Здесь мы представляем метод изучения зимней спячки колорадского жука в естественных условиях умеренного пояса, а также методику сбора жуков в зимний период. Этот метод позволяет получить нужное количество зимующих особей для различных анализов на любой стадии зимовки.
Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.
Методическая статья
Экспериментальное исследование зимовки колорадского жука в естественных условиях
В этой статье
Краткое содержание
Аннотация
Одним из основных вредителей картофеля Solanum tuberosum L. в умеренном поясе является насекомое колорадский жук (CPB). Большинство исследований иммунитета и заболеваний КПБ проводятся во время активных фаз кормления. Тем не менее, исследований стадий покоя меньше, хотя большую часть своего жизненного цикла эти жуки проводят в состоянии зимней диапаузы (спячки). В данной работе был разработан и апробирован метод исследования зимней спячки CPB в естественных условиях, дающий возможность собирать достаточное количество особей в зимний период. В данной статье была проведена оценка выживаемости при СЛБ, а также выявлены инфекционные агенты на разных стадиях спячки. Смертность КПБ увеличивалась во время зимней спячки, достигая максимума в апреле-мае. Из мертвых насекомых выделяли энтомопатогенные грибы (Beauveria, Isaria, Lecanicillium) и бактерии Bacillus, Sphingobacterium, Peribacillus, Pseudomonas и Serratia . Выживаемость жуков за весь период зимней спячки составила 61%. Замерзших или высохших жуков обнаружено не было, что свидетельствует об успешности представленного способа.
Введение
Колорадский жук Leptinotarsa decemlineata Say (CPB) является важным вредителем пасленовых растений, преимущественно картофеля Solanum tuberosum L. Ареал этого вида составляет более 16 млн.км2 и постояннорасширяется1. У ЦПБ факультативная зимняя диапауза, а зимняя спячка обязательна в умеренном поясе. Диапауза индуцируется фотопериодом короткого дня и модулируется температурой1. Зимуют эти жуки во взрослой стадии, закапываясь в почву. С увеличением широт продолжительность периода спячки увеличивается. В умеренном поясе, особенно на северных территориях ареала, зимовка длится до 9 месяцев: с августа-сентября по май-июнь (Носков и др., личные наблюдения). В этот период КПБ, как и любое другое насекомое умеренного пояса, подвергается воздействию неблагоприятных зимних условий и должен повысить свою холодостойкость. В то же время контакт жуков с почвой повышает риск заражения различными условно-патогенными микроорганизмами2. Поэтому этим жукам необходимо поддерживать определенный уровень активности иммунной системы во время зимней спячки, что также является энергетически затратным. Тем не менее, даже если насекомое переживет инфекцию, болезнь может снизить его морозостойкость3. Следует отметить, что низкая температура – не единственная причина зимней смертности ЦПБ. Немаловажную роль играет и недостаток кислорода, а при некоторых условиях он может быть основным фактором зимней смертности 4,5.
Известно, что естественная зимняя смертность ЦПБ может быть очень высокой, достигая 100% на глинистых суглинистых почвах6. Таким образом, перезимовка является одним из самых ответственных периодов в жизненном цикле ЦПБ. Тем не менее, данные о физиологии, активности иммунной системы, выживаемости и других параметрах спячки КПБ в естественных условиях все еще ограничены. Имеются исследования дифференциальной экспрессии генов и различных физиологических параметров у взрослых с СЛБ в период диапаузы и в ответ на холодовой шок 7,8,9,10,11,12; Тем не менее, эти анализы в основном проводились путем индукции диапаузы или холодового стресса в лабораторных условиях без естественных колебаний температуры, влажности и нативной патогенной нагрузки. Тем не менее, исследования физиологии этих жуков, собранных при выкапывании из почвы в естественных условиях, являются важными. В 1970-1980-е гг. активно изучались различные аспекты зимовки ЦПБ в естественных условиях 13,14,15,16,17,18. С другой стороны, эти исследования не предполагали выемки КПБ из почвы в зимний период. Кроме того, подробно не приведена методика контролируемой спячки КПБ и описание клеток. Таким образом, необходимо изучение физиологии зимовки КПБ в естественных условиях19.
Целью данного исследования являлась разработка и апробация метода контролируемой спячки взрослых особей КПБ в естественных условиях. Предложенный метод позволяет получить желаемое количество особей КПБ для микробиологических, иммунологических и других исследований в период зимней спячки в полевых условиях континентального климата. Этот метод может быть адаптирован и применен к другим видам насекомых, зимующих в почве под снегом.
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Протокол
1. Описание клеток для зимней спячки
ПРИМЕЧАНИЕ: В зависимости от целей эксперимента количество клеток варьируется. Используйте не менее трех клеток на одну дату отбора проб. Чтобы оценить количество жуков, которые всплывут, подготовьте не менее трех дополнительных клеток, которые не будут извлечены из почвы до весны.
