В данном протоколе описан метод измерения давления и объема левого желудочка с использованием метода «давление-объемная проводимость». Этот метод позволяет осуществлять непрерывный мониторинг воздействия лекарств на сердце в режиме реального времени.
Методическая статья
Детектирование воздействия феруловой кислоты на левый желудочек крысы в режиме реального времени с помощью катетера проводимости «давление-объем»
В этой статье
Краткое содержание
Аннотация
Снижение сердечной функции может оказывать негативное влияние на другие органы. Соотношение давления в левом желудочке к объему считается валидным методом оценки сердечной функции. Мониторинг сердечной функции в режиме реального времени важен для оценки лекарственных препаратов. В условиях закрытой грудной клетки миниатюрный датчик, являющийся важным компонентом катетера «давление-объем», вводится в левый желудочек крысы через правую сонную артерию. Прибор визуализирует изменения сердечной функции во время эксперимента в виде контура давления-объема. Фактический объем желудочка рассчитывается путем изменения проводимости крови путем введения 50 мкл 20% раствора натрия хлорида в левую яремную вену крысы. Фактический объем желудочковой полости крысы вычисляется путем измерения проводимости крови в известном объеме с помощью катетера проводимости «давление-объем». Этот протокол позволяет вести непрерывное наблюдение за воздействием лекарств на сердце и будет способствовать обоснованию использования специальных этнических препаратов при сердечно-сосудистых заболеваниях.
Введение
Сердечно-сосудистые заболевания имеют самый высокий уровень смертности в мире1. Его причинами являются стеноз коронарных артерий (ишемия миокарда), закупорка коронарных артерий (инфаркт миокарда) и ишемически-реперфузионное повреждение2. Поскольку сердце находится в постоянном систолическом и диастолическом цикле, оно является одной из самых энергоемких частей тела. Поэтому, когда коронарные артерии испытывают трудности с поддержанием достаточного количества энергии и кислорода, сердечная функция неизбежно снижается, что оказывает негативное влияние на другие органы 3,4. Сердце является электростанцией в системе кровообращения, и его функция должна оцениваться рационально.
Оценка сердечной функции по соотношению давления и объема желудочков считается комплексным методом5. Изменения давления и объема желудочков в режиме реального времени в течение всего сердечного цикла составляют петлю «давление-объем». Петля «давление-объем желудочков» позволяет количественно проанализировать функцию сердца и резервную емкость с точки зрения различных фаз и энергий желудочка. Нормальный желудочек имеет небольшой конечный систолический объем с хорошей работой и эффективностью 5,6,7.
Катетерная техника «давление-объем» является инвазивным методом определения состояния левого желудочка. Он может быть использован для получения непрерывного контура давления-объема8 в режиме реального времени. Катетеры объемной проводимости под давлением являются мощными инструментами, а для получения воспроизводимых и надежных результатов необходимы надежные процедуры обращения, включая анализ параллельной проводимости миокарда in vivo во время калибровки физиологического раствора и измерение проводимости крови in vitro при калибровке кюветы3.
Феруловая кислота (ФА), фенольная кислота, широко распространена в царствах растений, таких как Avena sativa и Ligusticum chuanxiong hort 9,10. Феруловая кислота обладает фармакологическим действием снижения артериального давления и аритмии. ЖК является биологически активным натуральным продуктом с множеством функций. ФА может противостоять окислительному повреждению, уменьшать воспалительные реакции, ингибировать агрегацию тромбоцитов и предотвращать ишемическую болезнь сердца и атеросклероз11. Тем не менее, большинство исследований феруловой кислоты были сосредоточены на одном аспекте сердца, и редко влияние феруловой кислоты оценивалось в кровеносной системе 12,13,14,15. Здесь мы описываем закрытый подход к анестезии изофлураном в сочетании с кетамином (50 мг/кг) с акцентом на реакцию сердца на раствор феруловой кислоты во время инъекции в яремную вену.
Мы опишем полную процедуру использования инструмента в условиях закрытой грудной клетки, включая приготовление раствора, подготовку датчика, предэкспериментальную подготовку крысы, введение катетера в правую сонную артерию и анализ данных. Продолжительность эксперимента обычно составляет менее 4 ч и определяется различными протоколами экспериментов. В одном эксперименте мы можем получить подробную информацию о сердце, такую как давление в левом желудочке, объем и частота сердечных сокращений.
