Методическая статья

Отслеживание диссеминации опухолевых клеток из метастазов в легких с помощью фотоконверсии

DOI:

10.3791/65732

⸱

7 июля 2023 г.

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Pathology, Albert Einstein College of Medicine/Montefiore Medical Center, 2Cancer Dormancy and Tumor Microenvironment Institute, Albert Einstein College of Medicine/Montefiore Medical Center, 3Gruss-Lipper Biophotonics Center, Albert Einstein College of Medicine/Montefiore Medical Center, 4Department of Cell Biology, Albert Einstein College of Medicine/Montefiore Medical Center, 5Montefiore Einstein Cancer Center, Albert Einstein College of Medicine/Montefiore Medical Center, 6Integrated Imaging Program for Cancer Research, Albert Einstein College of Medicine/Montefiore Medical Center, 7Department of Surgery, Albert Einstein College of Medicine/Montefiore Medical Center, 8Department of Cancer and Cellular Biology, Lewis Katz School of Medicine, Fox Chase Cancer Center

* These authors contributed equally

В этой статье

Краткое содержание

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Представлен метод изучения редиссеминации опухолевых клеток из метастазов в легкие, включающий хирургический протокол селективной фотоконверсии метастазов в легких с последующей идентификацией ресеминированных опухолевых клеток в третичных органах.

Аннотация

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Метастазы – системное распространение рака – являются основной причиной смертей, связанных с раком. Хотя метастазирование обычно рассматривается как однонаправленный процесс, при котором клетки первичной опухоли распространяются и засеивают метастазы, опухолевые клетки в существующих метастазах также могут повторнораспространяться и давать начало новым поражениям в третичных участках в процессе, известном как «метастазирование из метастазов» или «посев метастазов из метастазов». Посев от метастаза к метастазу может увеличить метастатическую нагрузку и снизить качество жизни и выживаемость пациента. Таким образом, понимание процессов, лежащих в основе этого явления, имеет решающее значение для уточнения стратегий лечения пациентов с метастатическим раком.

Мало что известно о посеве от метастаза к метастазу, отчасти из-за логистических и технологических ограничений. Исследования посева от метастазов к метастазам основываются в основном на методах секвенирования, которые могут быть непрактичными для исследователей, изучающих точное время посева от метастазов к метастазам или то, что способствует или предотвращает их. Это подчеркивает отсутствие методологий, облегчающих изучение посева от метастазов к метастазам. Чтобы решить эту проблему, мы разработали и описываем здесь протокол хирургии мышей для селективной фотоконверсии метастазов в легких, позволяющий специфически маркировать и отслеживать судьбу опухолевых клеток, редиссемирующихся из легких в третичные участки. Насколько нам известно, это единственный метод изучения редиссеминации опухолевых клеток и посева метастазов из легких, не требующий геномного анализа.

Введение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Метастазы являются основной причиной смертности, связанной с раком1. Метастатический рак возникает, когда клетки первичной опухоли распространяются по всему организму и пролиферируют в клинически обнаруживаемые опухоли в отдаленных органах 2,3.

Хотя метастазирование обычно рассматривается как однонаправленныйпроцесс, при котором опухолевые клетки диссемируются из первичной опухоли и колонизируют отдаленные органы, все больше клинических и экспериментальных данных свидетельствуют о том, что имеет место более сложный, разнонаправленный процесс. Было показано, что циркулирующие опухолевые клетки могут повторно засеивать первичную опухоль (если она все еще находится на месте)5,6,7,8,9, а опухолевые клетки из существующих метастатических очагов могут перемещаться в третичные участки и давать начало новым поражениям 10,11,12,13. Действительно, данные недавних геномных анализов свидетельствуют о том, что некоторые метастатические поражения возникают не из первичной опухоли, а из других метастазов – явление, известное как «метастазирование из метастазов» или «посев метастазов в метастазы»14,15,16. Посев от метастаза к метастазу может увековечить патологический процесс даже после удаления первичной опухоли, увеличивая метастатическую нагрузку и снижая качество жизни и выживаемость пациентов. Таким образом, понимание процессов, лежащих в основе посева метастазов, имеет решающее значение для уточнения стратегий лечения пациентов с метастатическим заболеванием.

