Экспериментальное исследование зимовки колорадского жука в естественных условиях

Колорадский жук Leptinotarsa decemlineata Say (CPB) является важным вредителем пасленовых растений, преимущественно картофеля Solanum tuberosum L. Ареал этого вида составляет более 16 млн.^км2 и постоянно^{расширяется1}. У ЦПБ факультативная зимняя диапауза, а зимняя спячка обязательна в умеренном поясе. Диапауза индуцируется фотопериодом короткого дня и модулируется температурой¹. Зимуют эти жуки во взрослой стадии, закапываясь в почву. С увеличением широт продолжительность периода спячки увеличивается. В умеренном поясе, особенно на северных территориях ареала, зимовка длится до 9 месяцев: с августа-сентября по май-июнь (Носков и др., личные наблюдения). В этот период КПБ, как и любое другое насекомое умеренного пояса, подвергается воздействию неблагоприятных зимних условий и должен повысить свою холодостойкость. В то же время контакт жуков с почвой повышает риск заражения различными условно-патогенными микроорганизмами². Поэтому этим жукам необходимо поддерживать определенный уровень активности иммунной системы во время зимней спячки, что также является энергетически затратным. Тем не менее, даже если насекомое переживет инфекцию, болезнь может снизить его морозостойкость³. Следует отметить, что низкая температура – не единственная причина зимней смертности ЦПБ. Немаловажную роль играет и недостаток кислорода, а при некоторых условиях он может быть основным фактором зимней смертности ^4,5.

Известно, что естественная зимняя смертность ЦПБ может быть очень высокой, достигая 100% на глинистых суглинистых почвах⁶. Таким образом, перезимовка является одним из самых ответственных периодов в жизненном цикле ЦПБ. Тем не менее, данные о физиологии, активности иммунной системы, выживаемости и других параметрах спячки КПБ в естественных условиях все еще ограничены. Имеются исследования дифференциальной экспрессии генов и различных физиологических параметров у взрослых с СЛБ в период диапаузы и в ответ на холодовой шок 7,8,9,10,11,12; Тем не менее, эти анализы в основном проводились путем индукции диапаузы или холодового стресса в лабораторных условиях без естественных колебаний температуры, влажности и нативной патогенной нагрузки. Тем не менее, исследования физиологии этих жуков, собранных при выкапывании из почвы в естественных условиях, являются важными. В 1970-1980-е гг. активно изучались различные аспекты зимовки ЦПБ в естественных условиях 13,14,15,16,17,18. С другой стороны, эти исследования не предполагали выемки КПБ из почвы в зимний период. Кроме того, подробно не приведена методика контролируемой спячки КПБ и описание клеток. Таким образом, необходимо изучение физиологии зимовки КПБ в естественных условиях¹⁹.

Целью данного исследования являлась разработка и апробация метода контролируемой спячки взрослых особей КПБ в естественных условиях. Предложенный метод позволяет получить желаемое количество особей КПБ для микробиологических, иммунологических и других исследований в период зимней спячки в полевых условиях континентального климата. Этот метод может быть адаптирован и применен к другим видам насекомых, зимующих в почве под снегом.

1. Описание клеток для зимней спячки

ПРИМЕЧАНИЕ: В зависимости от целей эксперимента количество клеток варьируется. Используйте не менее трех клеток на одну дату отбора проб. Чтобы оценить количество жуков, которые всплывут, подготовьте не менее трех дополнительных клеток, которые не будут извлечены из почвы до весны.

1. Используйте клетки из жесткого деревянного каркаса размером 25 × 25 × 40 см (Д × Ш × В).
2. Чтобы соорудить каркас для клетки, используйте деревянные рейки толщиной не менее 2 см и шириной 4 см.
3. Накройте внутреннюю часть клетки сеткой из нержавеющей стали, имеющей размер отверстий не более 5 мм × 3 мм. Используйте степлер по дереву, чтобы закрепить сетку.
4. Закрепите сетку из нержавеющей стали с внешней стороны дна степлером.
5. Выстелите внутреннюю часть клетки черным синтетическим геотекстилем плотностью 60 г/^м2.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Геотекстиль служит дополнительным барьером для предотвращения побега жуков. Не используйте его в экспериментах, связанных с активно движущимися энтомопатогенами и паразитоидами.
6. Плотно прикрепите к верхней части клетки трубку из синтетической полупрозрачной дышащей ткани высотой примерно 60 см.
7. Скрестите и закрепите две прочные веревки на дне клетки, чтобы при необходимости вытащить ее из почвы.

