Одноклеточная сортировка иммунофенотипированных мезенхимальных стволовых клеток отслоившихся молочных зубов человека

Ayona Gupta; Risani Mukhopadhyay; Himanshi Khandelwal; Narendra Nala; Uttara Chakraborty

doi:10.3791/65723

Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.

Методическая статья

Одноклеточная сортировка иммунофенотипированных мезенхимальных стволовых клеток отслоившихся молочных зубов человека

2.7K просмотров

⸱

DOI:

10.3791/65723

⸱

10 ноября 2023 г.

Ayona Gupta^*¹ , Risani Mukhopadhyay^*¹ , Himanshi Khandelwal¹ , Narendra Nala² , Uttara Chakraborty¹

¹Manipal Institute of Regenerative Medicine, Bengaluru, Manipal Academy of Higher Education, Manipal, ²HIV-AIDS Laboratory, Molecular Biology and Genetics Unit, Jawaharlal Nehru Centre for Advanced Scientific Research (JNCASR)

^* These authors contributed equally

В этой статье

Краткое содержание

Данный протокол описывает использование флуоресцентно-активированной сортировки мезенхимальных стволовых клеток человека методом одноклеточной сортировки. В частности, использование сортировки отдельных клеток позволяет достичь 99% чистоты иммунофенотипированных клеток из гетерогенной популяции в сочетании с многопараметрическим подходом, основанным на проточной цитометрии.

Аннотация

Мезенхимальные стволовые клетки (МСК) организма обладают необычайной способностью дифференцироваться в несколько линий взрослых клеток в организме и известны своими иммуномодулирующими и противовоспалительными свойствами. Использование этих стволовых клеток является благом для области регенеративной биологии, но в то же время проклятием для регенеративной медицины и терапии из-за многочисленных клеточных двусмысленностей, связанных с ними. Эти неясности могут возникать из-за разнообразия в источнике этих стволовых клеток и условий их роста in vitro , что отражается на их функциональной гетерогенности.

Это обуславливает необходимость разработки методик получения очищенных, однородных популяций МСК для терапевтического применения. Достижения в области проточной цитометрии позволили обнаружить популяции одиночных клеток с использованием многопараметрического подхода. В этом протоколе описывается способ идентификации и очистки стволовых клеток отслоившихся молочных зубов человека (SHED) с помощью флуоресцентной сортировки отдельных клеток. Одновременная экспрессия поверхностных маркеров, а именно CD90-флуоресцеина изотиоцианата (FITC), CD73-перидинин-хлорофилла-белка (PerCP-Cy5.5), CD105-аллофикоцианина (APC) и CD44-V450, позволила идентифицировать «яркие» положительные экспрессоры МСК с помощью мультипараметрической проточной цитометрии. Тем не менее, наблюдалось значительное снижение процентного соотношения четырехкратных экспрессоров этих положительных маркеров, начиная с пассажа 7 и далее.

Иммунофенотипированные субпопуляции сортировали с использованием режима одноклеточной сортировки, где только два положительных и один отрицательный маркер составляли критерии включения. Эта методология обеспечивала жизнеспособность клеток отсортированных популяций и поддерживала пролиферацию клеток после сортировки. Нисходящее приложение для такой сортировки может быть использовано для оценки линейно-специфической дифференциации для закрытых субпопуляций. Этот подход может быть применен к другим одноклеточным системам для улучшения условий изоляции и получения информации о множественных маркерах клеточной поверхности.

Введение

Мезенхимальные стволовые клетки (МСК) можно рассматривать как масштабируемый источник клеток, пригодных для клеточной терапии, и можно считать золотым стандартом системы в регенеративной медицине. Эти клетки могут быть выделены из различных источников в организме с различным тканевым происхождением¹. В зависимости от исходной ткани каждый тип МСК демонстрирует неоднозначное поведение in vitro ². Это хорошо видно по их морфологическим и функциональным^{свойствам 3}. Многочисленные исследования показали внутриклональную изменчивость размеров, включая дифференцировку тканей взрослого человека, ....