Протокол
Протокол для животных был рассмотрен и одобрен Комитетом по этике экспериментального благополучия животных Чэндуского университета традиционной китайской медицины (запись No 2023-04). Для настоящего исследования использовали крыс-самцов Sprague Dawley (SD) (280 ± 20 г, в возрасте 8-10 недель). Крысы содержались в камере для животных и могли свободно пить и есть.
1. Приготовление раствора
- Приготовьте 0,9% раствор NaCl, который будет использоваться для поддержания достаточной влажности рабочей зоны.
- Для приготовления 20% гипертонического раствора NaCl растворяют 2 г NaCl в 10 мл дважды дистиллированной воды (ddH2O). Для того, чтобы определить параллельную проводимость миокарда, необходимо изменить проводимость внутрижелудочковой жидкости.
- Приготовьте 1% ферментно-активный раствор порошкообразного моющего средства. Используйте его по завершении эксперимента, чтобы погрузить напорно-объемный электрический катетер в раствор на 1-2 ч.
- Приготовьте раствор ФА, растворив 10 мг феруловой кислоты в 20 мл ddH2O. Процеживают раствор через мембрану 0,22 мкм. Вводят крысе 1 мл/кг раствора феруловой кислоты.
2. Подготовка датчика
- Погрузите датчик давления-объема в 0,9% раствор NaCl при 37 °С примерно на 30-60 мин перед началом эксперимента, что способствует стабильности экспериментальных данных.
- Подключите экспериментальную аппаратуру. Система измерения объемно-давления состоит из катетера «давление-объем», двух блоков управления, блока регистрации и программного обеспечения, работающего на компьютере. Модуль «Контур давления-объема» в программном обеспечении обеспечит эталонную экспериментальную процедуру.
- Нажмите кнопку «Пуск », и программное обеспечение автоматически запишет данные мониторинга с датчика давления-объема.
- Используйте программное обеспечение Miro-Tip Pressure Volume (MPVS) для калибровки давления и проводимости.
3. Предэкспериментальная подготовка крыс
- Вводят крысам кетамин (50 мг/кг) и фентанил (0,25 мг/кг) путем внутримышечной инъекции5.
- Зажмите пальцы ног крыс, чтобы проверить глубину анестезии по отсутствию рефлексов. Эмоции влияют на физиологическое состояние крыс, а боль вызывает изменения в сердечной функции16. Используйте бритвы для мелких животных и кремы для депиляции для удаления волос на местах операции. Используйте йодофор и 75% спирт для протирания кожи для поддержания стерильности.
- Иммобилизуйте полностью обезболиваемых крыс на изотермической нагревательной пластине так, чтобы задняя часть соприкасалась с нагревательной пластиной.
- Введите температурный зонд, покрытый вазелином, в прямую кишку крысы. Поддерживайте температуру тела крысы на уровне 37 °C ± 0,5, регулируя нагревательную пластину.
ПРИМЕЧАНИЕ: Во время эксперимента необходимо поддерживать дыхательные пути свободными.
4. Введение катетера в правую сонную артерию
- Надрезают кожу с правой стороны срединной линии шеи крыс, продольно. Сделайте надрез 4 см и отделите мышечную и соединительную ткань щипцами. Видна сонная артерия, расположенная с правой стороны трахеи. Правая сонная артерия крысы темно-красная, сильно пульсирующая, имеет параллельный ей белый блуждающий нерв.
- Отделите сонную артерию от других тканей и нервов с помощью щипцов. Поместите три хирургических капельницы 5-0 ниже чистой сонной артерии. Капните стерильный 0,9% раствор натрия хлорида на операционную область, чтобы поддерживать увлажнение сонной артерии.
- Разрежьте кожу над левой ключицей и отклейте ткань вокруг яремной вены. Затем поместите хирургическую нить 5-0 под левую яремную вену.
- Используйте артериальные зажимы, чтобы приостановить кровоток проксимально, используя микроножницы, чтобы разрезать участок сосуда, где кровоток остановился. Появление небольшого количества крови в поперечном срезе раны является нормальным явлением. Если кровь выходит из сосуда быстро и прерывисто, поднимите проксимальный операционный катетер и снова наложите артериальный зажим.
