Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.

Методическая статья

Аффинная очистка фибринолитического фермента из Sipunculus nudus

2.8K просмотров

⸱

DOI:

10.3791/65631

⸱

2 июня 2023 г.

 ,  ,  , 
1Medicine School, Huaqiao University, 2Engineering Research Centre of Molecular Medicine of Ministry of Education

В этой статье

Краткое содержание

Здесь мы представляем метод аффинной очистки фибринолитического фермента из Sipunculus nudus , который является простым, недорогим и эффективным.

Аннотация

Фибринолитический фермент из Sipunculus nudus (sFE) является новым фибринолитическим агентом, который может как активировать плазминоген в плазмин, так и напрямую расщеплять фибрин, демонстрируя большие преимущества по сравнению с традиционными тромболитическими агентами. Однако из-за недостатка структурной информации все программы очистки sFE основаны на многоступенчатых хроматографических очистках, которые являются слишком сложными и дорогостоящими. Здесь впервые разработан протокол аффинной очистки sFE на основе кристаллической структуры sFE; он включает в себя подготовку сырого образца и колонки аффинной хроматографии лизина/аргинин-агарозной матрицы, аффинную очистку и характеристику очищенного sFE. Следуя этому протоколу, партия sFE может быть очищена в течение 1 дня. Кроме того, чистота и активность очищенного sFE увеличивается до 92% и 19 200 Ед/мл соответственно. Таким образом, это простой, недорогой и эффективный подход к очистке sFE. Разработка этого протокола имеет большое значение для дальнейшего использования sFE и других подобных агентов.

Введение

Тромбоз представляет собой серьезную угрозу для здоровья населения, особенно после глобальной пандемии Covid-19 1,2. Клинически многие активаторы плазминогена (ПА), такие как активатор плазминогена тканевого типа (tPA) и урокиназа (Великобритания), широко используются в качестве тромболитических препаратов. ПА могут активировать плазминоген пациентов в активный плазмин для расщепления фибрина. Таким образом, их тромболитическая эффективность сильно ограничена плазминогенным статусом пациентов 3,4. Фибринолитические агенты, такие как металлопротеиназная плазмина и сериновый плазмин, являются еще одним типом клинических тромболитических препаратов, которые также включают фибринолитические ферменты (ФЭ), такие как плазмин, которые могут растворять сгустки напрямую, но быстро инактивируются различными ингибиторами плазмина5. Впоследствии сообщалось о новом типе фибринолитического агента, который может растворять тромб, не только активируя плазминоген в плазмин, но и разлагая непосредственно фибрин 6-фибринолитический фермент древнего арахисового червя Sipunculus nudus (sFE)6. Эта бифункция наделяет sFE другими преимуществами по сравнению с традиционными тромболитическими препаратами, особенно с точки зрения аномального статуса плазминогена. По сравнению с другими бифункциональными фибринолитическими агентами 7,8,9, sFE демонстрирует ряд преимуществ, включая безопасность, по сравнению с непищевыми агентами для разработки лекарств, особенно для пероральных препаратов. Это связано с тем, что биобезопасность и биосовместимость Sipunculus nudus хорошо известны10.

Подобно другим природным фибринолитическим агентам, выделенным из микроорганизмов, дождевых червей и грибов, очистка sFE от S. nudus очень сложна и включает в себя несколько этапов, таких как гомогенизация тканей, осаждение сульфата аммония, опреснение, анионообменная хроматография, хроматография гидрофобного взаимодействия и молекулярное просеивание10,11,12. Такая система очистки не только зависит от профессиональных навыков и дорогостоящих материалов, но и требует нескольких дней для завершения всей процедуры. Поэтому простая программа очистки sFE имеет большое значение для дальнейшего развития sFE. К счастью, два кристалла sFE (PDB: 8HZP; PDB: 8HZO) были успешно получены (см. Дополнительный файл 1 и Дополнительный файл 2). Благодаря структурному анализу и экспериментам по молекулярному стыковочному соединению мы обнаружили, что каталитическое ядро sFE может специфически связываться с мишенями, содержащими остатки аргинина или лизина.

