Методическая статья

Платформа для количественного обнаружения иммунных клеток эндометрия на основе иммуногистохимии и анализа цифровых изображений

DOI:

10.3791/65643

⸱

13 октября 2023 г.

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Shenzhen Key Laboratory of Reproductive Immunology for Peri-implantation, Shenzhen Zhongshan Institute for Reproduction and Genetics, Fertility Center, Shenzhen Zhongshan Urology Hospital, 2Shenzhen Jinxin Medical Technology Innovation Center, Co., Ltd.

В этой статье

Краткое содержание

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Здесь была разработана и валидирована цифровая платформа иммуногистохимического анализа изображений для количественного анализа иммунных клеток эндометрия пациенток с повторяющимися выкидышами в окне имплантации.

Аннотация

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Для оценки иммунного микроокружения эндометрия пациенток с привычным невынашиванием беременности (РМ) была разработана и валидирована цифровая платформа иммуногистохимического анализа изображений для количественного анализа иммунных клеток эндометрия в середине лютеиновой фазы. Все образцы эндометрия были собраны во время среднелютеиновой фазы менструального цикла. Залитые парафином ткани эндометрия разделяли на предметные стекла толщиной 4 мкм, и проводили иммуногистохимическое (ИГХ) окрашивание для выявления иммунных клеток эндометрия, включая CD56+ мNK-клетки, Foxp3+ Tregs, CD163+ M2-макрофаги, CD1a+ DC и CD8+ Т-клетки. Панорамные слайды сканировались с помощью цифрового сканера слайдов, а для количественного анализа использовалась коммерческая система анализа изображений. Процентное содержание иммунных клеток эндометрия рассчитывали путем деления количества иммунных клеток в общем количестве клеток эндометрия. Используя коммерческую систему анализа изображений, можно легко и точно проанализировать количественную оценку иммунных клеток эндометрия, которые трудно или невозможно проанализировать с помощью обычного анализа изображений. Данная методика может быть применена для количественной характеристики микроокружения эндометрия, в том числе взаимодействия между иммунными клетками, и его гетерогенности у пациентов с различными репродуктивными пороками. Платформа для количественной оценки иммунных клеток эндометрия может иметь важное клиническое значение для диагностики и лечения пациенток с РМ.

Введение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Привычный выкидыш (РМ) представляет собой потерю двух или более последовательных беременностей и является сложным заболеванием, привлекающим внимание клиницистов в последние годы. Частота РМ у женщин детородного возраста составляет 1%-5%1. Результаты предыдущих исследований показывают, что иммунные факторы тесно связаны с патогенезом РМ 2,3,4,5. Поддержание иммунного гомеостаза на границе между матерью и плодом необходимо для имплантации и развития эмбриона. Иммунные клетки эндометрия выполняют несколько регуляторных ролей для поддержания этого гомеостаза, таких как стимулирование инвазии трофобласта, ремоделирование спиральных артерий и содействие развитию плаценты 6,7,8,9.

Ранее сообщалось об аберрантных иммунных клетках эндометрия у женщин с РМ. Результаты показывают тесную связь между высокой плотностью маточных естественных киллеров (uNK) и возникновением RM10,11,12. Сообщалось о повышенном количестве макрофагов в эндометрии женщин с РМ по сравнению с теми, кто родился живым13. Регуляторные Т-клетки (Treg) играют роль в материнской иммунной толерантности к эмбриону, и их уровень и функция снижены в децидуа пациентов с РМ14. Цитотоксичность Т-клеток (ЦТЛ) и дендритных клеток (ДК) также играют роль в иммунной регуляции беременности15,16. Таким образом, комплексный количественный анализ локальных иммунных клеток эндометрия в середине лютеиновой фазы может помочь лучше понять патогенез РМ. Некоторые современные методы количественного анализа иммунных клеток эндометрия используют проточную цитометрию, которая может точно помечать иммунные клетки несколькими маркерами17,18. Однако клиническое применение проточной цитометрии ограничено, поскольку она может быть выполнена только на свежих тканях. Получение свежей ткани возможно только при наличии большого объема избыточной опухоли, что является редким явлением для эндометрия. Иммуногистохимия может хорошо наблюдать морфологию тканей in situ, а также может маркировать различные иммунные клетки, в то время как традиционные иммуногистохимические методы не могут выполнять количественный анализ иммунных клеток.

