Method Article

Одноклеточная сортировка иммунофенотипированных мезенхимальных стволовых клеток отслоившихся молочных зубов человека

DOI:

10.3791/65723

⸱

November 10th, 2023

 ,  ,  ,  , 
1Manipal Institute of Regenerative Medicine, Bengaluru, Manipal Academy of Higher Education, Manipal, 2HIV-AIDS Laboratory, Molecular Biology and Genetics Unit, Jawaharlal Nehru Centre for Advanced Scientific Research (JNCASR)

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Данный протокол описывает использование флуоресцентно-активированной сортировки мезенхимальных стволовых клеток человека методом одноклеточной сортировки. В частности, использование сортировки отдельных клеток позволяет достичь 99% чистоты иммунофенотипированных клеток из гетерогенной популяции в сочетании с многопараметрическим подходом, основанным на проточной цитометрии.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Мезенхимальные стволовые клетки (МСК) организма обладают необычайной способностью дифференцироваться в несколько линий взрослых клеток в организме и известны своими иммуномодулирующими и противовоспалительными свойствами. Использование этих стволовых клеток является благом для области регенеративной биологии, но в то же время проклятием для регенеративной медицины и терапии из-за многочисленных клеточных двусмысленностей, связанных с ними. Эти неясности могут возникать из-за разнообразия в источнике этих стволовых клеток и условий их роста in vitro , что отражается на их функциональной гетерогенности.

Это обуславливает необходимость разработки методик получения очищенных, однородных популяций МСК для терапевтического применения. Достижения в области проточной цитометрии позволили обнаружить популяции одиночных клеток с использованием многопараметрического подхода. В этом протоколе описывается способ идентификации и очистки стволовых клеток отслоившихся молочных зубов человека (SHED) с помощью флуоресцентной сортировки отдельных клеток. Одновременная экспрессия поверхностных маркеров, а именно CD90-флуоресцеина изотиоцианата (FITC), CD73-перидинин-хлорофилла-белка (PerCP-Cy5.5), CD105-аллофикоцианина (APC) и CD44-V450, позволила идентифицировать «яркие» положительные экспрессоры МСК с помощью мультипараметрической проточной цитометрии. Тем не менее, наблюдалось значительное снижение процентного соотношения четырехкратных экспрессоров этих положительных маркеров, начиная с пассажа 7 и далее.

Иммунофенотипированные субпопуляции сортировали с использованием режима одноклеточной сортировки, где только два положительных и один отрицательный маркер составляли критерии включения. Эта методология обеспечивала жизнеспособность клеток отсортированных популяций и поддерживала пролиферацию клеток после сортировки. Нисходящее приложение для такой сортировки может быть использовано для оценки линейно-специфической дифференциации для закрытых субпопуляций. Этот подход может быть применен к другим одноклеточным системам для улучшения условий изоляции и получения информации о множественных маркерах клеточной поверхности.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Мезенхимальные стволовые клетки (МСК) можно рассматривать как масштабируемый источник клеток, пригодных для клеточной терапии, и можно считать золотым стандартом системы в регенеративной медицине. Эти клетки могут быть выделены из различных источников в организме с различным тканевым происхождением1. В зависимости от исходной ткани каждый тип МСК демонстрирует неоднозначное поведение in vitro 2. Это хорошо видно по их морфологическим и функциональнымсвойствам 3. Многочисленные исследования показали внутриклональную изменчивость размеров, включая дифференцировку тканей взрослого человека, состояние генома, метаболическую и клеточную архитектуру МСК 2,4.

Иммунофенотипирование клеток является распространенным применением проточной цитометрии для идентификации стволовых клеток, и это было использовано Международным обществом клеточной и генной терапии (ISCT) в 2006 году для назначения списка минимальных критериев для идентификации клеток как МСК. Было установлено, что наряду с пластической приверженностью и способностью дифференцироваться на три линии (остеогенную, хондрогенную и адипогенную) in vitro, ≥95% клеточной популяции должны экспрессировать CD105, CD73, CD90, и эти клетки должны отсутствовать экспрессия (≤2% положительная) CD34, CD45, CD11b, CD14 и HLA-DR, измеренная с помощью проточной цитометрии5. Несмотря на то, что МСК определялись набором биомаркеров в соответствии с минимальными критериями ISCT, их иммунные свойства не могли быть сопоставлены с этими биомаркерами, и возникла необходимость в большем, чем эти критерии, чтобы облегчить количественнуюоценку перекрестных сравнений и клональных вариаций.

Несмотря на руководящие принципы, установленные ISCT, обширные исследования МСК показали, что в этой популяции существует гетерогенность, которая может возникнуть из-за множества факторов, в основном из-за повсеместного характера гетерогенности, возникающей между донорами МСК6, тканевыми источниками7, отдельными клетками в клональной популяции8 и условиями культивирования 2,9. 10. См. Характеристика и очистка этих первичных клеток из различных тканевых источников для обеспечения качества и судьбы клеток являются ключевыми этапами их производства. Необходимость понимания отображаемых вариаций среди генеральной совокупности требует эффективного метода разложения ее на субпопуляции, которые могут быть разделены и собраны по отдельности11. Анализ на уровне отдельных клеток помогает преодолеть проблемы, связанные с межклеточной изменчивостью, уменьшить биологический шум, возникающий в гетерогенной популяции, и дает возможность исследовать и характеризовать редкие клетки12.

В зависимости от цели и выбранных параметров можно использовать несколько методов сортировки и обогащения выбранных популяций. Методы сортировки клеток могут включать в себя как массовую сортировку, так и сортировку отдельных клеток. В то время как массовая сортировка может обогатить целевые популяции с помощью магнитно-активированной сортировки клеток (MACS)13, фракционирования14 и элютриации 15, сортировка отдельных клеток может обогатить более однородные популяции с помощью флуоресцентно-активированной сортировки клеток (FACS)11. Сравнительный анализ каждого из этих методов со своим набором преимуществ и недостатков выделен в таблице 1.