- Используйте клетки из жесткого деревянного каркаса размером 25 × 25 × 40 см (Д × Ш × В).
- Чтобы соорудить каркас для клетки, используйте деревянные рейки толщиной не менее 2 см и шириной 4 см.
- Накройте внутреннюю часть клетки сеткой из нержавеющей стали, имеющей размер отверстий не более 5 мм × 3 мм. Используйте степлер по дереву, чтобы закрепить сетку.
- Закрепите сетку из нержавеющей стали с внешней стороны дна степлером.
- Выстелите внутреннюю часть клетки черным синтетическим геотекстилем плотностью 60 г/м2.
ПРИМЕЧАНИЕ: Геотекстиль служит дополнительным барьером для предотвращения побега жуков. Не используйте его в экспериментах, связанных с активно движущимися энтомопатогенами и паразитоидами. - Плотно прикрепите к верхней части клетки трубку из синтетической полупрозрачной дышащей ткани высотой примерно 60 см.
- Скрестите и закрепите две прочные веревки на дне клетки, чтобы при необходимости вытащить ее из почвы.
2. Установка клеток
- Выкопайте яму глубиной 40 см в почве и поместите внутрь клетку.
- На лунку постелите сухую траву или сено.
- Поместите клетку внутрь так, чтобы сено или сухая трава оказались между стенками клетки и почвой.
- Засыпьте клетки грунтом с того же картофельного поля, где собраны насекомые.
- Установите водонепроницаемые регистраторы данных температуры и влажности в клетках на необходимой глубине.
ПРИМЕЧАНИЕ: Можно использовать регистраторы данных любого производителя, которые должны работать при низких температурах. - Сажайте рассаду картофеля в каждую клетку за 3-4 недели до появления жуков и умеренно поливайте.
- Закрепите трубку из синтетической ткани вертикально к палке из любого материала, установленной с внешней стороны клетки.
3. Выращивание насекомых перед зимовкой
- Вручную собирайте взрослых жуков на картофельных полях, свободных от пестицидов, ближе к концу вегетации картофеля.
ПРИМЕЧАНИЕ: Взрослые жуки существенно отличаются от личинок и характеризуются полосатыми надкрыльями, тогда как личинки красные. - Собранных жуков держать в пластиковых ведрах объемом 15-20 л (максимум 200 особей в ведре) с картофельной ботвой для кормления насекомых перед помещением в клетки.
- Накройте ведра дышащей тканью.
ПРИМЕЧАНИЕ: Не держите насекомых в ведрах более 12 часов. Используйте достаточно крупную картофельную ботву, чтобы предотвратить скопление жуков на дне ведер. - На картофельные растения, покрытые синтетической тканевой сеткой, размещают не более 200 особей CPB.
- Когда картофельная ботва будет съедена, добавьте свежую, помещенную в пластиковую банку с водой, и после этого ежедневно меняйте картофельную ботву.
ПРИМЕЧАНИЕ: Чтобы зафиксировать стебли в банке, используйте вату и парапленку. Тщательно проверяйте старые стебли на наличие жуков при их удалении. - Как только все жуки зарылись в почву на зимовку, отвяжите трубку из синтетической ткани от палки и уложите ткань вниз.
4. Сбор насекомых в зимний период
- Убирайте снег над поверхностью клетки.
- Разрыхлите клетку с каждой стороны сильной лопатой.
- Вытащите клетку из почвы с помощью веревок.
- Принесите клетку в лабораторию.
ПРИМЕЧАНИЕ: В зависимости от целей эксперимента, зимующие жуки, возможно, должны быть неактивны до проведения анализа. При этом температура в лаборатории при изоляции жуков от почвы должна быть ~2-5 °С. - Вынимайте грунт из ящика небольшими порциями, аккуратно разбивайте крупные куски почвы и изолируйте жуков с помощью пинцета.
- Отделите живых жуков от трупов. Живые здоровые жуки создают вокруг себя плотную почву, образуя воздушную полость (так называемую колыбель), и поэтому легко отделяются от почвы. Жуки, убитые грибами, мумифицируются или имеют видимый мицелий на поверхности. Бактерионно разлагающиеся насекомые имеют темный цвет.
- Просейте почву через сито, чтобы убедиться, что все жуки изолированы и не повреждены.
- Трупы с симптомами грибковой инфекции или бактериального разложения помещают в индивидуальную стерильную центрифужную пробирку объемом 15 мл для последующей идентификации.
- Хранят живых жуков в холодильнике при температуре 0-2 °С до анализа в закрыто-вентилируемой таре, содержащей влажный ватный тампон.