По сравнению с обычными иммуногистохимическими экспериментами, количественный иммуногистохимический анализ иммунных клеток эндометрия имеет важное клиническое значение. Оценка интенсивности ИГХ обычно оценивается по четырехбалльной шкале или по сильной и слабой в патологической диагностике и исследованиях 19,20,21. Однако этот полуколичественный метод является субъективным, крайне неточным и демонстрирует значительную внутринаблюдательную и межнаблюдательную изменчивость22. Одним из возможных решений является применение машинного обучения, которое является ценным в цифровом анализе изображений23,24. Обеспечивая количественные измерения, этот подход позволяет более точно оценить инфильтрацию, распределение и плотность иммунных клеток в ткани матки. Эта количественная информация может помочь пролить свет на динамические изменения популяций иммунных клеток во время менструального цикла и при различных патологических состояниях. В целом, возможность количественного анализа иммунных клеток эндометрия с помощью иммуногистохимии дает ценную информацию об иммунном микроокружении матки.

Таким образом, протокол был направлен на разработку и валидацию цифровой платформы иммуногистохимического анализа изображений для количественного анализа иммунных клеток эндометрия, включая uNK-клетки, Tregs, макрофаги, ДК и цитотоксические Т-клетки во время средней лютеиновой фазы у пациентов с РМ.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Содержание и протокол исследования были этически проверены и одобрены комитетом по этике исследований урологической больницы Шэньчжэнь Чжуншань. Все женщины (в возрасте от 20 до 40 лет), участвовавшие в исследовании, дали информированное согласие на сбор и использование образцов.

1. Приобретение патологической ткани

  1. Подготовьте инструменты для сбора ткани, а именно: измерительную линейку, пинцет, закладную кассету, бумагу для закладки и корзину для салфеток.
  2. Понаблюдайте за тем, достаточно ли количества эндометриальной ткани (размером больше маша), собранной с помощью стандартного подхода с помощью пипетильного катетера.
  3. Перенесите эндометриальную ткань из формалина на бумагу для закладки пинцетом и измерьте размеры ткани эндометрия линейкой.
  4. Оберните эндометриальную ткань бумагой для закладки и поместите в кассету для закладки.
  5. Поместите закладную кассету в корзину для салфеток для обезвоживания.

2. Обезвоживание тканей

  1. Поместите корзину для тканей в реакционную камеру дегидратора (см. Таблицу материалов) и приступайте к процедуре рутинного обезвоживания тканей: формалин на 100 мин; формалин в течение 100 мин; 75% спирта в течение 60 мин; 85% спирт в течение 60 мин; 95% спирта в течение 60 мин; 100% спирт в течение 60 мин; 100% спирт в течение 60 мин; 100% спирт в течение 60 мин; ксилол в течение 35 мин; ксилол в течение 20 мин; ксилол в течение 20 мин; воск в течение 80 мин; воск в течение 80 мин; воск в течение 80 мин. Процесс занимает около 15 часов.
  2. По окончании процедуры обезвоживания тканей откройте реакционную камеру дегидратора, извлеките корзину для тканей.

3. Встраивание тканей

  1. Выньте подходящую форму для закладки в соответствии с размером образца и заполните парафином при температуре 70 ° C.
  2. Быстро поместите ткань в форму и аккуратно отрегулируйте так, чтобы ткань располагалась в центре формы.
  3. Плавно переместите форму к охлаждающей пластине и осторожно прижмите ткань, пока парафин на дне застывает.
  4. Положите закладную кассету поверх формы и долейте еще воска.
  5. Поместите форму на охлаждающую пластину и, когда парафин полностью затвердеет, снимите блок с прикрепленной кассетой подальше от формы.

4. Срезы тканей

  1. Вставьте блок в зажим для образца микротома, поместите лезвие в держатель, отрегулируйте угол между плоскостью блока и лезвием, отрегулируйте толщину участка до 4 мкм, поверните маховик и начните нарезку.
  2. Обнажите соответствующую поверхность ткани, отрезав от блока несколько тонких срезов. Выньте непрерывные и полные участки с помощью кисти.
  3. Когда будет вырезано достаточное количество секций, прекратите вращать маховик, удалите неквалифицированные секции на переднем конце пинцетом и наплавьте секции на поверхности воды с температурой 42 °C на водяной бане с помощью пинцета и щетки.
  4. После того, как секции будут полностью расплющены, соберите секции на противоотрывных горках и переложите в подогреватель горки при температуре 65 °C, чтобы выпекать в течение 60 минут.
  5. Когда выпечка закончится, выньте стеклянные салазки из подогревателя.