Несмотря на потенциально тяжелые клинические последствия, мало что известно о посеве от метастаза к метастазу, отчасти из-за логистических и технологических ограничений. Исследования на людях ограничены нехваткой клинических образцов. Клиническая резекция и биопсия метастатических поражений встречаются редко, как и биопсия, казалось бы, здоровых органов, где могут скрываться единичные диссеминированные опухолевые клетки. Это означает, что исследования на людях, как правило, возможны только с использованием образцов аутопсии людей, чьи первичные опухоли либо все еще существуют, либо были ранее удалены, но все еще доступны исследователям. При наличии таких образцов необходимо проводить анализ прогрессирования рака с использованием методов секвенирования14. Однако массовое секвенирование совместимых первичных опухолей и метастазов не обладает чувствительностью, необходимой для комплексного отслеживания родословной. Например, массовое секвенирование одного поражения может выявить субклон, который невозможно обнаружить ни в одном из соответствующих поражений. В этом случае невозможно было бы определить происхождение этого субклона. Он мог присутствовать в первичной опухоли или другом метастазе с частотой ниже предела обнаружения, или он мог возникнуть после первоначальной колонизации метастатического поражения, в котором он был обнаружен. Секвенирование отдельных клеток обеспечивает повышенную чувствительность, но его высокая стоимость ограничивает широкомасштабное применение этой методики. Ретроспективный характер этих исследований также означает, что они дают ограниченное представление о транзиторных метастатических событиях и картине заболевания в разные моменты времени.

В моделях животных последние технологические достижения теперь позволяют проводить перспективное филогенетическое картирование с высоким пространственным и временным разрешением 17,18,19,20. Эти методы используют редактирование генома CRISPR/Cas9 для создания клеток с эволюционирующим штрих-кодом - наследственными мутациями, которые накапливаются с течением времени. При секвенировании можно проследить родословную каждой клетки на основе мутационного профиля ее штрих-кода 17,18,19,20. Действительно, такая технология уже используется для картирования посева метастазов между метастазами. В недавней работе Zhang et al. продемонстрировали, что клетки рака молочной железы и предстательной железы при метастазах в кости редиссеминации из кости в семена вторичных метастазов во многих органах21.

Несмотря на то, что эти новые методы обладают большим потенциалом для создания подробных филогенетических карт прогрессирования рака с высоким разрешением, они крайне непрактичны для тех, кто изучает точное время появления метастазов и то, что способствует или предотвращает их. Восполнение этих пробелов в знаниях имеет решающее значение для уточнения нашего понимания и лечения метастатического рака, но существует заметная нехватка технологий, облегчающих такие исследования. Чтобы удовлетворить эту потребность, мы недавно разработали и представляем здесь новую методику, которая позволяет нам специфически маркировать опухолевые клетки с помощью фотоконверсии в метастатическом участке (легком) и впоследствии повторно идентифицировать их в третичных органах. Используя этот метод, мы недавно показали, что клетки рака молочной железы действительно размножаются из метастазов в легких и засеивают третичные органы13. Этот метод также может быть использован для определения времени событий редиссеминации в узком окне и количественной оценки редиссеминированных опухолевых клеток, облегчая изучение органотропизма ресеминированных клеток и того, что способствует/предотвращает редиссеминации.

В то время как фотоконверсия и локально-индуцируемые системы cre/lox, которые постоянно заменяют один флуоресцентный белок другим, ранее использовались для маркировки и отслеживания опухолевых клеток 11,22,23, насколько нам известно, ни один подход к пространственно-временной маркировке опухолевых клеток не был оптимизирован для воздействия на легкие - одно из наиболее распространенных мест метастазирования среди мужчин и женщин с диагнозом любой из 14 наиболее распространенных видов рака.. Любой тип раковых клеток и любой протокол образования метастазов в легких могут быть использованы с нашей процедурой, что делает ее широко полезной для исследователей метастазов. Все раковые клетки, используемые для генерации метастазов в легких, должны экспрессировать фотоконвертируемый или фотопереключаемый белок, и исследователи могут выбирать, какой белок использовать, исходя из своих конкретных потребностей и ресурсов. В этом исследовании мы использовали клетки рака молочной железы 6DT1, которые стабильно экспрессировали фотоконвертируемый зелено-красный флуоресцентный белок Dendra2 (клетки 6DT1-Dendra2)25, помеченный гистоном H2B. Мы вводили 5,0 × 104 клеток 6DT1-Dendra2 в четвертую жировую подушку молочной железы самок мышей Rag2-/-. Первичные опухоли пальпировались между 12 и 16 днями после инъекции и не резецировались в течение всего эксперимента. Спонтанные метастазы в легких развивались между 19 и 26 днями после инъекции опухолевых клеток. Операции фотоконверсии проводились между 26 и 29 днями после инъекции опухолевых клеток. Мыши были принесены в жертву через 72 часа после операции из-за метастазирования в легких.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Все процедуры, описанные в этом протоколе, были выполнены в соответствии с руководящими принципами и правилами использования позвоночных животных, включая предварительное одобрение Комитета по уходу за животными и их использованию Медицинского колледжа Альберта Эйнштейна.