2. Установка клеток

1. Выкопайте яму глубиной 40 см в почве и поместите внутрь клетку.
2. На лунку постелите сухую траву или сено.
3. Поместите клетку внутрь так, чтобы сено или сухая трава оказались между стенками клетки и почвой.
4. Засыпьте клетки грунтом с того же картофельного поля, где собраны насекомые.
5. Установите водонепроницаемые регистраторы данных температуры и влажности в клетках на необходимой глубине.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Можно использовать регистраторы данных любого производителя, которые должны работать при низких температурах.
6. Сажайте рассаду картофеля в каждую клетку за 3-4 недели до появления жуков и умеренно поливайте.
7. Закрепите трубку из синтетической ткани вертикально к палке из любого материала, установленной с внешней стороны клетки.

3. Выращивание насекомых перед зимовкой

1. Вручную собирайте взрослых жуков на картофельных полях, свободных от пестицидов, ближе к концу вегетации картофеля.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Взрослые жуки существенно отличаются от личинок и характеризуются полосатыми надкрыльями, тогда как личинки красные.
2. Собранных жуков держать в пластиковых ведрах объемом 15-20 л (максимум 200 особей в ведре) с картофельной ботвой для кормления насекомых перед помещением в клетки.
3. Накройте ведра дышащей тканью.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Не держите насекомых в ведрах более 12 часов. Используйте достаточно крупную картофельную ботву, чтобы предотвратить скопление жуков на дне ведер.
4. На картофельные растения, покрытые синтетической тканевой сеткой, размещают не более 200 особей CPB.
5. Когда картофельная ботва будет съедена, добавьте свежую, помещенную в пластиковую банку с водой, и после этого ежедневно меняйте картофельную ботву.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Чтобы зафиксировать стебли в банке, используйте вату и парапленку. Тщательно проверяйте старые стебли на наличие жуков при их удалении.
6. Как только все жуки зарылись в почву на зимовку, отвяжите трубку из синтетической ткани от палки и уложите ткань вниз.

4. Сбор насекомых в зимний период

1. Убирайте снег над поверхностью клетки.
2. Разрыхлите клетку с каждой стороны сильной лопатой.
3. Вытащите клетку из почвы с помощью веревок.
4. Принесите клетку в лабораторию.
   ПРИМЕЧАНИЕ: В зависимости от целей эксперимента, зимующие жуки, возможно, должны быть неактивны до проведения анализа. При этом температура в лаборатории при изоляции жуков от почвы должна быть ~2-5 °С.
5. Вынимайте грунт из ящика небольшими порциями, аккуратно разбивайте крупные куски почвы и изолируйте жуков с помощью пинцета.
6. Отделите живых жуков от трупов. Живые здоровые жуки создают вокруг себя плотную почву, образуя воздушную полость (так называемую колыбель), и поэтому легко отделяются от почвы. Жуки, убитые грибами, мумифицируются или имеют видимый мицелий на поверхности. Бактерионно разлагающиеся насекомые имеют темный цвет.
7. Просейте почву через сито, чтобы убедиться, что все жуки изолированы и не повреждены.
8. Трупы с симптомами грибковой инфекции или бактериального разложения помещают в индивидуальную стерильную центрифужную пробирку объемом 15 мл для последующей идентификации.
9. Хранят живых жуков в холодильнике при температуре 0-2 °С до анализа в закрыто-вентилируемой таре, содержащей влажный ватный тампон.

5. Подготовка образцов органов и тканей

1. Для сбора гемолимфы делают прокол в боковой части живота под надкрыльями с помощью инсулиновой иглы.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Во время зимовки количество гемолимфы значительно уменьшается, что затрудняет сбор этой жидкости.
2. Чтобы изолировать кишечник, отрежьте головную капсулу, выдавите все содержимое в чашку Петри с фосфатным буфером, отделите кишечник и очистите его от жира и мальпигиевых сосудов.
3. Отделите нужный отдел кишечника, например переднюю, среднюю или заднюю кишку.
4. Чтобы изолировать жировое тело, отделите его от других тканей после выделения кишечника.
   Примечание: Изолированные ткани могут быть использованы для измерения активности антиоксидантных и детоксикационных ферментов (пример: дополнительный рисунок 1), анализа регуляции генов иммунного сигнального пути (пример: дополнительный рисунок 2) или метабаркодирования содержимого кишечника насекомых и т. д.