- Введите катетер из поперечного среза вдоль сонной артерии глубоко в левый желудочек. Убедитесь, что самое низкое значение систолического давления после входа в левый желудочек близко к 0 мм рт.ст.
- Чтобы получить разумное соотношение давления и объема, слегка отрегулируйте катетер «давление-объем» в камере желудочка. Чтобы предотвратить массивную кровопотерю и изменение положения катетера из-за сердцебиения, перевязайте проксимальный конец операционного катетера.
ПРИМЕЧАНИЕ: Температура тела, уровень анестезии, сигнал давления и сигнал проводимости крысы должны оставаться стабильными во время этого процесса. Дыхательные пути крысы следует держать открытыми.
5. Введение препарата и калибровка проводимости
- Поддерживайте положение катетера для измерения объема давления в камере желудочка, после стабилизации данных перевязайте операционный катетер дистальнее перевязанной яремной вены и медленно вводите до 1 мл/кг раствора феруловой кислоты. Наблюдайте в течение 5-10 минут.
- Введите 50 мкл 20% раствора NaCl из левой яремной вены, чтобы удалить параллельную проводимость, создаваемую миокардом. Объемный диапазон параллельной проводимости составлял примерно 130-280мкл5. Повторите это 3 раза с интервалом в 2 минуты.
- После измерения давления и объема желудочков у крыс возьмите кровь из брюшной аорты крысы с помощью иглы для забора крови. Поместите собранную кровь в пробирку для сбора гепарина натрия и переверните вверх и вниз 2 раза, чтобы предотвратить свертывание крови. Усыпляют подопытных крыс, вводя 120 мг/кг пентобарбитала натрия через левую яремную вену.
- Выполните преобразование измеренной проводимости в фактический объем крови с помощью калибровочных пробирок для крыс. Последовательно поместите кровь, смешанную с гепарином натрия, в отверстия калибровочной пробирки, и катетер определит значения проводимости крови в различных отверстиях и запишет их в модуль контроля давления и объема.
6. Анализ данных
- Добавляя измеренное значение проводимости известного объема крови в указанное место, программное обеспечение автоматически строит кривую и экстраполирует проводимость крови. Используйте по крайней мере три набора значений проводимости крови, чтобы определить проводимость крови испытуемой крысы. Проводимость крови индивидуальна. Для каждой испытуемой крысы выполните эту процедуру индивидуально.
- Гипертоническая калибровка: Добавляя данные, полученные от трех инъекций гипертонического физиологического раствора, в указанное место, программное обеспечение вычисляет параллельные средние значения проводимости и автоматически калибрует экспериментальные данные.
- Используйте области со стабильными значениями артериального давления и проводимости для анализа функции левого желудочка крыс.
- Нажмите « Анализировать », и программное обеспечение автоматически рассчитает различные параметры в зависимости от выбранной области, включая EF (фракции выброса левого желудочка), SW (работа с инсультом), CO (сердечный выброс) и т. д.
Результаты
Каждый тест (n = 3) основывался на введении в левый желудочек катетера проводимости под давлением-объемом. Наблюдаются значительные изменения сигнала, такие как заметное увеличение диапазона давления, когда катетер входит в левый желудочек из сонной артерии (рис. 1). Графический анализ зависимости давления от объема завершается построением графика объема (мкл) по оси Y и давления (мм рт. ст.) по оси X. Давление в левом желудочке у крыс было в пределах 10-105 мм рт.ст., а значения проводимости объема - в пределах 65-115 мкл.
Полный сердечный цикл формируется петлей «давление-объем» против часовой стрелки (рис. 2). Значительные изменения в работе сердца наблюдались у крыс после введения им феруловой кислоты (рис. 3). Давление в левом желудочке у крыс было в пределах 0-85 мм рт.ст., а значения проводимости объема были в пределах 30-100 мкл.
Как показано на рисунке 4, изменения происходят в петле левожелудочкового давления-объема при введении гипертонического физиологического раствора в яремную вену крыс. Благодаря прямому измерению сигналов давления и проводимости в полости желудочка, введение гипертонического физиологического раствора через левую яремную вену может вызвать увеличение значений проводимости. Помехи со стороны миокарда могут быть устранены путем проведения многократных измерений изменений значений проводимости.
