Здесь мы опишем собственный анализ активности фактора внеклеточной везикулярной ткани. Анализы, основанные на активности, и анализы на основе антигенов были использованы для измерения тканевого фактора во внеклеточных везикулах из образцов плазмы крови человека. Анализы, основанные на активности, имеют более высокую чувствительность и специфичность, чем анализы на основе антигенов.
Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.
Методическая статья
Анализ активности факторов внеклеточной везикулярной ткани
В этой статье
Краткое содержание
Аннотация
Тканевый фактор (ТФ) является трансмембранным рецептором для факторов (F) VII и FVIIa. Комплекс TF/FVIIa инициирует коагуляционный каскад, активируя как FIX, так и FX. ТФ высвобождается из клеток в кровоток в виде внеклеточных везикул (ВВ). Уровень ТФ-положительных (+) ВВ повышен при различных заболеваниях, включая онкологические, бактериальные и вирусные инфекции, цирроз печени, и связан с тромбозом, диссеминированным внутрисосудистым свертыванием, тяжестью заболевания и летальностью. Существует два способа измерения ТФ+ ВВ в плазме: анализ на основе антигена и анализ на основе активности. Данные свидетельствуют о том, что анализы, основанные на активности, обладают более высокой чувствительностью и специфичностью, чем анализы на основе антигенов. В этом документе описывается наш собственный анализ активности EVTF, основанный на двухступенчатом анализе генерации FXa. FVIIa, FX и кальций добавляют к образцам, содержащим ТФ+ EV, для генерации FXa в присутствии и отсутствии антител к ТФ, чтобы отличить ТФ-зависимую генерацию FXa от TF-независимой генерации FXa. Для определения уровня FXa используется хромогенный субстрат, расщепленный FXa, в то время как стандартная кривая, сгенерированная с помощью релипированного рекомбинантного TF, используется для определения концентрации TF. Этот собственный анализ активности ЭВТФ обладает более высокой чувствительностью и специфичностью, чем коммерческий анализ активности ТФ.
Введение
Свертывание крови начинается со связывания фактора (F) VII/VIIa с тканевым фактором (TF)1. Комплекс TF/FVIIa активирует как FIX, так и FX для активации свертывания крови1. Существует две формы полноразмерного мембранного ТФ: зашифрованный и активный. Кроме того, существует альтернативно сплайсированная форма ТФ (asTF). Сфингомиелин и фосфатидилхолин в наружной створке клеточной мембраны поддерживают ТФ в зашифрованном состоянии 2,3,4. Когда клетки активируются или повреждаются, фосфолипидная скрамблаза переносит фосфатидилсерин ....
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Протокол
Исследование было одобрено Институциональным наблюдательным советом Университета Северной Каролины в Чапел-Хилл (номер протокола: 14-2108).
1. Забор крови у доноров
- Соберите цельную кровь с помощью чистой венепункции в локтевую вену иглой 21 G. Первые 3 мл крови выбросить, так как эта порция крови может содержать ТФ из периваскулярных клеток.
- Наберите 2,7 или 1,8 мл (в зависимости от размера пробирок) крови в вакутейнер, содержащий 3,2% цитрата натрия (0,109 моль/л). Не переполняйте или недополняйте трубки. Осторожно переверните пробирки сразу после забора крови, чтобы диспергировать цитрат натрия. ....
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Результаты
При успешном получении положительного контрольного значения ≥0,5 пг/мл и отрицательного контрольного значения <0,5 пг/мл. Для положительного контроля лучше всего найти ответчик с высоким ЛПС с активностью EVTF >1,0 пг/мл. Репрезентативный результат показывает активность ЭВТФ ВВ, выделенных из плазмы цельной крови 11 здоровых доноров, с активацией ЛПС и без нее (рис. 4). Шесть из одиннадцати доноров (доноры 2, 4, 5, 8, 10, 11) имели средний и высокий уровень ответа на ЛПС, в то время ка.......
