Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.

Методическая статья

Использование нервно-мышечного соединения личинок дрозофилы и мышечных клеток для визуализации сети микротрубочек

4.1K просмотров

⸱

DOI:

10.3791/65774

⸱

20 октября 2023 г.

 ,  ,  ,  , 
1National & Local Joint Engineering Research Center of High-throughput Drug Screening Technology, School of life science, Hubei University

В этой статье

Краткое содержание

Здесь мы представляем подробный протокол визуализации сетей микротрубочек в нервно-мышечных соединениях и мышечных клетках. В сочетании с мощными генетическими инструментами Drosophila melanogaster, этот протокол значительно облегчает генетический скрининг и анализ динамики микротрубочек для определения роли регуляторных белков сети микротрубочек в нервной системе.

Аннотация

Сеть микротрубочек является важным компонентом нервной системы. Мутации во многих регуляторных белках микротрубочек связаны с нарушениями развития нервной системы и неврологическими заболеваниями, например, микротрубочки-ассоциированный белок Tau с нейродегенеративными заболеваниями, расщепляющий микротрубочки белок Spastin и Katanin 60 вызывают наследственную спастическую параплегию и аномалии развития нервной системы, соответственно. Обнаружение сетей микротрубочек в нейронах полезно для выяснения патогенеза неврологических расстройств. Однако небольшой размер нейронов и плотное расположение пучков аксональных микротрубочек затрудняют визуализацию сетей микротрубочек. В данной работе мы описываем метод рассечения нервно-мышечного соединения личинок и мышечных клеток, а также иммуноокрашивание α-тубулина и микротрубочно-ассоциированного белка Futsch для визуализации сетей микротрубочек у Drosophila melanogaster. Нервно-мышечное соединение позволяет нам наблюдать как пре-, так и постсинаптические микротрубочки, а большой размер мышечных клеток у личинки дрозофилы позволяет четко визуализировать сеть микротрубочек. Здесь, мутируя и гиперэкспрессируя катанин 60 у Drosophila melanogaster, а затем исследуя сети микротрубочек в нервно-мышечном соединении и мышечных клетках, мы точно выявляем регуляторную роль катанина 60 в развитии нервной системы. Таким образом, в сочетании с мощными генетическими инструментами Drosophila melanogaster, этот протокол значительно облегчает генетический скрининг и анализ динамики микротрубочек на предмет роли регуляторных белков сети микротрубочек в нервной системе.

Введение

Микротрубочки (МТ), как один из структурных компонентов цитоскелета, играют важную роль в различных биологических процессах, включая деление клеток, рост и подвижность клеток, внутриклеточный транспорт и поддержание формы клеток. Динамика и функция микротрубочек модулируются взаимодействием с другими белками, такими как MAP1, MAP2, Tau, Katanin и Kinesin 1,2,3,4,5.

В нейронах микротрубочки необходимы для развития и поддержания аксонов и дендритов. Аномалии в микротрубочках приводят к дисфункции и даже гибели нейронов. Например, в головном мозге пациентов с болезнью Альцгеймера гиперфосфорилирование тау-белка снижает стабильность сети микротрубочек, вызывая неврологическиенарушения. Таким образом, изучение сетей микротрубочек будет способствовать пониманию развития нервной системы и патогенеза неврологических заболеваний.