Перед операцией метастазы в легких должны быть сгенерированы у мышей с использованием раковых клеток, которые экспрессируют фотоконвертируемый/фотопереключаемый белок; Опубликовано несколько протоколов генерации метастазов в легких 26,27,28.

1. Подготовка к операции

  1. Подготовьте отдельные рабочие зоны для подготовки мыши (удаление волос и интубация), операции и восстановления.
  2. Стерилизуйте все хирургические инструменты в автоклаве.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Поскольку для этой операции используется только наконечник, для повторной стерилизации инструментов для последующих процедур можно использовать стерилизатор горячими шариками.
  3. Включите хирургическую платформу с подогревом и дайте ей достичь и стабилизироваться при температуре 37-40 °C.
  4. Индуцируют анестезию 5% изофлураном, а затем снижают дозу изофлурана до 3%. Периодически выполняйте тесты на защемление пальцев ног на протяжении всей процедуры, чтобы оценить адекватность анестезии.
  5. Поместите мышь под наркозом в правостороннее положение пролежня. Удалите волосы в верхней левой части груди / боковых сторонах тела (см. рисунок 1A), нанеся на эту область крем для депиляции. Смочите кусочек марли или бумажного полотенца водой и протрите волосы кремом для депиляции. Повторяйте по мере необходимости до тех пор, пока все волосы не будут удалены с операционного поля.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Не оставляйте крем для депиляции на мышке дольше 20 секунд, так как это может повредить кожу.
  6. Завяжите двойной узел ~3 мм выше основания катетера 22 G шелковым швом 2-0. Оставьте хвосты длиной 2 дюйма.
  7. Интубируйте мышь этим катетером, как описано ранее 29,30. Чтобы подтвердить успешную интубацию, приложите надутую луковицу к концу катетера и осторожно сожмите.
    ПРИМЕЧАНИЕ: У мышей, которые были успешно интубированы, будет наблюдаться двусторонний подъем грудной клетки при сжатии луковицы.
  8. Плотно закрепите шелковый шов 2-0 вокруг морды мыши двойным узлом, чтобы удержать интубационный катетер на месте.

2. Операция по обнажению легких

ПРИМЕЧАНИЕ: Выполняйте все этапы операции (Рисунок 1), включая фотоконверсию, в вытяжке или ламинарном шкафу, чтобы избежать загрязнения операционного поля.