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Обсуждение
Здесь представлен протокол нашего собственного анализа активности ЭВТФ. Протокол состоит из трех важнейших этапов. При восстановлении гранулы EV важно проводить пипеткой вверх и вниз в том месте, где находится гранула EV, даже если она не видна. Неполное восстановление гранулы EV приведет к ложноотрицательному результату или занижению значений активности EVTF образцов. Во-вторых, использование HBSA-Ca(+) имеет решающее значение на шаге 6.5 протокола, поскольку генерация FXa не может быть произведена без кальция. В-третьи.......
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Раскрытие информации
Нет никаких конкурирующих интересов, которые нужно раскрывать.
Благодарности
Эта работа была поддержана R35HL155657 NIH NHLBI (Нью-Мексико) и профессором Джона С. Паркера (Нью-Мексико). Мы хотели бы поблагодарить г-жу Сьерру Арчибальд за ее полезные комментарии
....Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Материалы
| Имя | Компания | Каталожный номер | Комментарии |
|---|---|---|---|
| Пробирка объемом 1,5 мл для 20 000 x g | любой компании | N/A | Мы используем пробирку от Fisher Scientific (каталожный номер: 05-408-129). |
| Пробирка 1,5 мл для ультрацентрифуги | любой компании | Н/Д | Мы используем ту, что от Beckman Coulter (Каталожный номер: 357448) |
| 15 мл Туба | любой компании | Н/Д | Мы используем ту, что от VWR (Каталожный номер: 89039-666) |
| 21 G x .75 дюйма. BD Vacutainer Safety-Lok Набор для сбора крови 12 дюймов. трубка и адаптер Люэра | BD | 367281 | |
| 96-луночной пластине | любой фирмы | N/A | Мы используем тот, который от Globe Scientific (Каталожный номер: 120338). |
| BD Vacutainer Цитратные пробирки | BD | 363083 | |
| Бычий сывороточный альбумин | Sigma Aldrich | A9418 | |
| Хлорид кальция | Fisher Scientific | C69-500 | |
| Центрифуга для пробирки 1,5 мл | любой фирмы | N/A | Мы используем центрифугу 5417R (Eppendorf). |
| Центрифуга для пробирки 15 мл | любой фирмы | N/A | Мы используем центрифугу 5810R (Eppendorf). |
| D-(+)-глюкоза | Sigma Aldrich | G7021 | |
| Этилендиаминтетрауксусная кислота дигидрат тетранатриевой соли | Sigma Aldrich | E6511 | |
| Hepes | Sigma Aldrich | H4034 | |
| Лаборатория исследования ферментов | человека FVIIa | HFVIIa | Раствор следует разбавлять HBSA-Ca(+). |
| Лаборатория исследования | ферментов FX человека | HFX1010 | Раствор следует разбавлять HBSA-Ca(+). |
| Ингибирующий мышиный античеловеческий тканевый фактор IgG, клон HTF-1 | Fisher Scientific | 550252 | |
| Липополисахарид из Escherichia coli O111:B4 | Sigma Aldrich | L2630 | Существует несколько липополисахаридов из разных E. coli. Разные липополисахариды имеют разный потенциал активации моноцитов. |
| Мышь IgG | Sigma Aldrich | I5381 | |
| Pefachrome FXa 8595 | Enzyme Research Laboratory | 085-27 | |
| Планшетный ридер | любой компании | N/A | Мы используем SpectraMax i3x от Molecular Devices |
| Re-lipiated рекомбинантный тканевый фактор, Dade Innovin | Siemens 10873566 | ||
| Sodium chloride | Fisher Scientific | S271-500 | |
| Beckman Coulter | Optima TLX | ||
| Ультрацентрифуга | Beckman Coulter | TLA-55 |
Ссылки
- Grover, S. P., Mackman, N. Tissue factor: an essential mediator of hemostasis and trigger of thrombosis. Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 38 (4), 709-725 (2018).
- Shaw, A. W., Pureza, V. S., Sligar, S. G., Morrissey, J. H.
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Перепечатки и разрешения
