Предварительное расследование подтверждает, что субарахноидальное кровоизлияние (САК) вызывает гибель перицитов головного мозга. Оценка сократительной способности перицитов после САК требует дифференциации жизнеспособных и нежизнеспособных перицитов головного мозга. В связи с этим была разработана процедура одновременной маркировки жизнеспособных и нежизнеспособных перицитов головного мозга в срезах мозга, что облегчает наблюдение с помощью конфокального микроскопа высокого разрешения.
Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.
Методическая статья
Визуализация витальных и невитальных перицитов головного мозга в срезах мозга после субарахноидального кровоизлияния
В этой статье
Краткое содержание
Аннотация
Перициты являются важнейшими клетками-стенками, расположенными в микроциркуляции головного мозга, которые играют ключевую роль в активной модуляции мозгового кровотока путем регулирования сократительной способности. Обычно их сократительная способность измеряется путем наблюдения морфологических сдвигов и изменений диаметра капилляров в непосредственной близости при определенных обстоятельствах. Тем не менее, посттканевая фиксация, оценка жизнеспособности и последующая сократительная способность перицитов визуализированных перицитов головного мозга оказывается под угрозой. Аналогичным образом, генетическая маркировка перицитов головного мозга не позволяет провести различие между жизнеспособными и нежизнеспособными перицитами, особенно при неврологических состояниях, таких как субарахноидальное кровоизлияние (САК), когда наше предварительное исследование подтверждает гибель перицитов головного мозга. Для преодоления этих ограничений был разработан надежный протокол, позволяющий одновременно флуоресцентно помечать как функциональные, так и нефункциональные перициты мозга в отделах мозга. Этот метод мечения позволяет визуализировать с помощью конфокального микроскопа с высоким разрешением, одновременно отмечая микроциркуляторное русло среза мозга. Этот инновационный протокол позволяет оценить сократительную способность перицитов головного мозга, их влияние на диаметр капилляров и структуру перицитов. Исследование сократительной способности перицитов головного мозга в контексте САК дает глубокое понимание ее влияния на церебральную микроциркуляцию.
Введение
Перициты головного мозга, отличающиеся тонкими выпуклостями и выступающими телами клеток, окружают микроциркуляцию 1,2. В то время как увеличение мозгового кровотока в основном обусловлено расширением капилляров, более мелкие артерии демонстрируют более медленные темпы расширения3. Сократительная способность перицитов оказывает влияние на диаметр капилляров и морфологию перицитов, влияя на сосудистую динамику4. Сокращение перицитов головного мозга приводит к сужению капилляров, а при патологических сценариях чрезмерное сокращение может препятствовать потоку эритр....
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Протокол
Протокол эксперимента был одобрен Комитетом по этике и использованию животных Куньминского медицинского университета (kmmu20220945). Для настоящего исследования использовались крысы Sprague-Dawley (SD) обоего пола массой 300-350 г.
1. Индукция модели SAH
- Обезболивайте крыс 2% изофлураном и 100% кислородом. Поддерживайте анестезию, обеспечивая непрерывную ингаляционную анестезию изофлураном (1%-3%). Закрепите голову крысы с помощью стереотаксического аппарата (см. таблицу материалов).
- Создайте модель SAH, выполнив следующие действия.
- Введите иглу для микроинъекций в супраселлярный ....
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Результаты
В нормальных физиологических условиях перициты головного мозга, как правило, не подвергаются клеточной гибели. Этот феномен показан на рисунке 6 , где желтый цвет указывает на наличие жизненно важных перицитов головного мозга; перициты головного мозга не показывают окрашивания ПИ, что указывает на их жизнеспособность. Для дальнейшего изучения того, остаются ли перициты прикрепленными к микроциркуляторному руслу после гибели клеток, были использованы методы на модели крыс с САК и проведена по.......
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Обсуждение
Разработаны методы конфокальной визуализации высокого разрешения для визуализации жизненно важных перицитов головного мозга, невитальных перицитов головного мозга и микроциркуляторного русла в срезах мозга. В острых срезах мозга крыс процесс включает в себя первоначальное мечение перицитов TO-PRO-311, за которым следует микрососудистые эндотелиальные клетки IB412; В дальнейшем идентификация погибших перицитов проводится с помощью ПИ. Этот протокол прост, воспроизводим и оче.......
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Раскрытие информации
Авторы заявляют, что у них нет конкурирующих финансовых интересов.
Благодарности
Исследование поддержано грантами Национального фонда естественных наук Китая (81960226,81760223); Фонд естественных наук провинции Юньнань (202001AS070045,202301AY070001-011)
....Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Материалы
| Имя | Компания | Каталожный номер | Комментарии |
|---|---|---|---|
| 6-луночная пластина | ABC биохимия | ABC703006 | RT |
| Adobe Photoshop | Adobe | Adobe Illustrator CS6 16.0.0 | RT |
| Алюминиевая фольга | MIAOJIE | 225 мм x 273 мм | RT |
| CaCl2· 2H2O | Sigma-Aldrich | C3881 | RT |
| Программное обеспечение для конфокальной визуализации | Nikon | NIS-Elements 4.10.00 | RT |
| Конфокальный лазерный сканирующий микроскоп | Nikon | N-SIM/C2si | RT |
| Бензобак (5% CO2, 95% O2) | PENGYIDA | 40L | RT |
| Стеклянная нижняя конфокальная тарелка | Beyotime | FCFC020-10шт | |
| RT Глюкоза | Sigma-Aldrich | G5767 | |
| RT Клей | EVOBOND | KH-502 | |
| RT Льдогенератор | XUEKE | IMS-20 | RT |
| Программное обеспечение для анализа изображений | Национальные институты здоровья | Image J | RT |
| Ингаляционная система анестезии | SCIENCE | QAF700 | RT |
| Изолектин B 4- FITC | SIGMA | L2895– 2MG | Store aliquots в – 20 ° C |
| KCl | Sigma-Aldrich | 7447– 40– 7 | |
| RT KH2PO4 | Sigma-Aldrich | P0662 | RT |
| MgSO4 | Sigma-Aldrich | M7506 | RT |
| NaCl | Sigma-Aldrich | 7647– 14– 5 | RT |
| 2PO4· H2O | Sigma-Aldrich | 10049– 21– 5 | RT |
| NaHCO3 | Sigma-Aldrich | S5761 | RT |
| Pasteur пипетка | NEST Biotechnology | 318314 | RT |
| Peristaltic Pump | Scientific Industries Inc | Model 203 | RT |
| Propidium (Iodide) | Med Chem Express | HY-D0815/CS-7538 | Хранить аликвоты в – 20 ° |
| C Стереотаксический аппарат | SCIENCE | QA | RT |
| Шприцевой насос | Harvard PUMP | 11 ELITE Nanomite | RT |
| Термостатическая водяная баня | OLABO | HH-2 | RT |
| Вибрационный микротом | Leica | VT1200 | RT |
Ссылки
- Dalkara, T., Gursoy-Ozdemir, Y., Yemisci, M. Brain microvascular pericytes in health and disease. Acta Neuropathologica. 122 (1), 1-9 (2011).
- Dore-Duffy, P., Cleary, K. Morphology and properties of pericytes. Methods in Molecular Biology (Clifton, N.J). 686
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Перепечатки и разрешения