  1. Вымойте руки с антисептическим мылом и наденьте новые стерильные перчатки.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Поскольку для этой операции используется только наконечник, также можно использовать нестерильные перчатки. Рекомендуется дезинфицировать нестерильные перчатки дезинфицирующим средством на спиртовой основе.
  2. Приготовьте дозу бупренорфина 0,1 мг/кг (0,03 мг/мл) и введите подкожно для обезболивания.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Мультимодальная анальгезия, включающая местные блокаторы боли и нестероидные противовоспалительные препараты, должна использоваться в сочетании с бупренорфином, если не ожидается, что они будут влиять на интересующую биологию.
  3. Нанесите офтальмологическую мазь на оба глаза мыши, чтобы предотвратить повреждение роговицы.
  4. Поместите мышь в правостороннее положение пролежней на нагретую операционную платформу.
  5. Подключите аппарат искусственной вентиляции легких к интубационному катетеру. Следите за тем, чтобы катетер держался неподвижно, так как даже незначительные движения могут нарушить его установку и привести к плохой вентиляции.
  6. Наблюдайте за стабильным, контролируемым аппаратом искусственной вентиляции легких, двусторонним подъемом и опусканием грудной клетки.
  7. Закрепите конечности на операционной платформе с помощью клейкой ленты. Стабилизируйте операционное поле, поместив еще один кусок ленты вдоль спины мыши и закрепив спинную кожу и мех на хирургической платформе (рис. 1A).
  8. Откройте стерилизованные хирургические инструменты.
  9. Нанесите раствор хлоргексидина на кожу мыши, чтобы стерилизовать место операции.
  10. Определите область ~7 мм слева от грудины и ~7 мм выше подреберья. Приподнимите кожу над этой областью щипцами и сделайте круговой разрез ~10 мм острыми ножницами для микропрепарирования, стараясь разрезать только кожу.
  11. Удалите мягкие ткани над грудной клеткой (Рисунок 1B). Прижгите все крупные сосуды на обоих концах шприц-ручкой.
    ПРИМЕЧАНИЕ: В дополнение к иссечению всех мягких тканей, лежащих под 10-миллиметровым круговым разрезом кожи, удаление некоторых дополнительных немышечных мягких тканей по периметру облегчает последующие этапы процедуры.
  12. Одной рукой щипцами приподнимите6-е или7-е ребро. Другой рукой используйте одно лезвие тупых микрорассекающих ножниц - под углом параллельно грудной стенке, закругленным краем вниз - и осторожно проткните6-ю или7-ю межреберную мышцу, чтобы войти в грудную полость (рис. 1В). Аккуратно поверните ножницы по мере необходимости и разрежьте, чтобы сделать разрез ~10 мм в межреберье, стараясь не касаться легочной ткани и не резать ребра.
  13. Осторожно нагнетайте сжатый воздух по направлению к межреберью, чтобы увеличить расстояние между легким и грудной стенкой. Выпустите воздух сначала на запястье или руку, чтобы найти подходящую силу потока и очистить сопло от мусора, а затем короткими порциями в разрезе, чтобы предотвратить повреждение легких.
  14. Одной рукой щипцами приподнимите6-е или7-е ребро. Другой рукой зажмите ретрактор и вставьте его в межреберный разрез. Расположите лопасти ретрактора так, чтобы они были параллельны грудной стенке, стараясь не касаться самого легкого (рис. 1D).
  15. После того, как втягивающее устройство будет на месте, медленно отпустите ручку, позволяя втягивающему устройству открыться и обнажить легкое (Рисунок 1E). На рисунке 2A показаны репрезентативные изображения открытых метастазов в легких до фотоконверсии, в том числе то, как они выглядят невооруженным глазом, а также в флуоресцентных каналах FITC (зеленый, нефотоконвертированный) и TRITC (красный, фотоконвертированный) при использовании широкоугольного освещения.

3. Фотоконверсия метастазов в легкие

ПРИМЕЧАНИЕ: Подробности и варианты следующих шагов можно найти в Обсуждении.

  1. Аккуратно нанесите 2-3 капли стерильного PBS, подогретого до 37 °C, на открытую легочную ткань, чтобы предотвратить высыхание.
  2. Положите на мышку кусок стерильной алюминиевой фольги с небольшим вырезом. Расположите вырез непосредственно над обнаженной легочной тканью и измените его размер, чтобы обнажить только открытую часть грудной клетки и несколько миллиметров окружающих мягких тканей и кожи, чтобы обеспечить фотоконверсию только обнаженного легкого.
  3. Поместите коробку с вырезом на мышь и алюминиевую фольгу. Убедитесь, что вырез находится прямо над обнаженным легким.
  4. Поместите фотоконверсионную лампу непосредственно над вырезом на коробке (Рисунок 1F).
  5. Включите фотоконверсионную лампу и дайте 6 минут непрерывного освещения обнаженной легочной ткани.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Следите за жизненно важными показателями мыши с помощью программ физиологического мониторинга на аппарате искусственной вентиляции легких.
  6. После фотопреобразования выключите лампу и снимите с мыши лампу, коробку и маску из алюминиевой фольги.