Таблица 1: Сравнительный анализ различных методов: MACS, фракционирование, элютриация и FACS, подчеркивающий различия в их принципе, а также преимущества и недостатки выбора одного метода по сравнению с другим. Сокращения: MACS = Magnetic-activated cell sorting; FACS = флуоресцентно-активированная сортировка клеток. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы скачать эту таблицу.

С момента появления этого метода одноклеточная проточная цитометрия играла важную роль в перечислении16, обнаружении и характеристике специфической клеточной популяции в гетерогенной выборке17. В 2006 году Hewitt et al. заложили основу методологии автоматизированной сортировки клеток для улучшения выделения гомогенных пулов дифференцированных эмбриональных стволовых клеток человека (ЭСК)18. Одноклеточная сортировка обогатила популяцию трансдуцированных GFP чЭСК, способствуя выделению генетически модифицированных клонов, что открыло новое измерение в клинических исследованиях. Для повышения эффективности сортировки обычно используются два подхода; Либо среда для сбора отсортированных популяций модифицируется для поддержания жизнеспособности и пролиферации постсортированных клеток19 , либо алгоритм/программное обеспечение сортировки клеток соответствующим образом модифицируется12.

С развитием технологий коммерческие проточные цитометры и сортировщики клеток смогли помочь решить проблемы, которые были решены при асептической сортировке хрупких и редких клеточных популяций, особенно стволовых клеток различного происхождения. Одной из основных проблем, стоящих перед биологами стволовых клеток, является клональная изоляция плюрипотентных стволовых клеток человека в соответствии с протоколами трансфекции, требуемымив исследованиях редактирования генов. Эта проблема была решена путем сортировки отдельных клеток по 96-луночным планшетам, которые были покрыты мышиными эмбриональными фибробластами (MEF) вместе с добавками и коммерческими низкомолекулярными ингибиторами ROCK. Тем не менее, стратегии выделения клеток могут быть в значительной степени усовершенствованы с использованием индексной сортировки, функции алгоритма сортировки, которая идентифицирует иммунофенотип отдельныхотсортированных клеток. Этот усовершенствованный метод сортировки отдельных клеток помог не только повысить эффективность сортировки стволовых клеток, особенно в отношении редких популяций гемопоэтических стволовых клеток, но и эффективно связать одноклеточные клоны с их последующими функциональными анализами20.

Данная работа посвящена одноклеточной сортировке иммунофенотипированных стволовых клеток из отслоившихся молочных зубов человека (SHEDs) для обогащения субпопуляций с целью изучения их функциональной дифференцировочной способности. Используя комбинацию двух МСК-положительных маркеров, CD90 и CD73, и отрицательного гемопоэтического маркера CD45, МСК были иммунофенотипированы и идентифицированы тусклые и нулевые экспрессоры. На основании иммунофенотипа субпопуляции были идентифицированы как чистые МСК, одиночные положительные и двойные отрицательные популяции. Они были отсортированы с использованием режима одноклеточной сортировки для получения чистых и обогащенных субпопуляций для дальнейших функциональных исследований, чтобы определить, является ли дифференциальная экспрессия маркеров артефактом условий культивирования in vitro или она также оказывает какое-либо влияние на функциональные свойства. Клетки, которые не были однородными экспрессорами «положительных маркеров МСК», были отсортированы для изучения их функциональных свойств.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Этическое одобрение и согласие на участие: Образцы отслоившейся пульпы молочных зубов были получены после получения информированного согласия и полного этического одобрения Стоматологического колледжа и больницы Шри Раджива Ганди (SRGCDS) отделения полости рта и челюстно-лицевой области, Бангалор, в соответствии со стандартами, установленными Комитетом по этическому разрешению больниц, SRGCDS. После этого выделение, культивирование, поддержание и применение SHED были одобрены и в соответствии с рекомендациями, рекомендованными Институциональным комитетом по исследованию стволовых клеток (IC-SCR) при Институте регенеративной медицины Манипала, МАЭ - Бангалор. Подробную информацию обо всех материалах и реагентах, используемых в этом протоколе, см. в таблице материалов .

1. Приготовление реагентов и буферов

  1. Для поддержания культуры
    1. Готовят питательные среды для клеток МСК (10%), используя базальную среду для недифференцированных ЭСК, 10% фетальную бычью сыворотку (FBS), 1% L-глютамин и 1% пенициллин-стрептомицин (Пен-стрептококк) (табл. 2).
    2. Готовят питательные среды для клеток МСК (20%), используя базальную среду для недифференцированных ЭСК, 20% FBS, 1% L-глютамина и 1% стрептококка (табл. 2).
    3. Готовят нейтрализующие среды, используя базальную среду для недифференцированных чЭСК, 1% L-глютамина и 1% антибиотик-антимикотик (Анти-Анти) (табл. 2).
  2. Для проточного цитометрического анализа и сортировки
    1. Приготовьте буфер для окрашивания, используя 2% FBS в фосфатно-солевом буфере (PBS).
    2. Приготовьте исходный раствор 4',6-диамидино-2-фенилиндола (DAPI) (1 мкг/мл), добавив 1 мкл в 1 мл PBS
  3. Для линейной дифференциации МСК
    1. Готовят дифференцировочные среды для остеогенной, хондрогенной и адипогенной дифференцировки в соответствии с составом, описанным в таблице 3. Приготовленные аликвоты хранят при температуре 4 °C в течение всего эксперимента.
    2. Готовят среде с сывороточным голоданием (2% среды), используя базальную среду для недифференцированных ЭСК, 2% FBS, 1% L-глютамина и 1% стрептококка (табл. 2).
ТИП НОСИТЕЛЯНАЗНАЧЕНИЕ СМИСОСТАВ НА 50 мл
ФБССтрептококкL-глютаминБАЗАЛЬНАЯ СРЕДА ДЛЯ НЕДИФФЕРЕНЦИРОВАННЫХ ЧЭСК
10% СМИКультура и обслуживание MSC5 мл500 мкл500 мкл44 мл
20% медиаАнализ КОЕ-Ф10 мл500 мкл500 мкл39 мл
Сывороточный голодание (2%) СМИСреды для контрольных скважин в протоколе дифференциации1 мл500 мкл500 мкл48 мл
Нейтрализующая средаСреда для нейтрализации клеточной суспензии после трипсинизации-500 мкл500 мкл49 мл

Таблица 2: Питательные среды для культивирования и анализа культур. Сокращения: МСК = мезенхимальная стволовая клетка; КОЕ-F = колониеобразующая единица-фибробласт.