Для калибровки кюветы использовали объемную проводимость по давлению (рис. 5). Это необходимо для перевода измеренных значений проводимости в объемные.
Рисунок 1: Различные петли давления-объема в сонной артерии и желудочке, создаваемые катетерами проводимости под давлением-объемом. (А) Существуют значительные различия в давлении и проводимости между артериями и желудочками. (Б) Введение миниатюрного датчика в желудочек может образовать петлю «давление-объем». Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 2: Контур давления-объема. Контур «давление-объем» включает в себя четыре фазы: диастолу, изоволюметрическое сокращение, систолу и изоволюметрическую релаксацию. Область петли «давление-объем» представляет собой работу, создаваемую одним сердечным сокращением. Вычитание конечного систолического объема (ESV) из конечного диастолического объема (EDV) дает желудочковый выход. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 3: Нарушение функции левого желудочка у крыс после введения раствора феруловой кислоты. (А) Нарушена петля давления и объема левого желудочка. (B) Фракция выброса (ФВ) представляет собой процент ударного объема по отношению к конечному диастолическому объему желудочка: изменение фракции выброса левого желудочка с учетом количества сердечных сокращений. (C) Конечный систолический объем левого желудочка изменяется с увеличением числа сердечных сокращений. (D) Константа соотношения конечного диастолического давления и объема левого желудочка изменяется с увеличением частоты сердечных сокращений. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 4: Изменения давления и проводимости в левом желудочке крыс после введения в вену 20% раствора NaCl. (A) Проанализированные данные, в которых проводимость была изменена. (B) Кольцо объема давления смещается вправо из-за повышенной проводимости. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 5: Катетеры для измерения проводимости под давлением и объемом используются для измерения проводимости известного объема кюветы, заполненной кровью крысы. (А) Проводимость различных объемов. (B) Хорошая корреляция проводимости, измеренная катетерами проводимости под давлением и объемом. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этого рисунка.
Обсуждение
Важно принять рациональную стратегию дозирования для различных состояний сердечной функции. Катетерная методика «давление-объем» является наиболее интуитивно понятным способом исследования функции левого желудочка5. Этот метод позволяет изучать влияние лекарств на сердечную функцию в целом. Подробно опишем различные этапы эксперимента. Это даст некоторую возможность для изучения работы сердца.
Метод катетеризации с использованием давления и объемной проводимости является наиболее полным и строгим методом. В одном эксперименте можно получить информацию о 30 показателях, включая абсолютные величины (давление и объем) и относительные величины (ФВ), и даже некоторую информацию о метаболизме препарата.
Температуру тела крыс поддерживали на уровне 37 °С ± 0,5 в течение всей экспериментальной процедуры5. Кровопотеря у крыс должна быть сведена к минимуму во время эксперимента5. Объем крови крысы должен быть отмечен во время эксперимента17.
Катетерная технология «давление-объем» позволяет в режиме реального времени определять состояние желудочков18. Эта технология может быть очень полезна при изучении влияния одного препарата или комбинации лекарств на сердце. Катетер проводимости непосредственно измеряет давление и проводимость левого желудочка. Это тесно связано с температурой тела и степенью анестезии испытуемой крысы. В этом эксперименте после введения раствора феруловой кислоты изменения функции левого желудочка были наглядно продемонстрированы петлей «давление-объем», включая снижение конечного систолического давления и конечного систолического объема (рис. 2А). Фракция выброса левого желудочка у крыс была достоверно увеличена, с пиковым значением 89,87% (рис. 2Б). Конечное систолическое давление левого желудочка у крыс было значительно снижено, с минимальным значением 55,44 мкл. Это согласуется с фармакологическим эффектом феруловой кислоты в снижении артериального давления, о котором сообщалось ранее11.