Нервно-мышечное соединение (NMJ) представляет собой периферический синапс, образованный между окончанием аксона двигательного нейрона и мышечным волокном, который является превосходной и мощной модельной системой для изучения синаптической структуры и функций7. Futsch — белок дрозофилы, гомологичный белку MAP1B, связывающему микротрубочки, обнаруженному у млекопитающих8. Он экспрессируется только в нейронах и играет роль в развитии синаптических кнопок NMJ 8,9. У дикого типа нитевидные пучки, проходящие вдоль центра NMJ, визуализируются путем иммуноокрашивания анти-Futsch. Достигнув конца NMJ, этот пучок имеет способность либо образовывать петлю, состоящую из микротрубочек, либо терять свою нитевидную структуру, что приводит к диффузному и точечному виду10. Петли микротрубочек связаны с приостановленными конусами роста, что позволяет предположить, что массив микротрубочек стабилен11. Таким образом, мы можем косвенно определить стабильное развитие микротрубочек в NMJ с помощью окрашивания по методу Футча. Большой размер мышечных клеток у личинки дрозофилы позволяет четко визуализировать сеть микротрубочек. Факторы, влияющие на стабильность сети микротрубочек, могут быть обнаружены путем анализа плотности и формы микротрубочек. В то же время, состояние сети микротрубочек мышечных клеток может быть перепроверено с результатом NMJ для получения более полных выводов.

Для исследования сети и динамики микротрубочек было использовано множество протоколов. Тем не менее, эти исследования часто сосредотачивались на исследованиях in vitro 12,13,14,15,16. Кроме того, в некоторых экспериментах in vivo использовалась электронная микроскопия для обнаружения цитоскелета17. В соответствии со специфическим связыванием флуоресцентно меченных антител или химических красителей с белками или ДНК, представленные здесь методы позволяют обнаруживать сети микротрубочек в NMJ на уровне отдельных нейронов in vivo, причем результаты подтверждаются наблюдениями в мышечных клетках. Этот протокол прост, стабилен и воспроизводим в сочетании с мощными генетическими инструментами, доступными у Drosophila melanogaster, что позволяет проводить широкий спектр фенотипических исследований и генетических скринингов на роль регуляторных белков сети микротрубочек в нервной системе in vivo.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

1. Вскрытие личинок

ПРИМЕЧАНИЕ: Рассекающий раствор гемолимфоподобного физиологического раствора (HL3.1)18 и фиксирующий раствор 4% параформальдегида (PFA)19,20 используются при комнатной температуре, поскольку микротрубочки деполимеризуются при слишком низкой температуре.

  1. Выберите блуждающую личинку3-го возраста длинными тупыми щипцами. Промойте его HL3.1 и поместите на чашку для препарирования под стереомикроскопом.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Блуждающая личинка3-го возраста идентифицируется по разветвленному переднему дыхальцу и ползает по трубке примерно через 96 ч (25 °C)21.
  2. Расположите личинку спинной или брюшной стороной вверх. Определите дорсальную сторону по двум длинным трахеям, а вентральную — по брюшным зубным поясам.
    1. В зависимости от ткани, которую необходимо исследовать, выберите дорсальную или вентральную диссекцию. Это позволит получить более точное и детальное представление о конкретной интересующей области. Для наблюдения за NMJ и мышечными клетками разрезают спинную и вентральную области личинки соответственно.
  3. Приколите рот крючками и хвостиком. Отрегулируйте штифты, чтобы сохранить личинку в вытянутом состоянии. Добавьте в личинку каплю HL3.1, чтобы она не высохла.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Ca2+ -free HL 3.1 можно использовать для минимизации сокращения мышц во время рассечения.
  4. С помощью ножниц для рассечения сделайте небольшой поперечный надрез близко к заднему концу, но не отрезайте задний конец. Затем разрезают по вентральной средней линии по направлению к переднему концу.
  5. Вставьте четыре булавки в виде насекомых по четырем углам личинки. Отрегулируйте булавки насекомых таким образом, чтобы личинка максимально растянулась во все стороны.
  6. Используйте щипцы для удаления внутренних органов, не повреждая при этом мышцы.

2. Фиксация

  1. Добавьте 100 мкл PFA (4%), чтобы погрузить туши на 40 минут, пока туши все еще прикреплены к чашке для препарирования.
    ВНИМАНИЕ: Принимаются эффективные меры защиты, чтобы избежать прямого контакта с кожей или вдыхания, так как PFA представляет опасность.
  2. Снимите штифты и перенесите образец в пробирку для микроцентрифуги объемом 2 мл. Смойте PFA 1x фосфатным буфером физиологического раствора, содержащим 0,2% Triton X-100 (0,2% PBST), чтобы заполнить пробирку микроцентрифуги объемом 2 мл в течение 10 минут на шейкере для обесцвечивания при 15 об/мин. Повторите процесс стирки 5 раз.