КОМПОНЕНТЫОСТЕОГЕННЫЕ СРЕДЫХОНДРОГЕННАЯ СРЕДААДИПОГЕННЫЕ СРЕДЫ
Базальная среда90 мл90 мл90 мл
Индукционные среды10 мл10 мл10 мл
Общий объем100 мл100 мл100 мл

Таблица 3: Дифференциационные среды для трилинейной дифференциации SHEDs.

2. Культивирование и уход за сараями

  1. Поддерживайте клетки в 10% питательной среде МСК и меняйте среду каждые 2 дня или по мере необходимости.
  2. Трипсинизация клеток при слиянии 95% с использованием 0,25% трипсина-ЭДТА.
  3. Нейтрализуют клетки после трипсинизации с помощью нейтрализующей среды.
  4. Центрифугируют пробирку при 300 × г в течение 6 мин при комнатной температуре до получения клеточной гранулы.
  5. Декантируют надосадочную жидкость и ресуспендируют клеточную гранулу в 10% питательной среде МСК.
  6. Высевают клетки в свежеприготовленные чашки для клеточных культур, содержащие 10% питательных сред МСК для дальнейших экспериментов или субкультивирования.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Оптимальная плотность высева для SHED составляет 0,2 × 10 6 ячеек в чашке 100 мм и 0,8 × 10 6 ячеек в колбе Т-75, для получения 1,5 × 10 6 ячеек и 4 × 10 6 ячеек соответственно при слиянии 90-100%.

3. Характеристика МСК

  1. Краткосрочный анализ роста клеток
    1. Посев 4 × 10по 4 клетки/лунка в трех экземплярах в 6-луночные планшеты в 10% питательной среде МСК.
    2. Инкубируйте планшеты в течение 7 дней при температуре 37 °C и меняйте среду каждые 2 дня.
    3. Собирают клетки на 2-й, 4-й и 8-й день, используя 0,25% трипсин, и промывают питательной средой.
    4. Центрифугируют клетки при 300 г в течение 6 мин при комнатной температуре и ресуспендируют гранулы в 1 мл среды.
    5. Подсчитывают клетки с помощью гемоцитометра и определяют их жизнеспособность методом исключения трипанового синего.
    6. Рассчитайте скорость пролиферации, используя уравнение (1):
      figure-protocol-1(1)
  2. Анализ колониеобразующей единицы фибробластов (КОЕ-F)
    1. Высевают 10 000 клеток в 100-миллиметровую чашку и культивируют их в 20% питательных средах МСК.
    2. Инкубируйте планшеты в течение 14 дней при температуре 37 °C и меняйте среду каждые 3 дня.
    3. Через 14 дней промойте колонии ПБС, зафиксируйте их кристаллическим фиолетовым красителем в метаноле и снова промойте ПБС, чтобы удалить остаточное пятно.
    4. Подсчитывайте и изображайте колонии.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Подсчитывайте колонии с >50 клеток. Эффективность колониеобразования рассчитывается как количество колониеобразующих единиц.
  3. Иммунофлуоресцентный анализ
    1. Высевают МСК на посуду диаметром 35 мм и дают им вырасти до слияния 80-90%.
    2. Удалите фильтрующий материал и ополосните посуду PBS один раз.
    3. Зафиксируйте клетки 1 мл 4% параформальдегида (PFA) путем инкубации в течение 1 ч при комнатной температуре или в течение ночи при 4 °C.
    4. После фиксации промыть лунки ПБСТ в течение 3 х 5 мин на коромысле.
    5. Добавьте 0,3% Triton X-100 в PBST (0,05% раствор Tween 20 в PBS) для пермеабилизации клеток. Держите его на коромысле в течение 15 минут при комнатной температуре.
    6. Промыть лунки ПБСТ в течение 3 х 5 мин на коромысле.
    7. Добавьте 3% бычий сывороточный альбумин (БСА) для блокировки и держите на коромысле в течение 1 ч при комнатной температуре.
    8. Промыть лунки ПБСТ в течение 3 х 5 мин на коромысле.
    9. Добавьте 800 мкл раствора 1:500 мышиного антивиментина, подержите на коромысле в течение 1 ч при комнатной температуре и перенесите планшет на 4 °C для ночной инкубации.
    10. На следующий день удалить первичные антитела и промыть лунки ПБСТ в течение 3 х 5 мин на коромысле.
    11. Добавьте 800 мкл разведения 1:1000 козьего вторичного антитела антимышиного IgG (H+L), Alexa Fluor 555, и держите его в течение 3 часов при комнатной температуре на коромысле.
    12. Промыть лунки ПБСТ в течение 3 х 5 мин на коромысле.
    13. Добавьте фаллоидиновые зонды Alexa fluor 488 240 мкл в 1 000 мкл PBS и инкубируйте при комнатной температуре в течение 60 минут на коромысле.
    14. Промыть лунки ПБСТ в течение 3 х 5 мин на коромысле.
    15. Добавьте 700 мкл монтанта DAPI и понаблюдайте за клетками под микроскопом.
  4. Дифференциация по линии
    1. Дифференциация в соответствии с культурой 2D
      1. Возьмите две 48-луночные пластины и обозначьте их как остеогенную и адипогенную линии соответственно.
      2. Высевают 15 000 клеток на лунку в четыре лунки каждой пластины и культивируют их в 10% питательных средах МСК.
      3. После того, как монослой клеток достигнет 90% слияния, пометьте первые две лунки как «Контрольные» и замените существующую среду средой с нехваткой сыворотки (2% среды). В последних двух лунках, помеченных как «Тест», добавьте дифференцирующую среду любой из двух линий, адипогенной или остеогенной. Отметьте это как День 0.
      4. Аккуратно заменяйте фильтрующий материал каждые три дня, чтобы избежать отслаивания, и будьте осторожны, чтобы избежать загрязнения.
      5. Поддерживайте эти условия до двадцать первого дня; Затем обработайте для эксперимента по окрашиванию.
    2. Дифференциация в соответствии с 3D-культурой
      1. Возьмите две пробирки по 15 мл для проведения хондрогенной дифференцировки с помощью 3D пеллетной культуры.
      2. Переложите 1 × 106 клеток в каждую пробирку и центрифугируйте при 300 × г в течение 6 мин до образования гранулы. Пометьте одну пробирку как «Контрольная» и добавьте в нее 10% питательной среды МСК; Другую пробирку обозначьте как «Тест» и добавьте хондрогенную дифференцировочную среду. Аккуратно поместите пробирки в инкубатор, неплотно закрутив крышки. Отметьте это как День 0.
      3. Осторожно меняйте фильтрующий материал каждые три дня, чтобы не сместить/не разрушить гранулы во время смены среды.
      4. Поддерживайте эти условия до двадцати первого дня, а затем обработайте клетки для дальнейших экспериментов.
  5. Цитохимическое окрашивание по линии
    1. Для 2D-культур используйте дифференцированные (тестовые) и недифференцированные МСК (контрольные) планшеты (из шага 3.4.1.5.) для окрашивания, а сначала удалите среду и дважды промойте PBS. Зафиксируйте клетки с помощью 4% PFA в течение 30 минут при комнатной температуре, удалите надосадочную жидкость и промойте один раз PBS. Выполните окрашивание для каждой линии следующим образом.
      1. Для получения линии адипоцитов добавьте раствор пермеабилизации из набора и инкубируйте планшет в течение 5 минут при комнатной температуре. Приготовьте и добавьте 1 мл рабочего раствора Oil red O и выдержите 10 минут. Удалите пятно и дайте пять стирок дистиллированной воде.
      2. Для получения остеоцитов добавьте 5% свежеприготовленной селитры серебра (в дистиллированной воде) в каждую лунку и держите планшет под ультрафиолетовым излучением в течение 1 ч. Удалите раствор и добавьте 2,5% тиосульфата натрия для удаления непрореагировавшего серебра; Держать 5 минут. Удалите пятно, дважды промойте дистиллированной водой и осмотрите окрашенные клетки под микроскопом.
    2. Для 3D-культур собирают гранулу после окончания периода дифференцировки с шага 3.4.2.3 и получают криосрезы дифференцированной ткани в виде гранулы. Дайте предметным стеклам высохнуть на воздухе и нагреться до комнатной температуры, прежде чем приступать к окрашиванию.
      1. Для хондроцитарной линии следуйте указаниям набора для окрашивания, чтобы добавить достаточное количество промывочного раствора, удалить его, добавить фиксирующий раствор и инкубировать в течение 30 минут. Промыть дистиллированной водой, добавить красящий раствор и выдержать 30 мин. Трижды промыть 0,1 Н соляной кислотой; Добавьте дистиллированную воду, чтобы нейтрализовать кислотность. Понаблюдайте за окрашенными клетками под светлопольным микроскопом.