Здесь впервые предложена система аффинной очистки, основанная на кристаллической структуре sFE. Следуя этому протоколу, высокочистый и высокоактивный sFE может быть очищен от сырых экстрактов на одной стадии аффинной очистки. Разработанный здесь протокол важен не только для крупномасштабного приготовления sFE, но также может быть применен для очистки других фибринолитических агентов.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

1. Подготовка

  1. Обработка образцов
    1. Тщательно препарируют свежий S. nudus (100 г) и собирают кишечник и его внутреннюю жидкость.
    2. Добавьте 300 мл буфера Tris-HCl (0,02 М, pH 7,4) для гомогенизации (1000 об/мин, 60 с).
    3. Заморозьте-разморозьте гомогенат 3 раза.
    4. Центрифугируют пробу (10,956 × г, 0,5 ч, 4 °C) и собирают надосадочную жидкость. Храните образец при температуре 4 °C до дальнейшего использования.
  2. Осаждение белка
    1. Смешайте надосадочную жидкость с насыщенным раствором сульфата аммония (девять объемов) и дайте смеси настояться 12 ч при 4 °C.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Протокол может быть поставлен на паузу здесь и продолжен позже.
    2. Центрифуга (10,956 × г, 0,5 ч, 4 °С) для получения белкового осадка; хранить при температуре 4 °C для последующего использования.
  3. Ресуспендирование белка
    1. Ресуспендируют белковый осадок с 30 мл буфера Tris-HCl (0,02 М, рН 7,4). Храните этот раствор сырого протеина при температуре 4 °C для последующего использования.

2. Аффинная хроматография

  1. Фильтрация раствора
    1. Отфильтруйте раствор сырого белка через фильтрующую мембрану 0,22 мкм. Храните этот образец при температуре 4 °C для последующего использования.
  2. Упаковка колонн
    1. Упакуйте колонку аффинной хроматографии аргинин-агарозной матрицы и колонку аффинной хроматографии лизин-агарозной матрицы, загрузив соответствующее количество матричной среды лизин-агарозы и матричной среды аргинин-агарозы в пустые хроматографические колонки объемом 5 мл.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Колонку можно хранить при температуре 2-8 °C, при этом матрица погружена в буфер хранения (20% этанол).
  3. Аффинное очищение
    1. Сначала уравновесьте колонку аффинной хроматографии ddH2O (1 мл / мин, объем 10 колонок), а затем буфер Tris-HCl (0,02 М, pH 8,0, 1 мл / мин, 5 объемов колонки).
    2. Загрузите образец белкового раствора в предварительно уравновешенную колонку (1 мл/мин, объем 1/3 колонки).
      ПРИМЕЧАНИЕ: Объем загрузки пробы зависит от концентрации sFE.
    3. Промойте колонку буфером Tris-HCl (0,02 М, рН 8,0, пять объемов колонки).
    4. Последовательно нанесите на колонну 0,15 М, 0,25 М, 0,35 М, 0,45 М, 0,55 М и 0,65 М NaCl (1 мл/мин, пять объемов колонны).
    5. Найдите пик элюирования, который должен появиться в элюировании NaCl 0,15 М, а затем соберите фракции в пробирки объемом 5 мл.
    6. Концентратируют элюирующий образец с помощью ультрацентробежного фильтра 3 кДа (3,944 × г, 1,5 ч, 4 °C). Храните этот образец при температуре -80 °C для последующего использования.