3. Иммуноцитохимия

  1. Погрузите туши в блокирующее средство (5% козья сыворотка в 0,2% PBST) и блокируйте на 40 мин при комнатной температуре.
  2. Удалите блокирующий агент и замените его 200 мкл первичного антитела (например, анти-α-тубулина, 1:1000; анти-Футча, 1:50), разбавленного 0,2% PBST при 4 °C в течение ночи. Визуализируйте мышечные микротрубочки с помощью иммуноокрашивания моноклональным анти-α-тубулином. Anti-Futsch может косвенно отражать морфологию микротрубочек в NMJ.
  3. После инкубации первичного антитела личинки промывают 0,2% ПБСТ в течение 10 мин. Повторить 5 раз.
  4. Инкубируют личинок с 200 мкл вторичного антитела (например, козьего анти-Мауса-488, 1:1000), разбавленного 0,2% PBST при комнатной температуре, в течение 1,5 ч в темноте.
  5. Далее добавляют ядерный краситель типа TO-PRO(R)3 йодида (T3605) в концентрации 1:1000 в инкубационную пробирку на 30 мин при окрашивании микротрубочек в темноте20,22.
  6. Смойте вторичное антитело и ядерный краситель 0,2% PBST в течение 10 мин. Повторите 5 раз в темноте.

4. Монтаж

  1. Поместите тушку личинки в 0,2% ПБСТ на предметное стекло и отрегулируйте ее под стереомикроскопом. Убедитесь, что внутренняя поверхность туши личинки обращена вверх, а все тушки личинок расположены так, как нужно.
  2. Излишки раствора ПБСТ впитайте салфеткой и аккуратно добавьте каплю монтажного средства против выцветания.
  3. Положите на предметное стекло покровный листок, чтобы медленно и осторожно накрыть препарированных личинок, чтобы избежать пузырьков.
  4. Нанесите лак для ногтей вокруг покровного стекла. Поместите предметное стекло в темное место, чтобы уменьшить затухание флуоресценции.

5. Получение изображения

  1. Для получения изображений используйте лазерный сканирующий конфокальный микроскоп, выберите 60-кратный масляный иммерсионный объектив (числовая апертура 1,42) или аналогичный и отрегулируйте мощность лазера и длину волны в зависимости от эксперимента.
  2. Чтобы идентифицировать NMJ, сделайте снимки в мышце 4 в сегменте A3 (как показано на рисунке 1F). Выберите лазер с длиной волны 488 нм для активации α-тубулина или Футша и 543 нм для активации трека визуализации HRP. Настройте параметры на размер кадра 800 x 800 пикселей, цифровой зум 2,0 и интервал изображения 0,8 мкм в NMJ (рис. 2).
  3. Чтобы идентифицировать микротрубочки в мышце, сделайте снимки мышцы 2 в сегменте A3-A5 (как показано на рисунке 1G), так как у нее меньше трахеальных ветвей. Выберите лазер с длиной волны 488 нм для активации α-тубулина и лазер с длиной волны 635 нм для активации трека визуализации T3605. Настройте параметры на размер кадра 1024 x 1024 пикселя, цифровой зум 3,0 и интервал визуализации 0,4 мкм в мышечных клетках (рис. 3).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

Мы продемонстрировали пошаговую процедуру визуализации сети микротрубочек как в нервно-мышечных соединениях (NMJ), так и в мышечных клетках. После вскрытия в соответствии с принципиальной схемой (рис. 1A-E) проводится иммуноокрашивание, после чего изображения наблюдаются и собираются под лазерным конфокальным микроскопом или стереоскопическим флуоресцентным микроскопом (рис. 1F,G).

