В этом протоколе описана процедура индуцирования воспаления акне на коже крыс с помощью олеиновой кислоты и Cutibacterium acnes.
Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.
Методическая статья
Крысиная модель сложного акне
* These authors contributed equally
В этой статье
Краткое содержание
Аннотация
Вульгарные угри — это распространенное хроническое заболевание кожи, характеризующееся наличием комедонов, папул и пустул на лице, шее и груди. Чтобы смоделировать воспаление вульгарных угрей, в этом протоколе подробно описан подход к созданию составной модели акне у грызунов путем индуцирования воспаления акне в ушах крыс с использованием олеиновой кислоты и Cutibacterium acnes (C. acnes). Крысы были случайным образом разделены на четыре группы: нормальная контрольная группа (НК), уши, обработанные олеиновой кислотой группы (ОА), уши, обработанные группой C. acnes (C. acnes), уши, обработанные олеиновой кислотой, и C. acnes (OA + C. acnes). Чтобы имитировать чрезмерную выработку кожного сала, олеиновую кислоту намазывали на уши крыс в группах OA и OA + C. acnes в течение 25 дней.
С 21 по 25 день суспензия C. acnes вводилась внутрикожно в уши крыс в группах C. acnes и OA + C. acnes для усугубления воспаления акне. Толщина уха измерялась еженедельно в качестве показателя тяжести воспаления. Было проведено общее наблюдение, окрашивание гематоксилином и эозином, а также иммуногистохимия (ИГХ), и результаты показали, что уши группы ОА и группы ОА + С. acnes были утолщены и уплотнены, что сопровождалось эритемой и наличием комедонов. Кроме того, папулы наблюдались в группах C. acnes и OA + C. acnes . В гистопатологии выявлена гиперкератинизация и расширенный инфундибулум волосяных фолликулов в группах ОА и ОА + С. acnes . Инфильтрация воспалительных клеток и абсцессов обнаружена в дерме групп C. acnes и OA + C. acnes . Результаты ИГХ подтвердили повышенный уровень фактора некроза опухоли (ФНО)-α в дерме групп C. acnes и OA + C. acnes . Все вышеперечисленные результаты в совокупности свидетельствовали об успешном создании составной модели грызунов с прыщами.
Введение
Вульгарные угри являются распространенным хроническим заболеванием кожи, характеризующимся наличием комедонов, папул и пустул на лице, шее и груди, которые в тяжелых случаях могут прогрессировать до узелков, кист и постоянных рубцов1. Эпидемиологические исследования показывают, что акне поражает 9,4% населения мира, в то время как его симптомы создают серьезные физические и психосоциальные проблемы 2,3.
Патогенез акне является многофакторным, включающим четыре критических процесса: избыточную выработку кожного сала, образование комедонов, колонизацию фолликулов микробиотой кожи и высвобождение медиаторов воспаления вокруг пилосебацейного звена 4,5. Повышенная секреция кожного сала, приводящая к накоплению избытка ненасыщенных свободных жирных кислот (UFFA), способствует аномальному размножению микробиоты кожи, одной из которых является Cutibacterium acnes, как показано в геномных исследованиях6. Между тем, микробиота кожи разлагает кожное сало и повышает концентрацию UFFA, что приводит к возникновению порочного круга7. Кроме того, избыток UFFA вызывает гиперкератинизацию в волосяных фолликулах, что в свою очередь провоцирует появление прыщей8. Микробиота кожи и повышенное выделение кожного сала активируют толл-подобные рецепторы (TLR) для выработки множественных провоспалительных цитокинов, таких как интерлейкин (IL)-1 и TNF-α 9,10. Этот каскад воспаления в сочетании с повышенным выделением кожного сала и микробным разрастанием завершается выраженным гиперкератозом волосяного фолликула и возникновением угревой сыпи11.
Быстрое развитие в области исследований акне и связанных с этим клинических требований привело к созданию серии животных моделей воспаления акне на ухе крысы, спине крыс или мышей, а также на ухе кролика 12,13,14,15. Методы включают внутрикожное введение С. Акне, нанесение масел на кожу для имитации аномальной секреции сальных желез и гиперкератинизации, или комбинация того и другого для ускорения воспаления кожи с образованием прыщей 16,17,18,19. Тем не менее, использование и дозировка химических и биологических агентов различаются в предыдущих исследованиях, что может сбить с толку исследователей, намеревающихся создать подходящую модель акне. Это исследование было направлено на создание простого в использовании и эффективного метода формирования сложной модели грызунов-угревой сыпи и предоставление модельного справочника для исследователей, изучающих вульгарные угри.