6. Выделение микроорганизмов из трупов

1. Чтобы изолировать энтомопатогенные грибы от трупов, мумифицированных насекомых поместили в стерильную камеру влажности.
2. Используйте воздушные конидии (при наличии) или склероции из внутреннего содержимого жуков для покрытия на декстрозном агаре Сабуро с 0,4% молочной кислотой.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Используйте жуков с мицелием и конидиями для покрытия сразу (не помещая их во влажные камеры).
3. Выделите бактерии из трупов с симптомами бактериального разложения.
4. У жука отрезают голову, выдавливают внутреннее содержимое и собирают в пробирки для последующего нанесения на среды для бактерий (агар Лурии-Бертани, эндоагар и желчный эскулиновый агар).
   ПРИМЕЧАНИЕ: Используйте микроскопию и молекулярные методы для определения родов и видов патогенов. При необходимости может быть проведен анализ на наличие других паразитов.

Приведенные ниже результаты по зимующим КПБ показывают температуру почвы, выживаемость и инфекции.

Динамика температуры почвы.
Отрицательные температуры в садках на глубине 30 см регистрировались с конца ноября до начала апреля (рис. 1). Средняя температура за этот период составила минус 3,3 ± 0,1 °С (средняя ± стандартной ошибки). Самая низкая зарегистрированная температура составила минус 7,9 °C в середине февраля.

Выживаемость зимующих ЦПБ.
Смертность насекомых наблюдалась во время зимней спячки и достигала максимума весной перед выходом на поверхность. Первоначальная численность жуков составляла 2000 особей, из которых к концу мая выжило 1470 особей. Выживаемость жуков во время зимней спячки составила 61% (рис. 2).

Инфекции у зимующих КПБ.
Анализ 530 мертвых жуков показал, что в период спячки у 53% из них наблюдались симптомы бактериального разложения, а у 25% — симптомы грибковых инфекций (рис. 3). Среди выделенных культур энтомопатогенных грибов доминировала боверия (45 изолятов). Metarhizium, Cordyceps (=Isaria) и Lecanicillium встречались гораздо реже (по два изолята). Среди бактерий, выделенных из трупов с симптомами бактериального разложения (n = 30), были идентифицированы виды, принадлежащие к родам Bacillus, Sphingobacterium, Peribacillus, Pseudomonas, Serratia, Rahnella и Glutamicibacter (дополнительная табл. 1).

Рисунок 1: Динамика температуры почвы. Динамика температуры почвы, измеренная водонепроницаемым регистратором данных температуры, установленным на глубине 30 см. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этого рисунка.

Рисунок 2: Выживаемость зимующих колорадских жуков в разные периоды спячки. Клетки выкапывали, а выживших и мертвых жуков подсчитывали в ноябре, январе, апреле и мае. Столбиками обозначено количество выживших жуков. Усы указывают на стандартную ошибку. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этого рисунка.

Рисунок 3: Инфекции у зимующих трупов колорадского жука. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Дополнительные материалы: Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить следующие дополнительные файлы.

Дополнительный рисунок 1. Активность неспецифических эстераз в средней кишке ЦПБ в период спячки. Усы обозначают стандартную ошибку. Разные буквы указывают на существенные различия между временными точками (критерий Данна, P < 0,05).

Дополнительный рисунок 2: Изменения экспрессии транскрипционного фактора NFkB (путь IMD) в кишечнике и жировом теле CPB во время спячки. Данные представлены в виде изменений свертки относительно момента времени августа. В качестве референсных генов использовали Rp4, Rp18 и Arf19 . Усы показывают стандартную ошибку.

Дополнительная таблица 1: Предполагаемая идентификация последовательностей генов 16S рРНК (~800.н.) бактерий, выделенных из мертвого CPB во время спячки.

Авторы заявляют об отсутствии конкурирующих интересов.