Некоторые природные соединения, содержащиеся в пищевых и лекарственных растениях, могут способствовать поддержанию здоровья. Феруловая кислота представляет собой фенольное соединение, широко присутствующее в растениях, включая Ligusticum chuanxiong и Angelica sinensis19, которые являются важными активными ингредиентами в различных традиционных китайских лекарствах. Современные исследования показали, что феруловая кислота обладает множественной биологической активностью, включая противовоспалительное, антифибротическоеи антиапоптотическое действие. Необходимо изучить влияние этого легкодоступного натурального продукта из пищи на сердечную функцию в системе кровообращения, хотя исследования показали его положительное влияние на морфологическую структуру сердца12,20.
Плотно-объемный катетер может быть помещен в желудочковую камеру экспериментального животного для получения непосредственно желудочкового давления и проводимости. Калибровка физиологического раствора и калибровка кюветы используются для получения истинного объема желудочков. Этот эксперимент позволяет получить непрерывную петлю «давление-объем», которая будет визуально отражать изменения в функции желудочков. Существует два способа доступа к камере желудочка с помощью катетера для измерения объема под давлением, включая состояние открытой грудной клетки и состояние закрытой грудной клетки. При открытой грудной клетке легче контролировать положение катетера объема давления в полости желудочка. Измерение функции желудочков в условиях закрытой грудной клетки не требует вспомогательного дыхания животного, наносит меньше вреда животному и имеет более высокий процент успеха. Кроме того, в условиях закрытой грудной клетки наблюдают за объемной петлей давления, чтобы определить, находится ли катетер для измерения объема давления в полости желудочка. Если этот катетер сдавливается миокардом, контур объема давления будет показывать аномальный пик.
Сердце является жизненно важным органом, который перекачивает кровь по всему телу. Необходим более рациональный подход к оценке сердечной функции, в том числе до и после нагрузок, а также состояния самого сердца21. Петли «давление-объем» используются для описания изменений давления и объема в камере центрального желудочка в течение всего сердечного цикла в режиме реального времени. Этот протокол описывает полный метод измерения функции левого желудочка с помощью миниатюрных датчиков. Изменение модели микросенсора в протоколе эксперимента позволяет измерять сердечную функцию у различных животных, таких как свиньи, мыши и т.д. 4,8,22. Использование катетеров проводимости «давление-объем» позволяет в режиме реального времени наблюдать за влиянием препаратов на давление и объем левого желудочка, а также за общим влиянием на кровеносную систему испытуемого. Эта методика помогает свести к минимуму потенциальное негативное воздействие лекарств на сердце.
Раскрытие информации
Авторы заявляют, что исследование проводилось в отсутствие каких-либо коммерческих или финансовых отношений, которые могли бы быть истолкованы как потенциальный конфликт интересов.
Благодарности
Эта работа была поддержана крупным научно-исследовательским проектом провинции Сычуань (2022YFS043) и специальным проектом Молодежного фонда традиционной китайской медицины Чэнду (QJJJ2022029).
Материалы
| Имя | Компания | Каталожный номер | Комментарии |
|---|---|---|---|
| 1 мл шприц | Sartorius AG, Германия-Средство | ||
| поддержания температуры для животных | Rayward Life Technology Co., Ltd | 69020 | |
| Dual Bio Amp | Millar, Inc., США | DA-100 | |
| Энзим-активное порошковое моющее средство | Alconox Inc., США | 1104 | |
| Феруловая кислота | Macklin Biochemical Co., Ltd, Шанхай, Китай | F900027 | |
| Катетерные преобразователи Mikro-Tip, SPR-838NR | Millar, Inc., США | SPR-838NR | |
| Millar Miro-Tip Pressure Volume (MPVS) Ultra | Millar, Inc., США | SPR-869 | |
| Электрические машинки для стрижки домашних животных | Jinyun County New Concept Home Supplies Co., Ltd. | - | |
| Power Lab 8 / 35 | Millar, Inc., США | PL3508 | |
| Хлорид натрия, NaCl | Kelong Chemical Reagent, Чэнду, Китай | KX829463 | |
| крем для эпиляции Veet | Shanghai Songqi E-commerce Co., Ltd. |
Ссылки
- Zaman, R., Epelman, S. Resident cardiac macrophages: Heterogeneity and function in health and disease. Immunity. 55 (9), 1549-1563 (2022).
- Schefold, J. C., Filippatos, G., Hasenfuss, G., Anker, S. D., von Haehling, S. Heart failure and kidney dysfunction: epidemiology, mechanisms and management. Nat Rev Nephrol. 12 (10), 610-623 (2016).