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Протокол
Этот протокол получил этическое одобрение Пекинского университета китайской медицины (No 2023033103-1183). Двенадцать самцов крыс Sprague-Dawley (вес 208 г ± 5 г) были включены в этот протокол и разделены на четыре группы: группа NC (n = 3), группа OA (n = 3), группа C. acnes (n = 3) и группа OA + C. acnes (n = 3).
1. Разработка модели акне
- Измерьте и запишите толщину ушей крысы с помощью электронного штангенциркуля (см. Таблицу материалов) перед моделированием.
- Поместите наружную губку электронного штангенциркуля в середину внешнего края уха и протяните ее в ушной канал. Запишите толщину 2/3 пункта и толщину 1/2 пункта вдоль линии. Измерьте каждую точку 3x и рассчитайте средние значения толщины двух точек, которые будут считаться толщиной уха.
- Наклоните голову крысы набок, сделайте ухо лицом вверх и равномерно нанесите 50 мл олеиновой кислоты (см. Таблицу материалов) на вентральную и тыльную стороны уха равномерно, один раз в день, в течение 25 дней.
- С 21-го по 25-й день, ежедневно перед применением олеиновой кислоты, анестезируют крыс с использованием 4% изофлурана, а затем вводят 50 мкл 1 × 107 КОЕ суспензии C. acnes (см. Таблицу материалов) внутрикожно в вентральную поверхность уха с помощью шприца объемом 1 мл, оснащенного иглой 34 G или 36 G (см. Таблицу материалов).
ПРИМЕЧАНИЕ: Следите за тем, чтобы не попасть в кровеносные сосуды в ухе при внутрикожном введении. Требуется микрошприц с иглой 34 G или 36 G (см. Таблицу материалов). Чтобы обеспечить правильное внутрикожное введение, игла должна быть проколота под углом от 10 до 15 градусов, глубиной примерно 1 мм. - На 25-й день измерьте и запишите толщину ушей, как описано в шаге 1.1.
Примечание: Группу ОА смазывали только олеиновой кислотой, как описано на шаге 1.2, и вводили физиологический раствор с 21-го по 25-й день. Группа C. acnes вводилась только внутрикожно суспензией C. acnes , как описано в шаге 1.3. Группу OA + C. acnes обрабатывали олеиновой кислотой и суспензией C. acnes , как описано в шагах 1.2 и 1.3.
2. Забор и анализ тканей
- На 26-й день, после того как крысы будут гуманно усыплены с использованием одобренного в учреждении метода, сверлить фиксированный размер на двусторонних ушах с помощью кольцевой дрели диаметром 8 мм.
- Погрузить ткани уха в 4% параформальдегид на 24 ч с последующим заделыванием парафина и разрезанием на ломтики толщиной 5 мкм для окрашивания гематоксилином и эозином (HE)20. Осмотрите срезы под световым микроскопом и запишите патологические изменения для последующей оценки патологоанатомом. Присвойте баллы патологическим изменениям в соответствии с таблицей 1 (см. также рисунок 1).
- Депарафинизируйте, регидратируйте и нагревайте срезы для извлечения антигена. Инактивировать эндогенные пероксидазы путем инкубации с 0,3%Н2О2в метаноле в течение 15 мин при комнатной температуре.
- Промойте срезы фосфатно-соевым буфером (PBS), а затем инкубируйте их с 3% BSA в течение 30 минут при комнатной температуре.
- Инкубируйте срезы с моноклональным антителом TNF-α (разведение 1:800) (см. Таблицу материалов) при 4 °C в течение ночи.
- Срезы снова промыть PBS и инкубировать с пероксидазой-конъюгированным вторичным антителом хрена (см. Таблицу материалов) в течение 50 мин.
- После очередной промывки PBS нанесите на предметные стекла смесь 3,3'-диаминобензидина (DAB) и следите за процессом окрашивания под микроскопом, останавливая реакцию с PBS при достижении нужной интенсивности.