3. Оценка чистоты

  1. Приготовление геля для электрофореза полиакриламидного геля додецилсульфата натрия (SDS-PAGE)
    1. Приготовьте гель SDS-PAGE по методу Леммли, используя 5% концентрированный гель и 12% разделительный гель13.
  2. Электрофорез
    1. Смешайте образец (15 мкл) с 5-кратным буфером загрузки белка SDS-PAGE (1/4 объема), нагрейте в кипящей воде в течение 5 мин, загрузите на гель SDS-PAGE и запустите гель при напряжении 80 В, 60 мА в течение 1,5 часа.
  3. Анализ
    1. После электрофореза окрашивают гель с помощью набора Silver Stain Kit, согласно протоколу производителя, и наблюдают за окрашенным гелем с помощью хемилюминесцентной системы визуализации.
    2. Проанализируйте чистоту целевого белка по следующей формуле: чистота целевого белка = значение интенсивности целевого белка / значение интенсивности общего белка.

4. Оценка фибринолитической активности

  1. Подготовка фибриновой пластины
    1. Приготовьте раствор фибриногена, смешав 25 мг фибриногена с 1,25 мл физиологического раствора.
    2. Приготовьте раствор тромбина, полностью смешав 100 ЕД тромбина с 1,05 мл физиологического раствора.
    3. Приготовьте раствор агарозы, добавив 0,5 г агарозы к 22,5 мл буфера Tris-HCl (0,02 моль/л, рН 7,4). Смешайте и нагрейте раствор агарозы при 100 °C до полного растворения.
    4. Охладите раствор агарозы примерно до 50 °C и добавьте раствор фибриногена. Затем сразу же добавьте раствор тромбина, быстро перемешайте и вылейте в культуральную чашку диаметром 60 мм.
  2. Погрузка
    1. Пробить 3-миллиметровые лунки на подготовленных фибриновых пластинах с помощью стерильного бура и заполнить лунки образцами 10 мкл.
  3. Анализ
    1. После 18 ч инкубации при 37 °C измерьте фибринолитическую активность, вычислив размер их зон разложения. Фибринолитическая активность = (размер зоны образца / размер зоны урокиназы) x 100 ед. Размер зоны = диаметр х диаметр.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Физиологический солевой буфер, сырой протеин (образец, полученный на этапе протокола 1.3.1) и урокиназа использовались для холостого, отрицательного и положительного контроля соответственно. По сравнению с урокиназой мы обнаружили, что фибринолитическая активность очищенного sFE составляет ~ 19 200 Ед / мл.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

В соответствии с этим протоколом были извлечены лизаты сырой ткани, построены колонки хроматографии с аффинностью аргинин-агарозного матрикса и лизин-агарозного матричного матрикса, получен очищенный sFE, а чистота и фибринолитическая активность очищенного sFE были измерены с помощью SDS-PAGE и фибриновых планшетов соответственно.

После центрифугирования собранная надосадочная жидкость представляла собой прозрачную вязкую жидкость коричневого цвета. Осаждение началось, когда эту надосадочную ж...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

Из-за отсутствия точной последовательности генов sFE используемый в настоящее время sFE был извлечен из свежего S. nudus14. Кроме того, процедуры очистки sFE, описанные в литературе, были сложными и дорогостоящими, поскольку они основывались на некоторых общих характеристиках sFE, таких как молекулярная масса, изоэлектрическая точка, ионная сила и полярность15,16. До настоящего времени не сообщалось о протоколе аффинной очистки sF...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

У авторов нет конфликтов интересов, которые необходимо раскрывать.