4. Процедура закрытия грудной стенки

  1. Повторите шаг 2.13, чтобы отделить легкое от грудной стенки.
  2. Осторожно возьмитесь за рукоятку втягивающего устройства и сожмите, чтобы закрыть лезвия.
  3. Вытащите закрытый ретрактор из межреберья, стараясь не касаться легочной ткани.
  4. Используя шелковый шов 5-0, закройте межреберный разрез простым непрерывным швом, который охватывает ребро с обеих сторон разреза (Рисунок 1G). Плотно натяните шов, чтобы края раны были аппозиционными, и восстановите целостность грудной стенки (Рисунок 1H). Следите за тем, чтобы шов не затягивался слишком сильно, так как это может привести к разрыву межреберных мышц.
  5. Закрепите шов, завязав два конца шва вместе 4 раза. Обрежьте хвостики шва как можно ближе к узлу.
  6. Закройте кожу хирургическими скобами.
  7. Удалите лишний воздух из грудной полости инсулиновым шприцем объемом 1 мл с прикрепленной иглой 28 G. Тактильно расположите мечевидный отросток и введите иглу чуть ниже, продвигаясь к левому плечу, чтобы войти в грудную полость через диафрагму. Наберите на шприц ~1 мл; Выньте иглу из мыши и выпустите воздух из шприца. Повторите этот процесс 3-4 раза.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Будьте осторожны, чтобы не проколоть какие-либо внутренние органы. Кроме того, важно использовать шприц объемом 1 мл и повторить процедуру 3-4 раза, а не использовать шприц большего объема и пытаться удалить весь воздух сразу. Использование шприца большего объема может привести к слишком большому вакууму в грудной полости и привести к растяжению и повреждению легочной ткани.
  8. Выключите изофлуран.
  9. Продолжайте вентиляцию со 100% кислородом до тех пор, пока мышь не начнет проявлять признаки пробуждения.
  10. Как только мышь проявит признаки пробуждения, отсоедините интубационный катетер от аппарата искусственной вентиляции легких, разрежьте шов вокруг морды и экстубируйте мышь.
  11. Отсоедините мышь и перенесите ее в чистую клетку, расположенную на расстоянии ~2 футов под тепловой лампой. Наблюдайте до полного выздоровления. Если мышь проявляет признаки затрудненного дыхания или недостаточной подвижности, обезболивайте ее 5% изофлураном в течение 5 мин, обеспечьте адекватную анестезию, наблюдая потерю рефлексов при защемлении пальца ноги, и усыпьте через вывих шейного отдела.
  12. Как только мышь полностью очнется от наркоза и начнет двигаться, приготовьте еще одну дозу бупренорфина 0,1 мг/кг и введите его подкожно для послеоперационного обезболивания.
  13. После операции убедитесь, что мыши размещены индивидуально. Обеспечьте антибиотиками питьевую воду (энрофлоксацин, конечная концентрация 0,4 мг/мл).
  14. В течение 3 дней после операции проверяйте мышь два раза в день на наличие признаков дистресса. Для обезболивания вводят 0,1 мг/кг бупренорфина (0,03 мг/мл) подкожно каждые 4-6 часов. Усыпляйте мышь, если она проявляет признаки инфекции, неподвижности или затрудненного дыхания. После третьего дня мышей можно проверять один раз в день.

5. Обработка образцов и обнаружение фотопреобразованных клеток с помощью очистки тканей

  1. Между 3 и 5 днями (или желаемым промежутком времени) после операции фотоконверсии обезболивают мышь 5% изофлураном, снижают уровень изофлурана с 5% до 2,5% после индукции, обеспечивают адекватную анестезию, наблюдая потерю рефлексов при защемлении пальца ноги, и выполняют терминальную транскардиальную перфузию 10 мл PBS комнатной температуры, а затем 10 мл 4% параформальдегида, охлажденного до 4 °C, как описано ранее31.
  2. Соберите интересующие органы и очистите их оптически, как описано выше31.
  3. Визуализируйте очищенные ткани с помощью светового листового микроскопа, как описано выше31. В качестве альтернативы можно поместить очищенные ткани в чашку со стеклянным дном и получить изображение в каналах FITC и TRITC для визуализации зеленых (нефотоконвертированных) и красных (фотоконвертированных) клеток с помощью конфокального, вращающегося диска или многофотонного микроскопа.

6. Обработка образцов и обнаружение фотопреобразованных клеток с помощью дезагрегации тканей

  1. Обезболивайте мышь 5% изофлураном в течение 5 мин, обеспечьте адекватную анестезию, наблюдая потерю рефлексов при защемлении пальца ноги, и жертвуйте через вывих шейного отдела через 3-5 дней после фотоконверсии.
  2. Соберите и переварите интересующие вас органы, как описано выше13.
  3. Выложите переваренные ткани и поместите их в инкубатор для приклеивания на ночь, как описано ранее13.
  4. На следующий день визуализируйте пластинчатые ячейки в каналах FITC и TRITC, чтобы визуализировать зеленые (нефотоконвертированные) и красные (фотоконвертированные) клетки, как описано ранее13.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Этапы операции, описанные в этом протоколе, проиллюстрированы на рисунке 1. Вкратце, мышь обезболивают, а с левой грудной клетки удаляют волосы. Затем мышь интубируется и вентилируется, что позволяет мыши получать кислород, пока грудная полость открыта. Мягкие ткани удаляются, чтобы обнажить грудную клетку, и делается разрез в6-й или7-й межреберной мышце. Ретрактор вводится в межреберную щель и отпускается, чтобы раздвинуть соседние ребра и обнажить левое легкое и любые...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

В данной работе мы описываем хирургический протокол селективной фотоконверсии опухолевых клеток в легком. Этот метод позволяет исследователям выборочно помечать опухолевые клетки в легких и отслеживать их судьбу, повторно идентифицируя их по всему телу в более поздний момент времени, облегчая изучение метастазов из метастазов в легких. Используя этот протокол, удалось визуализировать фотопреобразованные клетки в головном мозге, печени и нефотопреобразованном правом легком мышей, перенесших операцию с фотоконверсией, что ...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

У авторов нет конфликта интересов, о котором можно было бы заявлять.