- Запачкайте секции гематоксилином Мейера в течение 1 минуты, промойте их проточной водой, обезвожьте и установите секции. Осмотрите срезы под микроскопом и запишите патологические изменения для последующей оценки патологоанатомом.
3. Статистический анализ
- Выполнение статистического анализа.
- Представление данных в виде среднего ± стандартного отклонения. Получите доступ к нормальности всех данных с помощью теста Шапро-Вилке. Если оно следует нормальному распределению, используйте однофакторный ANOVA для оценки существенных различий. Для ненормально распределенных данных примените тест Краскела-Уоллиса с последующим множественным сравнением Данна. p-значение меньше 0,05 считается статистически значимым.
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Результаты
Толщина и внешний вид кожи
С 7-го по 21-й день уши в группе ОА и в группе ОА + C. acnes были значительно толще, чем в группах NC и C. acnes . На 25-й день уши в группе ОА, группе C. acnes и группе OA + C. acnes были значительно толще, чем в группе NC (p < 0,05). Средняя толщина ушей во время эксперимента показана на рисунке 2 и в таблице 2.
С 7 по 25 день уши в группе ОА и группе ...
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Обсуждение
Поскольку методология и критерии оценки модели акне не были ясны, этот протокол был направлен на то, чтобы предоставить справочный материал для исследователей, изучающих акне. Из-за небольшого размера мышиного уха и помех, вызванных отрастающими волосами на спине, использованием крема для депиляции и бритвы, ухо крысы может быть лучшей альтернативой для создания модели прыщей у грызунов. Мы пытались создать модель прыщей на коже спины крыс, но эффект был не таким хорошим, как тот, которы...
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Раскрытие информации
Все авторы заявляют, что у них нет конфликта интересов.
Благодарности
Это исследование было поддержано Национальным фондом естественных наук Китая (No 81974572 и No 82274523) и Пекинским университетом китайской медицины (No 202310026002).
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Материалы
| Имя | Компания | Каталожный номер | Комментарии |
|---|---|---|---|
| Анаэроиндикатор | Mitsubishi, Япония | C-22 | |
| AnaeroPack | Mitsubishi, Япония | C-11, C-41 | |
| Columbia кровяная агаровая пластина | BeNa Cuture Collection, Китай | BNCC330605 | |
| Инкубатор постоянной температуры | SHANGCHENG, Китай | 303-0 | |
| Ватный тампон | HYNAUT, Китай | _ | |
| Cutibacterium acnes | BeNa Cuture Collection, Китай | BNCC330605 | |
| Dako REAL EnVision Detection System, Peroxidaza/DAB+, кролик/мышь | DAKO, Дания | K5007 | |
| одноразовая стерильная игла для инъекций | Zhejiang Oujian Medical Apparatus, Китай | _ | |
| Электронные весы | JINXUAN, Китай | A017 | |
| Электронный штангенциркуль | Deli, Китай | DL90150 | |
| Олеиновая кислота (Аналитический реагент, AR) | Fangzheng, Китай_ | ||
| Инъекция хлорида натрия | CR Double CRANE, Китай | Y2212241 | |
| SPSS Statistics | IBM, США | 26.0 | |
| стерильные шприцы для подкожных инъекций | Shandong weigao group медицинский полимер, Китай | _ | |
| TNF Альфа Моноклональное антитело | Proteintech Group,int, США | 60291-1-lg |
Ссылки
- Cooper, A. J., Harris, V. R. Modern management of acne. The Medical Journal of Australia. 206 (1), 41-45 (2017).
- Vos, T., et al. Years lived with disability (YLDs) for 1160 sequelae of 289 diseases and injuries 1990-2010: a systematic analysis for the Global Burden of Disease Study 2010. Lancet. 380 (9859), London, England. 2163-2196 (2012).
- Layton, A. M., Thiboutot, D., Tan, J. Reviewing the global burden of acne: how could we improve care to reduce the burden. The British Journal of Dermatology. 184 (2), 219-225 (2021).
- Hazarika, N. Acne vulgaris: new evidence in pathogenesis and future modalities of treatment. Journal of Dermatological Treatment. 32 (3), 277-285 (2021).
- Das, S., Reynolds, R. V. Recent advances in acne pathogenesis: implications for therapy. American Journal of Clinical Dermatology. 15 (6), 479-488 (2014).
