Technology Co., LtdIC1000Подсчет клеток
Пластина для культивирования клеток-12Shanghai YueNian Biotechnology Co., Ltd3513,corningПоместите покровные стекла в пластину
  Клеточная линия (143B)Банк клеток Китайской академии наукCRL-8303клеточная линия остеосаркомы рака
Центрифуга пробирка (15 мл, 50 мл)Shanghai YueNian Biotechnology Co., Ltd  430790,Центрифуга
Покровные стеклаShanghai YueNian Biotechnology Co., Ltdabs7026Клетки засеяны на покровные стекла
Cy3 label-SNHG6 DNA probeShanghai GenePharma Co.,LtdA10005Обнаружить местоположение SNHG6
DMEM mediaShanghai YueNian Biotechnology Co., LtdLM-E1141Клеточная культура среда
Инкубатор для сухой ванныХаймен Килин-Белл Лаб Инструменты Ко., Лтд.DKT200-2 Инкубация при разных высоких температурах
Этанол 100% Sinopharm Chemical ReagentCo., Ltd10009218дегидратационный
флуоресцентный микроскопShanghai Waihai Biotechnology Co., LTDOlympus BX43 оснащен камерой Olympus U-TV0.5XC-3 (SN:5J01719),Инкубатор наблюденияи позиционирования
Olympus Shanghai Yiheng Scientific Instrument Co., LtdDHP-9051Образцы инкубировали при температуре 37 °C.
Монтаж MediumSangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd.E675004Прикрепите покровные стекла к шейкеру слайдов
Haimen Kylin-Bell Lab Instruments Co., Ltd.TS-8SПромывочный образец
SlideShanghai YueNian Biotechnology Co., Ltd188105Покровные стекла размещены на слайде
Triton X-100Sangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd.A600198Проницаемая мембрана и ядерная мембрана
  Трипсин (0.25%)Shanghai YueNian Biotechnology Co., Ltd25200056, Gibcoлечение клеток трипсином
Tween-20Sangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd.A600560моющее средство
Corning клетки

Ссылки

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Djebali, S., et al. Landscape of transcription in human cells. Nature. 489 (7414), 101-108 (2012).
  2. Li, C. H., Chen, Y. Insight into the role of long noncoding RNA in cancer development and progression. International Review of Cell and Molecular Biology. 326, 33-65 (2016).
  3. Pan, R., et al. lncRNA FBXL19-AS1 regulates osteosarcoma cell proliferation, migration and invasion by sponging miR-346. OncoTargets and Therapy. 11, 8409-8420 (2018).
  4. Jia, D., Niu, Y., Li, D., Liu, Z. lncRNA C2dat1 promotes cell proliferation, migration, and invasion by targeting miR-34a-5p in osteosarcoma cells. Oncology Research. 26 (5), 753-764 (2018).
  5. Liu, Y., Wang, D., Ji, Q., Yan, J. LncRNA MATN1-AS1 for prediction of prognosis in osteosarcoma patients and its cellular function. Molecular Biotechnology. 64 (1), 66-74 (2022).
  6. Luo, M. L. Methods to study long noncoding RNA biology in cancer. Advances in Experimental Medicine and Biology. 927, 69-107 (2016).
  7. Zhao, A., et al. lncRNA TUSC7 inhibits osteosarcoma progression through the miR-181a/RASSF6 axis. International Journal of Molecular Medicine. 47 (2), 583-594 (2021).
  8. Tong, C. J., et al. LncRNA RUSC1-AS1 promotes osteosarcoma progression through regulating the miR-340-5p and PI3K/AKT pathway. Aging. 13 (16), 20116-20130 (2021).
  9. Qi, X., et al. ceRNA in cancer: possible functions and clinical implications. Journal of Medical Genetics. 52 (10), 710-718 (2015).
  10. Tripathi, V., Fei, J., Ha, T., Prasanth, K. V. RNA fluorescence in situ hybridization in cultured mammalian cells. Methods in Molecular Biology. 1206, 123-136 (2015).
  11. Femino, A. M., Fay, F. S., Fogarty, K., Singer, R. H. Visualization of single RNA transcripts in situ. Science. 280 (5363), 585-590 (1998).
  12. Thomsen, R., Nielsen, P. S., Jensen, T. H. Dramatically improved RNA in situ hybridization signals using LNA-modified probes. RNA. 11 (11), 1745-1748 (2005).
  13. Player, A. N., Shen, L. P., Kenny, D., Antao, V. P., Kolberg, J. A. Single-copy gene detection using branched DNA (bDNA) in situ hybridization. The Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 49 (5), 603-612 (2001).
  14. Hazra, R., Spector, D. L. Simultaneous visualization of RNA transcripts and proteins in whole-mount mouse preimplantation embryos using single-molecule fluorescence in situ hybridization and immunofluorescence microscopy. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 10, 986261(2022).
  15. Xu, M., et al. lncRNA SNHG6 regulates EZH2 expression by sponging miR-26a/b and miR-214 in colorectal cancer. Journal of Hematology & Oncology. 12 (1), 3(2019).
  16. Yan, K., Tian, J., Shi, W., Xia, H., Zhu, Y. LncRNA SNHG6 is associated with poor prognosis of gastric cancer and promotes cell proliferation and EMT through epigenetically silencing p27 and sponging miR-101-3p. Cellular Physiology and Biochemistry: International Journal of Experimental Cellular Physiology, Biochemistry, and Pharmacology. 42 (3), 999-1012 (2017).
  17. Zhu, X., Yang, G., Xu, J., Zhang, C. Silencing of SNHG6 induced cell autophagy by targeting miR-26a-5p/ULK1 signaling pathway in human osteosarcoma. Cancer Cell International. 19, 82(2019).
  18. Birgani, M. T., et al. Long non-coding RNA SNHG6 as a potential biomarker for hepatocellular carcinoma. Pathology Oncology Research: POR. 24 (2), 329-337 (2018).
  19. Nielsen, B. S., et al. Detection of lncRNA by LNA-based in situ hybridization in paraffin-embedded cancer cell spheroids. Methods in Molecular Biology. 2348, 123-137 (2021).
  20. Li, Y., et al. Long noncoding RNA SNHG6 regulates p21 expression via activation of the JNK pathway and regulation of EZH2 in gastric cancer cells. Life Sciences. 208, 295-304 (2018).
  21. Traylor-Knowles, N. In situ hybridization techniques for paraffin-embedded adult coral samples. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (138), e57853(2018).
  22. Wang, S. Single molecule RNA FISH (smFISH) in whole-mount mouse embryonic organs. Current Protocols in Cell Biology. 83 (1), 79(2019).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на повторное использование текста или иллюстраций этой статьи JoVE

Запросить разрешение

Теги

FISHlncRNASNHG6DAPI

Похожие статьи