Благодарности

Это исследование финансировалось Научно-техническим бюро города Сямынь (3502Z20227197) и Научно-техническим бюро провинции Фуцзянь (No 2019J01070, No 2021Y0027).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
30% Акриламид-Бисакриламид (29:1)Biosharp
2-МеркаптоэтанолSolarbio
Agarose G-10Биовест
Персульфат аммонияSINOPHARM
Сульфат аммонияSINOPHARM
Аргинин-Сефароза 4BSolarbioАргинин-агарозная матрица
Бромоксиленол Синий (BPB)Solarbio
Fast Silver Stain Stain Набор для окрашиванияBeyotime
FibrinogenMerck
Glycine Solarbio
Соляная кислотаSINOPHARM
KinaseRHAWN
Лизин-Сефароза 4BSolarbioЛизин-агарозный матрикс
N,N,N',N'-Тетраметилэтилендиамин (TEMED)Сигма-Олдрич
Прекрасный маркер цветного белка (10-170 кД)Beyotime
Sodium хлоридSINOPHARM
Додецилсульфонат натрия (SDS)Сигма-Олдрич
гидроксиднатрияSINOPHARM
ТромбинMeilunbio
Tris(Гидроксиметил) АминометанSolarbio
Tris(Гидроксиметил) Аминометан гидрохлоридSolarbio
Equipment
AKT Система очистки белка чистыйGE
Автоматический вертикальный паровой стерилизатор MLS-3750SANYO
Система хемилюминесцентной визуализации
Насос постоянного потока BT-100QITE
Инкубатор постоянной температурыJINGHONG
Настольная центрифуга с охлаждением 3-30KSСерия Sigma
DHG Нагревательная и сушильная печь DGG-9140ADSENXIN
Электрический гомогенизатор стекла DY89-IISCIENTZ
Электронные аналитические весыDENVER
Электротермостатическая водяная баня DK-S12Шейкер горизонтального
Машина для льда Kylin-Bell
AF 103Scotsman
KQ-500E Ультразвуковой очиститель МагнитнаяShuMei
Zhi wei
Микроохлаждаемая центрифуга H1650-WCence
Микроволновая печьGalanz
Milli-Q Reference Milli-Q ДозаторMilli-Pore
ThermoFisher Scientific
Прецизионный настольный pH-метрСарториозный
малогабаритный вихревой генераторKylin-Bell
Биорад
<прочный>Расходный материал 
200 &микро; L Пробирка для ПЦР (200 & микро; L)Пробирка
(1,5 мл)
(5 мл)
(50 мл)
(7 мл)Biosharp
(60 мм)
(0,22 & микро; m)Millex GP
ParafilmBemis
(1 мл )KIRGEN
(10 & микро; L)Axygene
(200 & микро; L)Axygene
Ультрацентробежный фильтрующий блок
Ultra (4 мл 3 кДа)Универсальный индикатор pH Millipore
реагент
серебра GE обесцвечивания SENXIN мешалка Система вертикального электрофореза для центрифуги Axygene Пробирка для центрифуги Biosharp Пробирка для центрифуги Biosharp Пробирка для центрифуги NEST Чашка для культуры Фильтровальная мембрана NEST Наконечник для пипетки Наконечник для пипетки Наконечник для пипетки Специальная индикаторная бумага TZAKZY (15 мл 3 кДа)Ультрацентробежный фильтрующий блок Millipore SSS