- Dréno, B., et al. Cutibacterium acnes (Propionibacterium acnes) and acne vulgaris: a brief look at the latest updates. Journal of the European Academy of Dermatology and Venereology: JEADV. 32, Suppl 2 5-14 (2018).
- Marples, R. R., Downing, D. T., Kligman, A. M. Control of free fatty acids in human surface lipids by Corynebacterium acnes. The Journal of Investigative Dermatology. 56 (2), 127-131 (1971).
- Katsuta, Y., Iida, T., Hasegawa, K., Inomata, S., Denda, M. Function of oleic acid on epidermal barrier and calcium influx into keratinocytes is associated with N-methyl D-aspartate-type glutamate receptors. The British Journal of Dermatology. 160 (1), 69-74 (2009).
- Kurokawa, I., et al. New developments in our understanding of acne pathogenesis and treatment. Experimental Dermatology. 18 (10), 821-832 (2009).
- Clayton, R. W., et al. Homeostasis of the sebaceous gland and mechanisms of acne pathogenesis. The British Journal of Dermatology. 181 (4), 677-690 (2019).
- Cong, T. X., et al. From pathogenesis of acne vulgaris to anti-acne agents. Archives of dermatological research. 311 (5), 337-349 (2019).
- Ji, J., et al. Analgesic and anti-inflammatory effects and mechanism of action of borneol on photodynamic therapy of acne. Environmental Toxicology and Pharmacology. 75, 103329(2020).
- Ou-Yang, X. L., et al. Nontargeted metabolomics to characterize the effects of isotretinoin on skin metabolism in rabbit with acne. Frontiers in Pharmacology. 13, 963472(2022).
- Zhu, Z., et al. Skin microbiome reconstruction and lipid metabolism profile alteration reveal the treatment mechanism of Cryptotanshinone in the acne rat. Phytomedicine. 101, 154101(2022).
- Jang, Y. H., et al. HR-1 mice: A new inflammatory acne mouse model. Annals of Dermatology. 27 (3), 257-264 (2015).
- De Young, L. M., Young, J. M., Ballaron, S. J., Spires, D. A., Puhvel, S. M. Intradermal injection of Propionibacterium acnes: a model of inflammation relevant to acne. The Journal of Investigative Dermatology. 83 (5), 394-398 (1984).
- Chen, T., et al. A skin lipidomics study reveals the therapeutic effects of Tanshinones in a rat model of acne. Frontiers in Pharmacology. 12, 675659(2021).
- Cao, J., Xu, M., Zhu, L., Xiao, S. Viaminate ameliorates Propionibacterium acnes-induced acne via inhibition of the TLR2/NF-κB and MAPK pathways in rats. Naunyn-Schmiedeberg's Archives of Pharmacology. 396 (7), 1487-1500 (2023).
- Kolar, S. L., et al. Propionibacterium acnes-induced immunopathology correlates with health and disease association. JCI insight. 4 (5), e124687(2019).
- Zhong, C., et al. Inhibition of protein glycosylation is a novel pro-angiogenic strategy that acts via activation of stress pathways. Nature Communications. 11 (1), 6330(2020).
- O'Neill, A. M., Gallo, R. L. Host-microbiome interactions and recent progress into understanding the biology of acne vulgaris. Microbiome. 6 (1), 177(2018).
- Moradi Tuchayi, S., et al. Acne vulgaris. Nature Reviews. Disease Primers. 1, 15029(2015).
- American Academy of Dermatology. American Academy of Dermatology invitational symposium on comedogenicity. Journal of the American Academy of Dermatology. 20 (2), Pt 1 272-277 (1989).
- Katsambas, A. D., Cunliffe, W. J., Zoubolis, C. C. Clinical aspects of acne vulgaris. Pathogenesis and treatment of acne and rosacea. Zouboulis, C. C., Katsambas, A. D., Kligman, A. M. , Springer. Berlin, Heidelberg. 213-221 (2014).
- Williams, H. C., Dellavalle, R. P., Garner, S. Acne vulgaris. Lancet. 379 (9813), London, England. 361-372 (2012).
- Rocha, M. A., Bagatin, E. Skin barrier and microbiome in acne. Archives of Dermatological Research. 310 (3), 181-185 (2018).
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Перепечатки и разрешения