- Medert, R., Bacmeister, L., Segin, S., Freichel, M., Camacho Londoño, J. E. Cardiac response to β-adrenergic stimulation determined by pressure-volume loop analysis. J Vis Exp. (171), e62057(2021).
- Hieda, M., Goto, Y. Cardiac mechanoenergetics in patients with acute myocardial infarction: From pressure-volume loop diagram related to cardiac oxygen consumption. Heart Fail Clin. 16 (3), 255-269 (2020).
- Pacher, P., Nagayama, T., Mukhopadhyay, P., Bátkai, S., Kass, D. A. Measurement of cardiac function using pressure-volume conductance catheter technique in mice and rats. Nat Protoc. 3 (9), 1422-1434 (2008).
- Ziegler, T., Laugwitz, K. L., Kupatt, C. Left ventricular pressure volume loop measurements using conductance catheters to assess myocardial function in mice. Methods Mol Biol. 2158, 33-41 (2021).
- Rosch, S., et al. Characteristics of heart failure with preserved ejection fraction across the range of left ventricular ejection fraction. Circulation. 146 (7), 506-518 (2022).
- Meyers, T. A., Townsend, D. Early right ventricular fibrosis and reduction in biventricular cardiac reserve in the dystrophin-deficient mdx heart. Am J Physiol Heart Circ Physiol. 308 (4), H303-H315 (2015).
- Alaerts, G., et al. Exploratory analysis of chromatographic fingerprints to distinguish rhizoma Chuanxiong and rhizoma Ligustici. J Chromatogr A. 1217 (49), 7706-7716 (2010).
- Serreli, G., et al. Ferulic acid derivatives and Avenanthramides modulate endothelial function through maintenance of nitric oxide balance in HUVEC cells. Nutrients. 13 (6), 2026(2021).
- Li, D., et al. Ferulic acid: A review of its pharmacology, pharmacokinetics and derivatives. Life Sci. 284, 119921(2021).
- Monceaux, K., et al. Ferulic acid, Pterostilbene, and Tyrosol protect the heart from ER-stress-induced injury by activating SIRT1-dependent deacetylation of eIF2α. Int J Mol Sci. 23 (12), 6628(2022).
- Liu, Z., et al. N-terminal truncated peroxisome proliferator-activated receptor-γ coactivator-1α alleviates phenylephrine-induced mitochondrial dysfunction and decreases lipid droplet accumulation in neonatal rat cardiomyocytes. Mol Med Rep. 18 (2), 2142-2152 (2018).
- Sun, Y., et al. Shuangxinfang prevents S100A9-induced macrophage/microglial inflammation to improve cardiac function and depression-like behavior in rats after acute myocardial infarction. Front Pharmacol. 13, 832590(2022).
- Panneerselvam, L., et al. Ferulic acid attenuates arsenic-induced cardiotoxicity in rats. Biotechnol Appl Biochem. 67 (2), 186-195 (2020).
- Hsueh, B., et al. Cardiogenic control of affective behavioural state. Nature. 615 (7951), 292-299 (2023).
- Townsend, D. Measuring pressure volume loops in the mouse. J Vis Exp. (111), e53810(2016).
- Bastos, M. B., et al. Invasive left ventricle pressure-volume analysis: overview and practical clinical implications. Eur Heart J. 41 (12), 1286-1297 (2020).
- Wang, L. Y., et al. Effects of ferulic acid on antioxidant activity in Angelicae Sinensis Radix, Chuanxiong Rhizoma, and their combination. Chin J Nat Med. 13 (6), 401-408 (2015).
- Liu, Z., et al. Ferulic acid increases intestinal Lactobacillus and improves cardiac function in TAC mice. Biomed Pharmacother. 120, 109482(2019).
- Baan, J., et al. Continuous measurement of left ventricular volume in animals and humans by conductance catheter. Circulation. 70 (5), 812-823 (1984).
- Dam Lyhne, M., et al. Effects of mechanical ventilation versus apnea on bi-ventricular pressure-volume loop recording. Physiol Res. 71 (1), 103-111 (2022).
Перепечатки и разрешения
Теги