5. Иммуногистохимическое окрашивание

  1. Разведите первичное антитело в рабочем растворе с разбавителем антител. Подробнее см. в таблице 1 .
  2. Разбавленный раствор антител поместите в специальный флакон с реагентами, а набор для обнаружения — в отсек для реагентов автоматического инструмента для окрашивания ИГХ (см. таблицу материалов).
  3. Поместите предметные стекла на держатель слайдов, покрытый специальной покровной плиткой, и вставьте их в экспериментальный реакционный отсек прибора.
  4. После того, как прибор автоматически распознает реагент и экспериментальную информацию на предметном стекле, нажмите кнопку «Пуск », чтобы начать иммуногистохимическое окрашивание. Эксперимент длится около 3 часов.

6. Обезвоживание и герметизация предметного стекла

  1. После иммуногистохимического окрашивания выньте держатель предметного стекла, снимите специальную покровную плитку, поместите окрашенный предметный стекол в держатель предметного стекла и смойте остатки красителя на предметном стекле чистой водой.
  2. Переместите держатель предметного стекла в автоматическую тапочку (см. Таблицу материалов), выберите и запустите процедуру обезвоживания и герметизации.
  3. Выньте предметные стекла после обезвоживания и герметизации.

7. Сканирование слайда

  1. Положите предметные стекла на штатив сканера панорамных патологических изображений (см. Таблицу материалов) и поместите его в отсек для сканирования предметных стекол прибора для панорамного сканирования патологических изображений. Сканирование занимает 2 минуты. Смотрите рисунок 1.

8. Анализ изображений

  1. Импорт изображения
    1. Откройте программу для анализа патологических изображений (см. Таблицу материалов) и создайте новую папку. Импорт иммуногистохимических изображений для анализа.
  2. Создание классификатора тканей
    1. Разметьте несколько тканей и пустую аннотацию, чтобы обучить и установить классификатор для идентификации ткани и пустой области соответственно.
    2. Используйте настройку в режиме реального времени, чтобы наблюдать за способностью программного обеспечения распознавать в режиме реального времени во время аннотирования меток. Если распознавание не является своевременным, запишите аннотацию и тренируйтесь снова до тех пор, пока распознавание тканей не станет точным.
  3. Построение алгоритма анализа
    1. Выберите стандартный алгоритм в программном обеспечении в соответствии с типом эксперимента: мультиплексный IHC.
    2. Задайте цветовые параметры распознавания ячеек, выделив типичный отрицательный и положительный пиксель.
      Исходя из этого, задайте параметры ядра, цитоплазмы и клеточной мембраны и наблюдайте за ситуацией распознавания клеток в режиме реального времени до тех пор, пока не будут найдены наиболее подходящие параметры для изображения.
    3. Установите положительный порог распознавания клеток и наблюдайте за ситуацией распознавания в режиме реального времени до тех пор, пока соответствующий порог не будет скорректирован.
    4. Выберите классификатор тканей в алгоритме и проверьте часть ткани в классификаторе тканей, чтобы идентифицировать клетки на основе тканей. На этом создание алгоритма анализа завершено.
  4. Запуск анализа изображений
    1. Выберите область анализа. Используйте установленный алгоритм для анализа изображений.
  5. После завершения анализа программного обеспечения вручную проверьте точность распознавания изображений, включая распознавание тканей, негативное и положительное распознавание клеток.
  6. Если распознавание изображения неточное, снова настройте алгоритм и пороговое значение параметра и повторите анализ изображения до тех пор, пока не будет выполнен успешный анализ. Экспортируйте результаты анализа. Смотрите рисунок 1.
  7. Другие иммунные клетки также могут быть проанализированы в соответствии с вышеуказанными шагами (см. рисунок 1). Устанавливают различные параметры анализа в соответствии с фактической экспрессией различных иммунных маркеров эндометрия (CD56+uNK-клетки, Foxp3+Tregs, CD68+ макрофаги, CD163+M2 макрофаги, CD1a+DCs и CD8+T-клетки25,26).
  8. С помощью расчета программного обеспечения получают долю иммунных клеток эндометрия (см. таблицу 2). Используйте это для оценки уровня различных иммунных клеток в эндометрии пациенток с привычным невынашиванием беременности.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

С целью количественной оценки иммунных клеток эндометрия и снижения нестабильности, вызванной техногенными операционными ошибками, мы создали платформу цифрового количественного анализа иммунных клеток эндометрия с использованием автоматического иммуногистохимического обнаружения и цифровой системы количественной оценки. Создана платформа иммуногистохимического анализа изображений для количественного анализа иммунных клеток эндометрия пациенток с привычным невынашиванием беременности (РМ) в окне имплантации. Все ткани эн...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Этот протокол создал цифровую платформу иммуногистохимического анализа изображений для количественного анализа иммунных клеток эндометрия пациенток с РМ. Здесь было выявлено шесть иммунных маркеров эндометрия для оценки иммунного микроокружения эндометрия у пациенток с РМ.