4. Окрашивание клеточной поверхности для иммунофенотипирования

ПРИМЕЧАНИЕ: Рекомендуемыми планшетами для клеточных культур для получения оптимального количества клеток на шагах 4.2-4.5 являются чашки диаметром 100 мм или колбы Т75.

  1. Подготовка клеток к проточным цитометрическим экспериментам
    1. Трипсинизацию и сбор клеток из протекающей чашки/колбы и центрифуги при 300 × г в течение 6 мин до получения клеточной гранулы.
    2. Ресуспендируйте гранулу в 1 мл среды и определите количество жизнеспособных клеток с помощью гемоцитометра по методу исключения трипанового синего.
    3. После подсчета снова центрифугируют клеточную суспензию и дают грануле еще две промывки 1 мл окрашивающего буфера.
    4. Выбросьте надосадочную жидкость и, наконец, повторно суспендируйте гранулу в соответствующем объеме буфера для окрашивания в зависимости от протокола (см. шаги 4.2–4.5).
  2. Подготовка компенсационных контролей
    1. Возьмите семь пробирок FACS и пометьте их как Unstained, DAPI, V450, FITC, PE, PerCP-Cy 5.5 и APC.
    2. Ресуспендируйте готовую гранулу в буфере для окрашивания (см. шаг 4.1.), сохраняя плотность клеток 0,5 × 106 клеток на 50 мкл на пробирку для пробирок Unstained и DAPI.
    3. Подготовьте одноокрашенные трубки к компенсации, как описано в таблице 4.
    4. После подготовки аккуратно встряхните каждую пробирку и инкубируйте в темноте в течение 30 минут.
    5. После инкубации проводят две промывки, добавляя в каждую пробирку по 1 мл окрашивающего буфера, после чего проводят кратковременное вихрирование и центрифугирование при 200 г в течение 10 мин при комнатной температуре.
    6. Выбросьте надосадочную жидкость, повторно суспендируйте гранулу в 500 мкл окрашивающего буфера и отложите ее в сторону до получения.
    7. Для пробирки DAPI выполните обработку тепловым шоком, инкубируя ее на водяной бане с температурой 60 °C в течение 5 минут, а затем 15 минут на льду. Добавьте 5 мкл DAPI в суспензию и держите ее в темноте до получения результата.
  3. Подготовка контроля флуоресценции минус один (FMO)
    1. Суспендант готовой гранулы помещают в буфер для окрашивания (см. шаг 4.1), сохраняя плотность клеток 0,5 × 10,6 клеток на 50 мкл для каждой пробирки.
    2. Возьмите пять пробирок FACS и обозначьте их как изотип CD44-V450, CD90-FITC, CD45-PE, изотип CD73-PerCP Cy5.5 и изотип CD105-APC.
    3. Приготовьте суспензию клеток и антител в соответствии с таблицей 5.
    4. Осторожно вкрутите пробирки и инкубируйте их в течение 30 минут при комнатной температуре в темноте.
    5. После инкубации проводят две промывки с добавлением 1 мл окрашивающего буфера в каждую пробирку с последующим кратковременным вихрянием и центрифугированием при 200 г в течение 10 мин при комнатной температуре.
    6. Выбросьте надосадочную жидкость, повторно суспендируйте гранулу в 500 мкл окрашивающего буфера и отложите ее до получения.
  4. Подготовка образцов к анализу
    1. Ресуспендант готовой гранулы в буфере для окрашивания (см. шаг 4.1), поддерживая плотность клеток 0,5 × 10,6 клеток на 50 мкл для каждой пробирки.
    2. Возьмите две пробирки FACS и обозначьте их как Смешанные пробирки 1 и 2.
    3. Готовят клеточную и антителовую суспензию в соответствии с таблицей 6.
    4. Осторожно вкрутите пробирки и инкубируйте их в течение 30 минут при комнатной температуре в темноте.
    5. После инкубации проводят две промывки с добавлением 1 мл окрашивающего буфера в каждую пробирку с последующим кратковременным вихрянием и центрифугированием при 200 г в течение 10 мин при комнатной температуре.