5. Подготовка образцов органов и тканей
- Для сбора гемолимфы делают прокол в боковой части живота под надкрыльями с помощью инсулиновой иглы.
ПРИМЕЧАНИЕ: Во время зимовки количество гемолимфы значительно уменьшается, что затрудняет сбор этой жидкости. - Чтобы изолировать кишечник, отрежьте головную капсулу, выдавите все содержимое в чашку Петри с фосфатным буфером, отделите кишечник и очистите его от жира и мальпигиевых сосудов.
- Отделите нужный отдел кишечника, например переднюю, среднюю или заднюю кишку.
- Чтобы изолировать жировое тело, отделите его от других тканей после выделения кишечника.
Примечание: Изолированные ткани могут быть использованы для измерения активности антиоксидантных и детоксикационных ферментов (пример: дополнительный рисунок 1), анализа регуляции генов иммунного сигнального пути (пример: дополнительный рисунок 2) или метабаркодирования содержимого кишечника насекомых и т. д.
6. Выделение микроорганизмов из трупов
- Чтобы изолировать энтомопатогенные грибы от трупов, мумифицированных насекомых поместили в стерильную камеру влажности.
- Используйте воздушные конидии (при наличии) или склероции из внутреннего содержимого жуков для покрытия на декстрозном агаре Сабуро с 0,4% молочной кислотой.
ПРИМЕЧАНИЕ: Используйте жуков с мицелием и конидиями для покрытия сразу (не помещая их во влажные камеры). - Выделите бактерии из трупов с симптомами бактериального разложения.
- У жука отрезают голову, выдавливают внутреннее содержимое и собирают в пробирки для последующего нанесения на среды для бактерий (агар Лурии-Бертани, эндоагар и желчный эскулиновый агар).
ПРИМЕЧАНИЕ: Используйте микроскопию и молекулярные методы для определения родов и видов патогенов. При необходимости может быть проведен анализ на наличие других паразитов.
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Результаты
Приведенные ниже результаты по зимующим КПБ показывают температуру почвы, выживаемость и инфекции.
Динамика температуры почвы.
Отрицательные температуры в садках на глубине 30 см регистрировались с конца ноября до начала апреля (рис. 1). Средняя температура за этот период составила минус 3,3 ± 0,1 °С (средняя ± стандартной ошибки). Самая низкая зарегистрированная температура составила минус 7,9 °C в середине февраля.
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Обсуждение
Проведенное исследование показывает, что предложенный метод изучения зимовки ЦПБ позволяет получить достаточное количество насекомых в разные периоды спячки. Успех представленной техники зависит от нескольких независимых факторов, важнейшим из которых являются погодные условия. В холодную бесснежную зиму почва может промерзнуть на всю глубину клетки. В этом случае риск гибели всех жуков значительно возрастает18. Выживаемость жука зависит от совокупности многих факторов, которые могут значительно м...
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Раскрытие информации
Авторы заявляют об отсутствии конкурирующих интересов.
Благодарности
Благодарим наших коллег Владимира Шило, Веру Морозову, Ульяну Роцкую, Ольгу Поленогову и Оксану Томилову за помощь в организации и проведении полевых и лабораторных процедур.
Исследование выполнено при поддержке Российского научного фонда, проект No 22-14-00309.
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Материалы
| Имя | Компания | Каталожный номер | Комментарии |
|---|---|---|---|
| Агар-агар бактериологический очищенный | diaGene | 1806.5000 | |
| Желчь Эскулин Агар | HiMedia | M972 | |
| Эндо Агар | HiMedia | M029 | |
| Глюкоза моногидрат-D | PanReac Апплименем | 143140.1000Φ | |
| Молочная кислота | PanReac Applichem | 141034.1211 | |
| Luria-Bertani жидкая среда | HiMedia | G009 | |
| 15 мл конические центрифужные пробирки | Axygen | SCT-15ML-25-S | |
| Peptone | FBIS SRCAMB | M 030/O61 | |
| Фосфат буферный физиологический Medigen | PBS500 | ||
| Регистратор температуры и влажности Ecklerk-M-11 | Релсиб | Водонепроницаемый регистратор данных |
Ссылки
- Alyokhin, A., Benkovskaya, G., Udalov, M. Colorado potato beetle. Insect Pests of Potato. , Academic Press. 29-43 (2022).
- Alyokhin, A., Kryukov, V. Ecology of a potato field. Insect Pests of Potato. , Academic Press. 451-462 (2022).
- Lee Jr, R. E., Costanzo, J. P., Kaufman, P. E., Lee, M. R., Wyman, J. A. Ice-nucleating active bacteria reduce the cold-hardiness of the freeze-intolerant Colorado potato beetle (Coleoptera: Chrysomelidae). Journal of Economic Entomology. 87 (2), 377-381 (1994).