Восприимчивый эндометрий в середине лютеиновой фазы является ключом к успешной имплантации и беременности27,28. Поэтому оценка процента иммунных клеток эндометрия иг...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Авторам нечего раскрывать.

Благодарности

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Авторы благодарны всем женщинам, которые согласились и пожертвовали образцы для этого исследования.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
Автоматизированный чехолSakurausDRS-Prisma-P-JCS& Film-JC2
CD163GrowGn BiotechnologyNCL-L-CD163
CD1aGene TechGM357129
CD56Gene TechGT200529
CD8NovocastraNCL-L-CD8-4B11
ДегидраторThermo Fisher ExcelsiorES
Digital pathology andIndica labsHALO
Foxp3YILIFANG биологический14-477-82
IHC красительLeicaBOND III
Платформа для анализа изображенийIndica labsHALO
Slide ScannerOlympus для медико-биологических наукVS200

Ссылки

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Practice Committee of the American Society for Reproductive. Evaluation and treatment of recurrent pregnancy loss: a committee opinion. Fertility and Sterility. 98 (5), 1103-1111 (2012).
  2. Dimitriadis, E., Menkhorst, E., Saito, S., Kutteh, W. H., Brosens, J. J. Recurrent pregnancy loss. Nature Reviews. Disease Primers. 6 (1), 98(2020).
  3. Kavvadas, D., et al. Immunohistochemical Evaluation of CD3, CD4, CD8, and CD20 in Decidual and Trophoblastic Tissue Specimens of Patients with Recurrent Pregnancy Loss. 12 (2), 177-193 (2022).
  4. Arora, R., Rathee, A., Sachdeva, M., Agrawal, U. Unexplained repeated pregnancy loss and T helper cells. European Journal of Obstetrics, Gynecology, and Reproductive Biology. 254, 277-283 (2020).
  5. Du, M., et al. Elevated percentage of CD3(+)T cells and pregnancy outcome in women with recurrent pregnancy loss. Clinica Chimica Acta. 486, 341-346 (2018).
  6. Faas, M. M., de Vos, P. Uterine NK cells and macrophages in pregnancy. Placenta. 56, 44-52 (2017).
  7. Huppertz, B., Berghold, V. M., Kawaguchi, R., Gauster, M. A variety of opportunities for immune interactions during trophoblast development and invasion. American Journal of Reproductive Immunology. 67 (5), 349-357 (2012).
  8. Meyer, N., et al. Chymase-producing cells of the innate immune system are required for decidual vascular remodeling and fetal growth. Scientific Reports. 7, 45106(2017).
  9. Smith, S. D., Dunk, C. E., Aplin, J. D., Harris, L. K., Jones, R. L. Evidence for immune cell involvement in decidual spiral arteriole remodeling in early human pregnancy. American Journal of Pathology. 174 (5), 1959-1971 (2009).
  10. Clifford, K., Flanagan, A. M., Regan, L. Endometrial CD56+ natural killer cells in women with recurrent miscarriage: a histomorphometric study. Human Reproduction. 14 (11), 2727-2730 (1999).
  11. Chen, X., et al. Measurement of uterine natural killer cell percentage in the periimplantation endometrium from fertile women and women with recurrent reproductive failure: establishment of a reference range. American Journal of Obstetrics and Gynecology. 217 (6), 680 e1-680 e6 (2017).
  12. Tuckerman, E., Mariee, N., Prakash, A., Li, T. C., Laird, S. Uterine natural killer cells in peri-implantation endometrium from women with repeated implantation failure after IVF. Journal of Reproductive Immunology. 87 (1-2), 60-66 (2010).
  13. Laird, S. M., et al. A review of immune cells and molecules in women with recurrent miscarriage. Human Reproduction Update. 9 (2), 163-174 (2003).
  14. Keller, C. C., Eikmans, M., van der Hoorn, M. P., Lashley, L. Recurrent miscarriages and the association with regulatory T cells; A systematic review. Journal of Reproductive Immunology. 139, 103105(2020).
  15. Vallvé-Juanico, J., Houshdaran, S., Giudice, L. C. The endometrial immune environment of women with endometriosis. Human Reproduction Update. 25 (5), 564-591 (2019).