    6. Выбросьте надосадочную жидкость, повторно суспендируйте гранулу в 500 мкл окрашивающего буфера и отложите до получения.
  5. Подготовка образцов для одноклеточной сортировки
    1. Возьмите две пробирки FACS, добавьте 1 мл FBS и раскатайте пробирку до образования ровного слоя FBS на внутренней стороне каждой пробирки. Выдерживают его в течение 1-2 ч, одновременно обрабатывая образец для окрашивания. Обозначьте эти пробирки как Смешанные трубки 1 и 2.
    2. Ресуспендант готовой гранулы в буфере для окрашивания (см. шаг 4.1), сохраняя плотность клеток 2-3 × 10,6 клеток на 50 мкл для каждой пробирки.
    3. Готовят суспензию клеток и антител в смешанных пробирках 1 и 2 в соответствии с таблицей 7.
    4. Осторожно вкрутите пробирки и инкубируйте их в течение 30 минут при комнатной температуре в темноте.
    5. После инкубации проводят две промывки с добавлением 1 мл окрашивающего буфера в каждую пробирку с последующим кратковременным вихрянием и центрифугированием при 200 г в течение 10 мин при комнатной температуре.
    6. Выбросьте надосадочную жидкость, повторно суспендируйте гранулу в 500 мкл буфера для окрашивания и отложите в сторону. Добавьте 5 мкл DAPI за 15 минут до сортировки.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Обратите внимание, что для экспериментов по сортировке рекомендуется более высокая плотность клеток на пробирку.
Тип трубкиБусины Positive Comp*Отрицательные бусины*КлеткиДобавлены антитела
Трубка FITC1 капля1 капля–Античеловеческий CD90-FITC (2 мкл)
Трубка V4501 капля1 капля–Античеловеческий CD44-V450 (2 мкл)
Трубка PerCP-Cy 5.51 капля1 капля–Античеловеческий CD73-PerCP Cy 5,5 (2 мкл)
Полиэтиленовая трубка1 капля1 капля–Античеловеческий CD45-PE (2 мкл)
Трубка APC1 капля1 капля–Античеловеческий CD105-APC (2 мкл)
Трубка DAPI––50 мкл–
Неокрашенная трубка––50 мкл–
*1 капля = 60 мкл суспензии шарика

Таблица 4: Компенсационные контрольные выборки. Аббревиатуры: Comp = компенсация; DAPI = 4',6-диамидино-2-фенилиндол; FITC = флуоресцеин изотиоцианат; APC = аллофикоцианин; ПЭ = фикоэритрин; PerCP = перидинин-хлорофилл-белок.

ТИП ТРУБКИАНТИТЕЛА К ПОЛОЖИТЕЛЬНОМУ МАРКЕРУ (2 мкл)АНТИТЕЛА К ОТРИЦАТЕЛЬНОМУ МАРКЕРУ (2 мкл)ДОБАВЛЕНЫ ИЗОТИПНЫЕ АНТИТЕЛА (2 мкл)ОБЩИЙ ОБЪЕМ АНТИТЕЛДОБАВЛЕН ОБЪЕМ КЛЕТОЧНОЙ СУСПЕНЗИИДОБАВЛЕН ОБЪЕМ БУФЕРА ДЛЯ ОКРАШИВАНИЯ
Трубка CD90-FITC FMO- Античеловеческий CD44-V450Античеловеческий CD45-PEИзотип IgG1 FITC10 мкл50 мкл40 мкл
- Античеловеческий CD73 PerCP Cy 5.5
- Античеловеческий CD105-APC
Трубка CD73-PerCP Cy5.5 FMO- Античеловеческий CD44-V450Античеловеческий CD45-PEИзотип PerCP Cy 5.5 IgG110 мкл50 мкл40 мкл
- Античеловеческий CD90-FITC
- Античеловеческий CD105-APC
Лампа CD44-V450 FMO- Античеловеческий CD90-FITCАнтичеловеческий CD45-PEИзотип V450 IgG110 мкл50 мкл40 мкл
- Античеловеческий CD73-PerCP Cy 5.5
- Античеловеческий CD105-APC
FMO-лампа CD105-APC- Античеловеческий CD44-V450Античеловеческий CD45-PEИзотип APC IgG110 мкл50 мкл40 мкл
- Античеловеческий CD90-FITC
- Античеловеческий CD73-PerCP Cy 5.5
Трубка CD45-PE FMO- Античеловеческий CD44-V450-Изотип PE IgG110 мкл50 мкл40 мкл
- Античеловеческий CD90-FITC
- Античеловеческий CD73-PerCP Cy 5.5
- Античеловеческий CD105-APC

Таблица 5: Контрольные образцы ФМО. Сокращения: FMO = флуоресценция минус единица; FITC = флуоресцеин изотиоцианат; APC = аллофикоцианин; ПЭ = фикоэритрин; PerCP = перидинин-хлорофилл-белок.