Как пре-, так и пос...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

Здесь описан протокол вскрытия и иммуноокрашивания нервно-мышечных соединений личинок дрозофилы и мышечных клеток. Есть несколько важных моментов, которые следует учитывать. Во-первых, во время процесса рассечения очень важно избежать травмирования наблюдаемых мышц. Возможно, стоит зафиксировать филе перед удалением внутренних органов, чтобы предотвратить прямой контакт щипцов с мышцами. Чтобы избежать повреждения мышц или отрыва от личиночного эпидермиса, важно следить за тем, чтобы скорость шейкера не превышал...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

Авторам нечего раскрывать.

Благодарности

Мы благодарим д-ра Ин Сюна за обсуждение и комментарии к рукописи. Эта работа поддержана грантом Национального научного фонда Китая (NSFC) C. M. (31500839).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
Alexa Fluor Plus 405 фаллоидинinvitrogenA30104разбавленный 1:200
Enhanced Antifade Mounting MediumBeyotimeP0128M
FV10-ASW конфокальный микроскопOlympus
Goat антимышиный антитело, Alexa Fluor 488 конъюгированныйThermo FisherA-11001разбавленный 1:1,000
Лазерный конфокальный микроскоп LSM 710Zeiss
Micro Scissors66vision54138B
Мышь против антител FutschИсследования развития Hybridoma Bank   22C10разбавленный 1:50
Мышиный анти-&альфа;-тубулин антителаSigmaT5168разбавленный 1:1,000
ПараформальдегидWako168-20955Конечная концентрация: 4% в PB Буфер
Нержавеющая сталь Минютиены ШтифтыЭнтоморавия0,1 мм Диам
Стереомикроскоп SMZ161Мотик
стереоскопическая флуоресценция микроскоп BX41Olympus
Texas Красный конъюгированный козий анти-HRPJackson ImmunoResearchразбавлять 1:100
TO-PRO(R) 3 йодидInvitrogenT3605разбавлять 1:1,000
Трансферный обесцвечивающий шейкер TS-8Kylin-Bell лабораторные инструментыE0018
TritonX-100BioFroxx1139
пинцет Дюмон500342