Ссылки

  1. Rosell, A., et al. Patients with COVID-19 have elevated levels of circulating extracellular vesicle tissue factor activity that is associated with severity and mortality-brief report. Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 41 (2), 878-882 (2021).
  2. Schultz, N. H., et al. Thrombosis and thrombocytopenia after ChAdOx1 nCoV-19 vaccination. The New England. Journal of Medicine. 384 (22), 2124-2130 (2021).
  3. von Kaulla, K. N. Urokinase-induced fibrinolysis of human standard clots. Nature. 184 (4695), 1320-1321 (1959).
  4. Van de Werf, F., et al. Coronary thrombolysis with tissue-type plasminogen activator in patients with evolving myocardial infarction. The New England Journal of Medicine. 310 (10), 609-613 (1984).
  5. Schaller, J., Gerber, S. S. The plasmin-antiplasmin system: structural and functional aspects. Cellular and Molecular Life Sciences. 68 (5), 785-801 (2011).
  6. Ge, Y. -H., et al. A novel antithrombotic protease from marine worm Sipunculus nudus. International Journal of Molecular Sciences. 19 (10), 3023(2018).
  7. Liu, X., et al. Purification and characterization of a novel fibrinolytic enzyme from culture supernatant of Pleurotus ostreatus. Journal of Microbiology and Biotechnology. 24 (2), 245-253 (2014).
  8. Choi, J. -H., Sapkota, K., Kim, S., Kim, S. -J. Starase: A bi-functional fibrinolytic protease from hepatic caeca of Asterina pectinifera displays antithrombotic potential. Biochimie. 105, 45-57 (2014).
  9. Liu, H., et al. A novel fibrinolytic protein From Pheretima vulgaris: purification, identification, antithrombotic evaluation, and mechanisms investigation. Frontiers in Molecular Biosciences. 8, 772419(2022).
  10. Wu, Y., et al. Antioxidant, hypolipidemic and hepatic protective activities of polysaccharides from Phascolosoma esculenta. Marine Drugs. 18 (3), 158(2020).
  11. Xu, R., Ma, G., Chen, L., Cui, X. Preparation and application of natural fibrinolytic enzyme from peanut worm. , Available from: https://patents.google.com/patent/CN109295042A/en (2019).
  12. Li, W., Yuan, M., Wu, Y., Xu, R. Identification of genes expressed differentially in female and male gametes of Sipunculus nudus. Aquaculture Research. 51 (9), 3780-3789 (2020).
  13. Ossipow, V., Laemmlii, U. K., Schibler, U. A simple method to renature DNA-binding proteins separated by SDS-polyacrylamide gel electrophoresis. Nucleic Acids Research. 21 (25), 6040-6041 (1993).
  14. Hsu, T., Ning, Y., Gwo, J., Zeng, Z. DNA barcoding reveals cryptic diversity in the peanut worm Sipunculus nudus. Molecular Ecology Resources. 13 (4), 596-606 (2013).
  15. Abiko, Y., Iwamoto, M., Shimizu, M. Plasminogen-plasmin system. I. Purification and properties of human plasminogen. The Journal of Biochemistry. 64 (6), 743-750 (1968).
  16. Abiko, Y., Iwamoto, M., Shimizu, M. Plasminogen-plasmin system. II. Purification and properties of human plasmin. The Journal of Biochemistry. 64 (6), 751-757 (1968).
  17. Wiman, B. Affinity-chromatographic purification of human α2-antiplasmin. The Biochemical Journal. 191 (1), 229-232 (1980).
  18. Sandbjerg Hansen, M., Clemmensen, I. Partial purification and characterization of a new fast-acting plasmin inhibitor from human platelets. Evidence for non-identity with the known plasma proteinase inhibitors. The Biochemical Journal. 187 (1), 173-180 (1980).
  19. Pietrocola, G., Rindi, S., Nobile, G., Speziale, P. Purification of human plasma/cellular fibronectin and fibronectin fragments. Fibrosis. 1627, 309-324 (2017).
  20. Nabiabad, H. S., Yaghoobi, M. M., Javaran, M. J., Hosseinkhani, S. Expression analysis and purification of human recombinant tissue type plasminogen activator (rt-PA) from transgenic tobacco plants. Preparative Biochemistry and Biotechnology. 41 (2), 175-186 (2011).
  21. Shearin, T. V., Pizzo, S. V., Gonzalez-Gronow, M. Molecular abnormalities of human plasminogen isolated from synovial fluid of rheumatoid arthritis patients. Journal of Molecular Medicine. 75 (5), 378-385 (1997).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Больше статей

Осаждение белкааргининовая агарозализиновая агарозааффинная хроматографияанализ на фибриновых планшетахградиентное элюированиефибринолитическая активность
Аффинная очистка фибринолитического фермента из Sipunculus nudus
Связаться с нами
Порекомендовать библиотеке

Конфиденциальность

Условия использования

Политики

© 2026 MyJoVE Corporation. Все права защищены.