ТИП ТРУБКИАНТИТЕЛА К ПОЛОЖИТЕЛЬНОМУ МАРКЕРУ (2 мкл)АНТИТЕЛА К ОТРИЦАТЕЛЬНОМУ МАРКЕРУ (2 мкл)ОБЩИЙ ОБЪЕМ АНТИТЕЛДОБАВЛЕН ОБЪЕМ КЛЕТОЧНОЙ СУСПЕНЗИИДОБАВЛЕН ОБЪЕМ БУФЕРА ДЛЯ ОКРАШИВАНИЯ
Смешанная трубка 1- Античеловеческий CD44-V450Античеловеческий CD45-PE10 мкл50 мкл40 мкл
- Античеловеческий CD90-FITC
- Античеловеческий CD73-PerCP Cy5.5
- Античеловеческий CD105-APC
Смешанная трубка 2- Античеловеческий CD44-V450Античеловеческий CD45-PE10 мкл50 мкл40 мкл
- Античеловеческий CD90-FITC
- Античеловеческий CD73-PerCP Cy5.5
- Античеловеческий CD105-APC

Таблица 6: Пробирки для многоцветного иммунофенотипирования SHEDs. Сокращения: SHEDs = стволовые клетки отслоившихся молочных зубов человека; ПЭ = фикоэритрин.

ТИП ТРУБКИАНТИТЕЛА К ПОЛОЖИТЕЛЬНОМУ МАРКЕРУ (3 мкл)АНТИТЕЛА К ОТРИЦАТЕЛЬНОМУ МАРКЕРУ (3 МКЛ)ОБЩИЙ ОБЪЕМ АНТИТЕЛДОБАВЛЕН ОБЪЕМ КЛЕТОЧНОЙ СУСПЕНЗИИДОБАВЛЕН ОБЪЕМ БУФЕРА ДЛЯ ПЯТЕН
Смешанная трубка 1- Античеловеческий CD90-FITCАнтичеловеческий CD45-PE9 мкл50 мкл41 мкл
- Античеловеческий CD73-PerCP Cy5.5
Смешанная трубка 2- Античеловеческий CD90-FITCАнтичеловеческий CD45-PE9 мкл50 мкл41 мкл
- Античеловеческий CD73-PerCP Cy5.5

Таблица 7: Одноклеточные реакционные пробирки для сортировки. Сокращения: FITC = флуоресцеин изотиоцианат; ПЭ = фикоэритрин; PerCP = перидинин-хлорофилл-белок.

5. Одноячеечная сортировка

  1. Подготовка клеточного сортировщика
    1. Установите в сортировщик сопло 100 мкм.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Диаметр соответствующего сопла должен быть как минимум в пять раз больше диаметра сортируемой частицы. Жидкость оболочки, которая будет использоваться для сортировки, должна быть определена в зависимости от типа образца и чувствительности эксперимента; Для этого эксперимента была использована запатентованная жидкость для оболочки.
    2. Выполняйте ежедневную проверку качества прибора (QC) и настраивайте сортировщик для эксперимента. Обратитесь к руководству по прибору для получения подробного руководства по настройке прибора.
  2. Настройка матрицы компенсаций
    1. Установите компенсационную матрицу с помощью компенсационных трубок с одним пятном, как показано в шаге 4.2.
    2. В проприетарном программном обеспечении выберите «Эксперимент» на панели инструментов и нажмите «Настройка компенсации». Откройте Создание элементов управления компенсациями.
    3. Проверьте маркеры и подтвердите. Добавляется новый образец с именем «Компенсация», при котором программное обеспечение автоматически добавляет новые пробирки, называемые маркерными элементами управления.
    4. Выберите трубку Unstained и запустите ее, чтобы записать 5 000 событий. Перетащите гейт на заполнение ячеек и примените его ко всем элементам управления компенсацией. Это необходимо для установки напряжений и отрицательного затвора для каждого флуоресцентного параметра.
    5. Точно так же загрузите трубки для компенсации одиночных пятен отдельно, а также запишите и сохраните данные. Выберите ворота, разграничивающие интересующую совокупность, и примените их ко всем элементам управления компенсациями. Это необходимо для установки положительных вентилей для каждого флуоресцентного параметра.
    6. Выберите «Эксперимент» на панели инструментов и нажмите «Рассчитать значения компенсации | ссылка и сохранить».
      ПРИМЕЧАНИЕ: После того, как матрица автокомпозиции сгенерирована с помощью программного обеспечения, параметры напряжения флуорохромов не могут быть изменены ни для одного из каналов в смешанных лампах.
  3. Сбор данных
    1. Запишите 10 000 клеток в каждую пробирку, начиная с шага 4.3. 4.4 для сбора данных для анализа иммунофенотипа клеток.
  4. Подготовка устройств для сбора
    1. В зависимости от назначения отсортированных клеточных популяций можно выбрать 6-луночные, 24-луночные, 48-луночные или 96-луночные планшеты.
    2. Смажьте лунки 200-500 мкл FBS и держите планшеты нетронутыми в течение 2 ч.
    3. Через 2 ч удаляют остатки ФБС и добавляют 200-500 мкл 10% питательных сред МСК.
  5. Сортировка ячеек в режиме сортировки по одной ячейке
    1. Запустите смешанную трубку 1 (начиная с шага 4.5) и запишите 10 000 событий, чтобы установить шлюзы для интересующей нас популяции для сортировки, используя соответствующую стратегию стробирования.
    2. Загрузите сборную пластину и установите целевые номера ячеек в диапазоне от 2 500 до 5 000 ячеек на лунку и выберите маску чистоты сортировки одной ячейки.
    3. Соберите отсортированные популяции в устройство сбора и держите их на льду до конца эксперимента по сортировке.
    4. После этого перенесите планшеты в инкубатор с 5%CO2 для поддержания культуры при температуре 37 °C.
      ПРИМЕЧАНИЕ: После сбора необработанные файлы данных экспортировались в формате .fcs (v.3.0. и выше). Отчеты о сортировке, создаваемые после каждого эксперимента, записывали количество событий/ячеек, отсортированных по заданной скважине, и указывали количество конфликтов, которые были прерваны.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