Благодарности

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Авторы хотели бы поблагодарить Уэйда Коба за помощь в микрокомпьютерной томографии (S10RR029545), Веру ДеМарэ и Хиллари Гузик из Центра аналитической визуализации за их обучение и помощь в микроскопии, Онкологический центр Монтефиоре им. Эйнштейна, Национальный институт рака (P30CA013330, R01CA21248, R01CA255153), Центр биофотоники им. Грусса Липпера, Программу комплексной визуализации для исследования рака, Стипендия сэра Генри Уэллкома (221647/Z/20/Z) и премия METAvivor за развитие карьеры.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
0-30 В, 0-3 А Источник питанияMPJA9616 PS
12 В постоянного тока, 1,2 А нерегулируемый источник питанияMPJA17563 PD
28 G 1 мл BD Инсулиновый шприцBD329410
400 нм светодиодная массивная лампаLedEngin Inc.897-LZPD0UA00Фотоконверсионная лампа, изготовленная на заказ (отдельные детали включены ниже)
5-0 плетеный шелковый шовный материал с режущей иглой RB-1Ethicon, Inc.774B
9 см 2-0 шелковый галстукEthicon, Inc.LA55G
Baytril 100 (энрофлоксацин)Bayer (Santa Cruz Biotechnology)sc-362890RxАнтибиотик, используемый в питьевой воде
БупренорфинHospira0409-2012-32Обезболивающие
кабели (кабельные сборки) 2,5 JK-ST 72" ZIP CDMouser172-0250
Раствор хлоргексидинаDurvet7-45801-10258-3Хлоргексидин Дезинфицирующий раствор
Баллончик со сжатым воздухомFalconDPSJB-12
Экстра тонкие микрорассекающие ножницы 4 дюйма Прямые Острый/Острый 24 ммRoboz ХирургическиеRS-5912Острые микрорассекающие ножницы
Волоконно-оптический осветительO.C. White CompanyFL3000Используется во время интубации мышей
Gemini Cautery KitHarvard Apparatus726067Ручка для прижигания
Проращиватель 500CellPoint ScientificGER  5287-120ВСтерилизатор Бисер
Щипцы GraefeRobozRS-5135
Светодиоды высокой мощности - одноцветные ультрафиолетовые 90 ВтMouserLZP-D0UA00
Инфракрасная тепловая лампаBraintree ScientificHL-1
Isoflurane SOL 250 мл PVLCovetrus29405Анестетик
изофлуран ИспарительSurgiVetVCT302
Иглодержатель Jacobson с замкомKalson SurgicalT1-140
Маркировочная лентаFisher ScientificS68702
Светодиодные отражатели освещения CREE MP-L SNGL Линзовый отражатель & LOC PINMouser928-C11395TM
Аппликаторы с длинным хлопковым наконечникомMedline IndustriesMDS202055
Masscool / Soccket 478 / Intel Pentium 4 / Celeron до 3,4 ГГц / Шарикоподшипник / Медный сердечник / Вентилятор охлаждения процессораCompUSA#S457-1023
Микро препарирующие ножницы 4 " Прямые тупые / ТупыеRS-5980Тупые микро препарирующие ножницы
Мышиный аппарат искусственной вентиляции легкихKent Scientific PS-02PhysioSuite
Nair Лосьон для депиляцииAmazonB001RVMR7Kкрем для депиляции
Personnet мини ретракторRobozRS-6504Ретрактор
фосфатный буферный физраствор 1xFisher Scientific14190144PBS
pLenti.CAG.H2B-Dendra2.WAddgene51005Dendra2 лентивирус
PuralubeHenry Schein Animal Health008897Eye Lubricant Стенд
интубации грызуновBraintree ScientificRIS 100
Лампа для надувания легких мелких животныхHarvard Apparatus72-9083
Многофункциональная хирургическая платформа SurgiSuite для мышей, с согреваниемKent ScientificSURGI-M02Хирургическая платформа с подогревом
Тестовые провода 48" ТЕСТОВЫЙ ПРОВОД БАНАН - ЧЕРНЫЙMouser565-1440-48-0
Измерительные провода 48" ТЕСТОВЫЙ ПРОВОД BANANA - RedMouser565-1440-48-2
Трахеальный катетер Exelint International2674622 G катетер
Система закрытия ран ветеринарный наборClay AdamsIN015Ветеринарный хирургический набор для сшивания
роботизированные хирургические ножницы для