  16. Yang, F., Zheng, Q., Jin, L. Dynamic Function and Composition Changes of Immune Cells During Normal and Pathological Pregnancy at the Maternal-Fetal Interface. Frontiers in Immunology. 10, 2317(2019).
  17. Hey-Cunningham, A. J., et al. Comprehensive analysis utilizing flow cytometry and immunohistochemistry reveals inflammatory changes in local endometrial and systemic dendritic cell populations in endometriosis. Human Reproduction. 36 (2), 415-428 (2021).
  18. Zhong, Q., et al. Patterns of Immune Infiltration in Endometriosis and Their Relationship to r-AFS Stages. Frontiers in Genetics. 12, 631715(2021).
  19. Attems, J., et al. Neuropathological consensus criteria for the evaluation of Lewy pathology in post-mortem brains: a multi-centre study. Acta Neuropathologic. 141 (2), 159-172 (2021).
  20. Kovacs, G. G., et al. Multisite Assessment of Aging-Related Tau Astrogliopathy (ARTAG). Journal of Neuropathology and Experimental Neurology. 76 (7), 605-619 (2017).
  21. Modis, L. V., et al. Extracellular matrix changes in corneal opacification vary depending on etiology. Molecular Vision. 27, 26-36 (2021).
  22. Walker, R. A. Quantification of immunohistochemistry--issues concerning methods, utility and semiquantitative assessment I. Histopathology. 49 (4), 406-410 (2006).
  23. Jensen, K., Krusenstjerna-Hafstrom, R., Lohse, J., Petersen, K. H., Derand, H. A novel quantitative immunohistochemistry method for precise protein measurements directly in formalin-fixed, paraffin-embedded specimens: analytical performance measuring HER2. Modern Pathology. 30 (2), 180-193 (2017).
  24. Moreno-Ruiz, P., Wik Leiss, L., Mezheyeuski, A., Ehnman, M. Double Immunohistochemistry and Digital Image Analysis. Methods in Molecular Biology. 1913, 3-11 (2019).
  25. Li, D., Zheng, L., Zhao, D., Xu, Y., Wang, Y. The Role of Immune Cells in Recurrent Spontaneous Abortion. Reproductive Sciences. 28 (12), 3303-3315 (2021).
  26. Diao, L., et al. New endometrial immune cell-based score (EI-score) for the prediction of implantation success for patients undergoing IVF/ICSI. Placenta. 99, 180-188 (2020).
  27. Hewitt, S. C., Korach, K. S. Cell biology. A hand to support the implantation window. Science. 331 (6019), 863-864 (2011).
  28. Afshar, Y., Stanculescu, A., Miele, L., Fazleabas, A. T. The role of chorionic gonadotropin and Notch1 in implantation. Journal of Assisted Reproduction and Genetics. 24 (7), 296-302 (2007).
  29. Tan, W. C. C., et al. Overview of multiplex immunohistochemistry/immunofluorescence techniques in the era of cancer immunotherapy. Cancer Communication (London,England). 40 (4), 135-153 (2020).
  30. Algars, A., et al. Type and location of tumor-infiltrating macrophages and lymphatic vessels predict survival of colorectal cancer patients. International Journal of Cancer. 131 (4), 864-873 (2012).
  31. Carey, C. D., et al. Topological analysis reveals a PD-L1-associated microenvironmental niche for Reed-Sternberg cells in Hodgkin lymphoma. Blood. 130 (22), 2420-2430 (2017).
  32. Ascierto, M. L., et al. Transcriptional Mechanisms of Resistance to Anti-PD-1 Therapy. Clinical Cancer Research. 23 (12), 3168-3180 (2017).
  33. O'Rourke, D. M., et al. A single dose of peripherally infused EGFRvIII-directed CAR T cells mediates antigen loss and induces adaptive resistance in patients with recurrent glioblastoma. Science Translational Medicine. 9 (399), eaaa0984(2017).
  34. Canesin, G., et al. Treatment with the WNT5A-mimicking peptide Foxy-5 effectively reduces the metastatic spread of WNT5A-low prostate cancer cells in an orthotopic mouse model. PLoS One. 12 (9), e0184418(2017).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на повторное использование текста или иллюстраций этой статьи JoVE

Запросить разрешение

Теги

Похожие статьи