SHED были охарактеризованы стандартными иммунофлуоресцентными анализами, показывающими экспрессию виментина (красные, промежуточные нити III типа), актиновых филаментов (фаллоидиновые зонды Alexa fluor 488) и ядер, окрашенных DAPI (рис. 1A). Для оценки их пролиферативной и колониеобразующей способности были проведены стандартные краткосрочные анализы роста клеток. На рисунке 1В показано увеличение скорости пролиферации в 14,3 раза со 2-го по 8-й день. Клоногенны...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

В области тканевой инженерии и регенеративной медицины, среди постнатальных источников, МСК, полученные из пероральных тканей, вызвали глубокий интерес из-за их минимальных этических обязательств и значительного многолинейного дифференциального потенциала21. Стволовые клетки пульпы зуба (DPSC) из пораженного третьего моляра и SHED привлекли наибольшее внимание среди стоматологических МСК в связи с их терапевтическим потенциалом при нейродегенеративных и травматических заболеваниях

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов в связи с публикацией данной статьи.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Мы благодарим Центр проточных ячеек в Центре передовых научных исследований им. Джавахарлала Неру (Бангалор, Индия) за использование основной установки проточной цитометрии. Криосекционирование гранульной культуры дифференцированных клеток проводили в референс-лаборатории Neuberg Anand, Бангалор, Индия. Эта работа была поддержана Академией высшего образования Манипала (MAHE), Индия. AG благодарит за поддержку стипендию доктора Т. М. А. Пая от MAHE.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
Алцианский синий красительHiMediaCCK029-1KT
Антибиотик-антимикотик (100x) Gibco by ThermoFisher15240062
BD CompBead Plus Anti-Mouse Ig, κ/Negative Control (BSA) Compensation Plus (7.5 µ m) Набор частицBD Biosciences560497
BD FACS Accudrop Beads BD Biosciences345249Используется для настройки лазерной задержки при открытии модуля сортировки.
BD FACS Aria Fusion Flow цитометрBD Biosciences---
BD FACS Diva 9.4BD Biosciences---
BD FACS Tumor FluidBD Biosciences342003Используется в качестве оболочки для экспериментов как по анализу, так и по сортировке в BD FACSAria Fusion
BD FACSDiva CS& Исследовательские бусиныBD Biosciences655050Используются для конфигурации прибора в зависимости от размера сопла.
BD Horizon V450 Мышь Anti-Human CD44BD Biosciences561292
BD Horizon V450 Мышь IgG2b, κ Контроль изотипаBD Biosciences560374CD44-V450 изотип
BD Pharmingen APC Mouse Anti-Human CD105BD Biosciences562408
BD Pharmingen APC Mouse IgG1, κ Контроль изотипаBD Biosciences555751CD105-APC изотип
BD Pharmingen DAPI SolutionBD Biosciences564907DAPI Стоковый раствор 1 мг/мл
BD Pharmingen FITC Mouse Anti-Human CD90BD Biosciences555595
BD Pharmingen FITC Mouse IgG1, κ Контроль изотипаBD Biosciences555748CD90-FITC изотип
BD Pharmingen PE Mouse Anti-Human CD45BD Biosciences555483
BD Pharmingen PE Mouse IgG1, κ контроль изотипаBD Biosciences555749CD45-PE изотип
BD Pharmingen PerCP-Cy 5,5 мыши против человека CD73BD Biosciences561260
BD Pharmingen PerCP-cy 5,5 мыши IgG1, κ Контроль изотипаBD Biosciences550795CD73-PerCP-Cy 5,5 изотип
BD Pharmingen Очищенный мышиный анти-виментинBD Biosciences550513
бычьим сывороточным альбуминомHi-Media TC548-5G
Кристалл фиолетовыйNice chemical pvt ltd C33809
Фосфатный буферный физиологический раствор ДульбеккоSigma-aldrich   D5652-50LdPBS используется для работы с культурой и технического обслуживания.
Этанол------Используется для общей стерилизации.
Фетальная сыворотка крупного рогатого скота Gibco от ThermoFisher 10270-106
Козье антимышиное антитело IgG (H+L) с перекрестной адсорбцией вторичного антитела, Alexa Fluor 555ThermoFisher Scientific A-21422
KO-DMEMGibco от ThermoFisher 10829018Базальная среда для недифференцированных hESCs, используемая при приготовлении питательных сред
L-глутамин 200mM (100x)Gibco by ThermoFisher25030-081
Methanol, для молекулярной биологии Hi-Media MB113
Масло красное OHiMedia CCK013-1KT
Параформальдегид loba chemie30525-89-4
Пенициллин стрептомицин (100x)Gibco от ThermoFisher 15140- 122
Фаллоидин (реактив ActinGreen 488 ReadyProbes)Invitrogen R37110
Нитрат серебраHiMedia MB156-25G
Пентагидрат тиосульфата натрияChemport10102-17-7
Флуоресцентные частицы Sphero Rainbow, 3.0 - 3.4 &; mBD Biosciences556291
Буфер для окрашивания Подготовлено в МИРМиБСП;----Он был приготовлен с использованием 2% FBS в PBS 
StemPro Дифференцировка адипогенеза базальная среда Gibco от ThermoFisher A10410-01Базальная среда для адипогенных сред
StemPro Adipogenesis SupplementGibco от ThermoFisher A10065-01Индукционная среда для адипогенных сред
StemPro Добавка хондрогенезаGibco от ThermoFisher A10064-01Индукционная среда для хондрогенных сред
StemPro Добавка остеогенезаGibco от ThermoFisher A10066-01Индукционные среды для остеогенных сред
StemPro Остеогенез/Хондрогенез Дифференцировка базальных сред Gibco от ThermoFisher A10069-01Базальные среды для остегенных и хондрогенных сред
Triton-X-100Hi-Media MB031
Трипан синий Gibco по life технологиям 15250-061
Трипсин - раствор ЭДТА 1xHi-media TCL049
Твин-20 MERCK 9005-64-5