Ссылки

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Dillekås, H., Rogers, M. S., Straume, O. Are 90% of deaths from cancer caused by metastases. Cancer Medicine. 8 (12), 5574-5576 (2019).
  2. Gupta, G. P., Massagué, J. Cancer metastasis: building a framework. Cell. 127 (4), 679-695 (2006).
  3. Nguyen, D. X., Bos, P. D., Massagué, J. Metastasis: from dissemination to organ-specific colonization. Nature Reviews. Cancer. 9 (4), 274-284 (2009).
  4. Paget, S. The distribution of secondary growths in cancer of the breast. Cancer Metastasis Reviews. 8 (2), 98-101 (1989).
  5. Liu, T., et al. Self-seeding circulating tumor cells promote the proliferation and metastasis of human osteosarcoma by upregulating interleukin-8. Cell Death & Disease. 10 (8), 575(2019).
  6. Liu, H., et al. Tumor-derived exosomes promote tumor self-seeding in hepatocellular carcinoma by transferring miRNA-25-5p to enhance cell motility. Oncogene. 37 (36), 4964-4978 (2018).
  7. Kim, M. -Y., et al. Tumor self-seeding by circulating cancer cells. Cell. 139 (7), 1315-1326 (2009).
  8. Zhang, Y., et al. Tumor self-seeding by circulating tumor cells in nude mouse models of human osteosarcoma and a preliminary study of its mechanisms. Journal of Cancer Research and Clinical Oncology. 140 (2), 329-340 (2014).
  9. Dondossola, E., Crippa, L., Colombo, B., Ferrero, E., Corti, A. Chromogranin A regulates tumor self-seeding and dissemination. Cancer Research. 72 (2), 449-459 (2012).
  10. Brown, M., et al. Lymph node blood vessels provide exit routes for metastatic tumor cell dissemination in mice. Science. 359 (6382), 1408-1411 (2018).
  11. Pereira, E. R., et al. Lymph node metastases can invade local blood vessels, exit the node, and colonize distant organs in mice. Science. 359 (6382), 1403-1407 (2018).
  12. Coste, A., et al. Hematogenous dissemination of breast cancer cells from lymph nodes is mediated by tumor microenvironment of metastasis doorways. Frontiers in Oncology. 10, 571100(2020).
  13. Borriello, L., Condeelis, J., Entenberg, D., Oktay, M. H. Breast cancer cell re-dissemination from lung metastases-a mechanism for enhancing metastatic burden. Journal of Clinical Medicine. 10 (11), 2340(2021).
  14. Ullah, I., et al. Evolutionary history of metastatic breast cancer reveals minimal seeding from axillary lymph nodes. The Journal of Clinical Investigation. 128 (4), 1355-1370 (2018).
  15. Gundem, G., et al. The evolutionary history of lethal metastatic prostate cancer. Nature. 520 (7547), 353-357 (2015).
  16. Brown, D., et al. Phylogenetic analysis of metastatic progression in breast cancer using somatic mutations and copy number aberrations. Nature Communications. 8, 14944(2017).
  17. Kalhor, R., Mali, P., Church, G. M. Rapidly evolving homing CRISPR barcodes. Nature Methods. 14 (2), 195-200 (2017).
  18. Kalhor, R., et al. Developmental barcoding of whole mouse via homing CRISPR. Science. 361 (6405), eaat9804(2018).
  19. McKenna, A., et al. Whole-organism lineage tracing by combinatorial and cumulative genome editing. Science. 353 (6298), aaf7907(2016).
  20. Junker, J. P., et al. Massively parallel clonal analysis using CRISPR/Cas9 induced genetic scars. bioRxiv. , 056499(2017).
  21. Zhang, W., et al. The bone microenvironment invigorates metastatic seeds for further dissemination. Cell. 184 (9), 2471.e20-2486.e20 (2021).
  22. Kedrin, D., et al. Intravital imaging of metastatic behavior through a mammary imaging window. Nature Methods. 5 (12), 1019-1021 (2008).
  23. Grau, N., et al. Spatiotemporally controlled induction of gene expression in vivo allows tracking the fate of tumor cells that traffic through the lymphatics. International Journal of Cancer. 147 (4), 1190-1198 (2020).