- Ushatinskaja, R. S. Diapause of insects and its modifications. Journal of General Biology. 34, In Russian 194-215 (1973).
- Zheng, X. L., et al. Effect of soil moisture on overwintering pupae in Spodopteraexigua (Lepidoptera: Noctuidae). Applied Entomology and Zoology. 48, 365-371 (2013).
- Hiiesaar, K., Metspalu, L., Jõudu, J., Jõgar, K. Over-wintering of the Colorado potato beetle (Leptinotarsa decemlineata Say) in field conditions and factors affecting its population density in Estonia. Agronomy Research. 4 (1), 21-30 (2006).
- Yocum, G. D., Rinehart, J. P., Chirumamilla-Chapara, A., Larson, M. L. Characterization of gene expression patterns during the initiation and maintenance phases of diapause in the Colorado potato beetle, Leptinotarsa decemlineata. Journal of Insect Physiology. 55 (1), 32-39 (2009).
- Yocum, G. D., Buckner, J. S., Fatland, C. L. A comparison of internal and external lipids of nondiapausing and diapause initiation phase adult Colorado potato beetles, Leptinotarsa decemlineata. Comparative Biochemistry and Physiology Part B: Biochemistry and Molecular Biology. 159 (3), 163-170 (2011).
- Nikonorov, Y. M., Syrtlanova, L. A., Kitaev, K. A., Benkovskaya, G. V. Transcription activity of genes involved in diapause regulation in the Colorado Potato beetle and its change under a fipronil impact. Russian Journal of Genetics: Applied Research. 8, 80-86 (2018).
- Govaere, L., et al. Transcriptome and proteome analyses to investigate the molecular underpinnings of cold response in the Colorado potato beetle, Leptinotarsa decemlineata. Cryobiology. 88, 54-63 (2019).
- Lehmann, P., Westberg, M., Tang, P., Lindström, L., Käkelä, R. The diapause lipidomes of three closely related beetle species reveal mechanisms for tolerating energetic and cold stress in high-latitude seasonal environments. Frontiers in Physiology. 11, 576617(2020).
- Lebenzon, J. E., Torson, A. S., Sinclair, B. J. Diapause differentially modulates the transcriptomes of fat body and flight muscle in the Colorado potato beetle. Comparative Biochemistry and Physiology Part D: Genomics and Proteomics. 40, 100906(2021).
- Lashomb, J. H., Ng, Y. S., Ghidiu, G., Green, E. Description of spring emergence by the Colorado potato beetle, Leptinotarsa decemlineata (Say) (Coleoptera: Chrysomelidae), in New Jersey. Environmental entomology. 13 (3), 907-910 (1984).
- Cantwell, G. E., Cantelo, W. W., Schroder, R. F. Effect of Beauveria bassiana on underground stages of the Colorado potato beetle, Leptinotarsa decemlineata (Coleoptera: Chrysomelidae). The Great Lakes Entomologist. 19 (2), 6(1986).
- Fedorko, A., Bajan, C., Kmitowa, K., Wojciehowska, M. Effectiveness of the use of selected microorganisms to control the Colorado beetle during hibernation. Ecological Studies. 3 (2), 127-134 (1977).
- Gaugler, R., Costa, S. D., Lashomb, J. Stability and efficacy of Beauveria bassiana soil inoculations. Environmental Entomology. 18 (3), 412-417 (1989).
- Bajan, C., Kmitowa, K. Contribution of entomopathogenic fungi to the natural winter reduction of Colorado beetle adults. Polish Ecological Studies. 3 (2), 107-114 (1977).
- Milner, M., Kung, K. S., Wyman, J. A., Feldman, J., Nordheim, E. Enhancing overwintering mortality of Colorado potato beetle (Coleoptera: Chrysomelidae) by manipulating the temperature of its diapause habitat. Journal of Economic Entomology. 85 (5), 1701-1708 (1992).
- Doğan, C., et al. Characterization of calcium signaling proteins from the fat body of the Colorado Potato Beetle, Leptinotarsa decemlineata (Coleoptera: Chrysomelidae): Implications for diapause and lipid metabolism. Insect Biochemistry and Molecular Biology. 133, 103549(2021).
- Benkovskaya, G. V., Udalov, M. B. Colorado potato beetle investigations in the south Urals. Nova Science Publishers. , (2011).
- Short, C. A., Hahn, D. A. Fat enough for the winter? Does nutritional status affect diapause. Journal of Insect Physiology. , 104488(2023).
- McDonald, J. R., Bale, J. S., Walters, K. F. A. Low-temperature mortality and overwintering of the western flower thrips Frankliniella occidentalis (Thysanoptera: Thripidae). Bulletin of Entomological Research. 87 (5), 497-505 (1997).
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Перепечатки и разрешения
Теги