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Kobolak, J., Dinnyes, A., Memic, A., Khademhosseini, A., Mobasheri, A. Mesenchymal stem cells: Identification, phenotypic characterization, biological properties and potential for regenerative medicine through biomaterial micro-engineering of their niche. Methods. 99, 62-68 (2016).
  2. Wilson, A., Hodgson-Garms, M., Frith, J. E., Genever, P. Multiplicity of mesenchymal stromal cells: finding the right route to therapy. Frontiers in Immunology. 10, 1112(2019).
  3. Li, J., et al. Comparison of the biological characteristics of human mesenchymal stem cells derived from exfoliated deciduous teeth, bone marrow, gingival tissue, and umbilical cord. Molecular Medicine Reports. 18 (6), 4969-4977 (2018).
  4. McLeod, C. M., Mauck, R. L. On the origin and impact of mesenchymal stem cell heterogeneity: new insights and emerging tools for single cell analysis. European Cells & Materials. 34, 217-231 (2017).
  5. Dominici, M., et al. Minimal criteria for defining multipotent mesenchymal stromal cells. The International Society for Cellular Therapy position statement. Cytotherapy. 8 (4), 315-317 (2006).
  6. Wang, J., Liao, L., Wang, S., Tan, J. Cell therapy with autologous mesenchymal stem cells-how the disease process impacts clinical considerations. Cytotherapy. 15 (8), 893-904 (2013).
  7. Kern, S., Eichler, H., Stoeve, J., Kluter, H., Bieback, K. Comparative analysis of mesenchymal stem cells from bone marrow, umbilical cord blood, or adipose tissue. Stem Cells. 24 (5), 1294-1301 (2006).
  8. Dunn, C. M., Kameishi, S., Grainger, D. W., Okano, T. Strategies to address mesenchymal stem/stromal cell heterogeneity in immunomodulatory profiles to improve cell-based therapies. Acta Biomaterialia. 133, 114-125 (2021).
  9. Yang, Y. K., Ogando, C. R., Wang See, C., Chang, T. Y., Barabino, G. A. Changes in phenotype and differentiation potential of human mesenchymal stem cells aging in vitro. Stem Cell Research & Therapy. 9 (1), 131(2018).
  10. Costa, L. A., et al. Functional heterogeneity of mesenchymal stem cells from natural niches to culture conditions: implications for further clinical uses. Cellular and Molecular Life Sciences. 78 (2), 447-467 (2021).
  11. Bonner, W. A., Hulett, H. R., Sweet, R. G., Herzenberg, L. A. Fluorescence activated cell sorting. Review of Scientific Instruments. 43 (3), 404-409 (1972).
  12. Schulte, R., et al. Index sorting resolves heterogeneous murine hematopoietic stem cell populations. Experimental Hematology. 43 (9), 803-811 (2015).
  13. Liao, X., Makris, M., Luo, X. M. Fluorescence-activated cell sorting for purification of plasmacytoid dendritic cells from the mouse bone marrow. Journal of Visualized Experiments. (117), (2016).
  14. Roda, B., et al. A novel stem cell tag-less sorting method. Stem Cell Reviews and Reports. 5 (4), 420-427 (2009).
  15. Hall, S. R., et al. Identification and isolation of small CD44-negative mesenchymal stem/progenitor cells from human bone marrow using elutriation and polychromatic flow cytometry. Stem Cells Translational Medicine. 2 (8), 567-578 (2013).
  16. Eggleton, M. J., Sharp, A. A. Platelet counting using the Coulter electronic counter. Journal of Clinical Pathology. 16 (2), 164-167 (1963).
  17. Porwit-Ksiazek, A., Aman, P., Ksiazek, T., Biberfeld, P. Leu 7+ (HNK-1+) cells. II. Characterization of blood Leu 7+ cells with respect to immunophenotype and cell density. Scandinavian Journal of Immunology. 18 (6), 495-449 (1983).
  18. Hewitt, Z., et al. Fluorescence-activated single cell sorting of human embryonic stem cells. Cloning and Stem Cells. 8 (3), 225-234 (2006).
  19. Singh, A. M. An efficient protocol for single-cell cloning human pluripotent stem cells. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 7, 11(2019).
  20. Wilson, N. K., et al. Combined single-cell functional and gene expression analysis resolves heterogeneity within stem cell populations. Cell Stem Cell. 16 (6), 712-724 (2015).
  21. Zhou, L. L., et al. Oral mesenchymal stem/progenitor cells: the immunomodulatory masters. Stem Cells Inernational. 2020, 1327405(2020).
  22. Fawzy El-Sayed, K. M., et al. Adult mesenchymal stem cells explored in the dental field. Advances in Biochemical Engineering/Biotechnology. 130, 89-103 (2013).
  23. Hardy, W. R., et al. Transcriptional networks in single perivascular cells sorted from human adipose tissue reveal a hierarchy of mesenchymal stem cells. Stem Cells. 35 (5), 1273-1289 (2017).
  24. FACSAria Fusion User's Guide. , https://www.uk-essen.de/fileadmin/user_upload/IFZ/1_Institut/Zellsortierer/23-14816-01_BD_FACSAria_Fusion_ug.pdf (2018).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Mesenchymal Stem CellsSingle Cell SortingFlow CytometryImmunophenotypingHuman Deciduous TeethStem Cell DifferentiationCell Surface MarkersColony Forming AssayAdipogenic DifferentiationOsteogenic Differentiation

Related Articles