  24. Riihimäki, M., Thomsen, H., Sundquist, K., Sundquist, J., Hemminki, K. Clinical landscape of cancer metastases. Cancer Medicine. 7 (11), 5534-5542 (2018).
  25. Gurskaya, N. G., et al. Engineering of a monomeric green-to-red photoactivatable fluorescent protein induced by blue light. Nature Biotechnology. 24 (4), 461-465 (2006).
  26. Zhang, G. -L., Zhang, Y., Cao, K. -X., Wang, X. -M. Orthotopic injection of breast cancer cells into the mice mammary fat pad. Journal of Visualized Experiments. (143), (2019).
  27. Pavese, J., Ogden, I. M., Bergan, R. C. An orthotopic murine model of human prostate cancer metastasis. Journal of Visualized Experiments. (79), (2013).
  28. Thies, K. A., Steck, S., Knoblaugh, S. E., Sizemore, S. T. Pathological analysis of lung metastasis following lateral tail-vein injection of tumor cells. Journal of Visualized Experiments. (159), (2020).
  29. Das, S., MacDonald, K., Sucie Chang, h-y, Mitzner, W. A simple method of mouse lung intubation. Journal of Visualized Experiments. (73), e50318(2013).
  30. DuPage, M., Dooley, A. L., Jacks, T. Conditional mouse lung cancer models using adenoviral or lentiviral delivery of Cre recombinase. Nature Protocols. 4 (7), 1064-1072 (2009).
  31. Hsu, C. -W., et al. EZ Clear for simple, rapid, and robust mouse whole organ clearing. eLife. 11, e77419(2022).
  32. Entenberg, D., et al. Setup and use of a two-laser multiphoton microscope for multichannel intravital fluorescence imaging. Nature Protocols. 6 (10), 1500-1520 (2011).
  33. Gambotto, A., et al. Immunogenicity of enhanced green fluorescent protein (EGFP) in BALB/c mice: identification of an H2-Kd-restricted CTL epitope. Gene Therapy. 7 (23), 2036-2040 (2000).
  34. Han, W. G. H., Unger, W. W. J., Wauben, M. H. M. Identification of the immunodominant CTL epitope of EGFP in C57BL/6 mice. Gene Therapy. 15 (9), 700-701 (2008).
  35. Stripecke, R., et al. Immune response to green fluorescent protein: implications for gene therapy. Gene Therapy. 6 (7), 1305-1312 (1999).
  36. Rosenzweig, M., et al. Induction of cytotoxic T lymphocyte and antibody responses to enhanced green fluorescent protein following transplantation of transduced CD34(+) hematopoietic cells. Blood. 97 (7), 1951-1959 (2001).
  37. Grzelak, C. A., et al. Elimination of fluorescent protein immunogenicity permits modeling of metastasis in immune-competent settings. Cancer Cell. 40 (1), 1-2 (2022).
  38. Fluegen, G., et al. Phenotypic heterogeneity of disseminated tumour cells is preset by primary tumour hypoxic microenvironments. Nature Cell Biology. 19 (2), 120-132 (2017).
  39. Yan, C., et al. Visualizing engrafted human cancer and therapy responses in immunodeficient zebrafish. Cell. 177 (7), 1903.e14-1914.e14 (2019).
  40. Borriello, L., Traub, B., Coste, A., Oktay, M. H., Entenberg, D. A permanent window for investigating cancer metastasis to the lung. Journal of Visualized Experiments. (173), (2021).
  41. Tohme, S., Simmons, R. L., Tsung, A. Surgery for cancer: a trigger for metastases. Cancer Research. 77 (7), 1548-1552 (2017).
  42. Al-Sahaf, O., Wang, J. H., Browne, T. J., Cotter, T. G., Redmond, H. P. Surgical injury enhances the expression of genes that mediate breast cancer metastasis to the lung. Annals of Surgery. 252 (6), 1037-1043 (2010).
  43. Lu, N., Piao, M. -H., Feng, C. -S., Yuan, Y. Isoflurane promotes epithelial-to-mesenchymal transition and metastasis of bladder cancer cells through HIF-1α-β-catenin/Notch1 pathways. Life Sciences. 258, 118154(2020).
  44. Jiao, B., et al. Relationship between volatile anesthetics and tumor progression: unveiling the mystery. Current Medical Science. 38 (6), 962-967 (2018).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на повторное использование текста или иллюстраций этой статьи JoVE

Запросить разрешение

Теги

Dendra2in vivo

Похожие статьи