Ссылки

  1. Halpain, S., Dehmelt, L. The MAP1 family of microtubule-associated proteins. Genome biology. 7 (6), 224(2006).
  2. Sánchez, C., Díaz-Nido, J., Avila, J. Phosphorylation of microtubule-associated protein 2 (MAP2) and its relevance for the regulation of the neuronal cytoskeleton function. Progress in neurobiology. 61 (2), 133-168 (2000).
  3. Dehmelt, L., Halpain, S. The MAP2/Tau family of microtubule-associated proteins. Genome biology. 6 (1), 204(2005).
  4. Roll-Mecak, A., McNally, F. J. Microtubule-severing enzymes. Current opinion in cell biology. 22 (1), 96-103 (2010).
  5. Walczak, C. E., Gayek, S., Ohi, R. Microtubule-depolymerizing kinesins. Annual review of cell and developmental biology. 29, 417-441 (2013).
  6. Bramblett, G. T., et al. Abnormal tau phosphorylation at Ser396 in Alzheimer's disease recapitulates development and contributes to reduced microtubule binding. Neuron. 10 (6), 1089-1099 (1993).
  7. Van Vactor, D., Sigrist, S. J. Presynaptic morphogenesis, active zone organization and structural plasticity in Drosophila. Current opinion in neurobiology. 43, 119-129 (2017).
  8. Hummel, T., Krukkert, K., Roos, J., Davis, G., Klämbt, C. Drosophila Futsch/22C10 is a MAP1B-like protein required for dendritic and axonal development. Neuron. 26 (2), 357-370 (2000).
  9. Roos, J., Hummel, T., Ng, N., Klämbt, C., Davis, G. W. Drosophila Futsch regulates synaptic microtubule organization and is necessary for synaptic growth. Neuron. 26 (2), 371-382 (2000).
  10. Packard, M., et al. The Drosophila Wnt, wingless, provides an essential signal for pre- and postsynaptic differentiation. Cell. 111 (3), 319-330 (2002).
  11. Dent, E. W., Callaway, J. L., Szebenyi, G., Baas, P. W., Kalil, K. Reorganization and movement of microtubules in axonal growth cones and developing interstitial branches. The Journal of neuroscience: the official journal of the Society for Neuroscience. 19 (20), 8894-8908 (1999).
  12. Tanaka, E. M., Kirschner, M. W. Microtubule behavior in the growth cones of living neurons during axon elongation. The Journal of cell biology. 115 (2), 345-363 (1991).
  13. Ahmad, F. J., Yu, W., McNally, F. J., Baas, P. W. An essential role for katanin in severing microtubules in the neuron. The Journal of cell biology. 145 (2), 305-315 (1999).
  14. Hu, Z., et al. Fidgetin regulates cultured astrocyte migration by severing tyrosinated microtubules at the leading edge. Molecular biology of the cell. 28 (4), 545-553 (2017).
  15. Feizabadi, M. S., Castillon, V. J. The effect of Tau and taxol on polymerization of MCF7 microtubules in vitro. International journal of molecular sciences. 23 (2), 677(2022).
  16. Velasco, C. D., et al. Microtubule depolymerization contributes to spontaneous neurotransmitter release in vitro. Communications biology. 6 (1), 488(2023).
  17. Höög, J. L., et al. Electron tomography reveals a flared morphology on growing microtubule ends. Journal of cell science. 124, 693-698 (2011).
  18. Feng, Y., Ueda, A., Wu, C. F. A modified minimal hemolymph-like solution, HL3.1, for physiological recordings at the neuromuscular junctions of normal and mutant Drosophila larvae. Journal of neurogenetics. 18 (2), 377-402 (2004).
  19. Broadie, K. S., Bate, M. Development of the embryonic neuromuscular synapse of Drosophila melanogaster. The Journal of neuroscience: the official journal of the Society for Neuroscience. 13 (1), 144-166 (1993).
  20. Xiong, Y., et al. HDAC6 mutations rescue human tau-induced microtubule defects in Drosophila. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (12), 4604-4609 (2013).
  21. Sullivan, W., Ashburner, M., Hawley, R. S. Drosophila Protocols. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. (2000).
  22. Mao, C. X., et al. Microtubule-severing protein Katanin regulates neuromuscular junction development and dendritic elaboration in Drosophila. Development. 141 (5), 1064-1074 (2014).
  23. Jin, S., et al. Drosophila Tubulin-specific chaperone E functions at neuromuscular synapses and is required for microtubule network formation. Development. 136 (9), 1571-1581 (2009).
  24. Sarthi, J., Elefant, F. dTip60 HAT activity controls synaptic bouton expansion at the Drosophila neuromuscular junction. PloS one. 6 (10), 26202(2011).
  25. Weingarten, M. D., Lockwood, A. H., Hwo, S. Y., Kirschner, M. W. A protein factor essential for microtubule assembly. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 72 (5), 1858-1862 (1975).
  26. Kadavath, H., et al. Tau stabilizes microtubules by binding at the interface between tubulin heterodimers. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (24), 7501-7506 (2015).
  27. Trotta, N., Orso, G., Rossetto, M. G., Daga, A., Broadie, K. The hereditary spastic paraplegia gene, spastin, regulates microtubule stability to modulate synaptic structure and function. Current biology: CB. 14 (13), 1135-1147 (2004).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Теги

Нейромышечный синапс Drosophilaдинамика микротрубочеккатанин 60окрашивание на альфа-тубулинконфокальная микроскопиягенетический скринингпротокол иммуноокрашиваниянейроонтогенетические расстройства
Использование нервно-мышечного соединения личинок дрозофилы и мышечных клеток для визуализации сети микротрубочек
Связаться с нами
Порекомендовать библиотеке

Конфиденциальность

Условия использования

Политики

© 2026 MyJoVE Corporation. Все права защищены.