Методическая статья

Выделение кишечника из личинок данио-рерио для секвенирования одноклеточной РНК

DOI:

10.3791/65876

⸱

10 ноября 2023 г.

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Clinical Genetics, Erasmus University Medical Center - Sophia Children's Hospital, 2Division of Psychosocial Research and Epidemiology, the Netherlands Cancer Institute, 3Department of Hematology, Erasmus Medical Center, 4Department of Pathology, GROW-School for Oncology and Developmental Biology, Maastricht University Medical Center

В этой статье

Краткое содержание

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Здесь мы опишем метод выделения кишечника из личинок данио-рерио через 5 дней после оплодотворения для анализа секвенирования РНК одной клетки.

Аннотация

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Желудочно-кишечный тракт (ЖКТ) выполняет ряд функций, необходимых для жизни. Врожденные дефекты, влияющие на его развитие, могут привести к нервно-мышечным расстройствам кишечника, что подчеркивает важность понимания молекулярных механизмов, лежащих в основе развития и дисфункции желудочно-кишечного тракта. В этом исследовании мы представляем метод выделения кишечника из личинок данио-рерио через 5 дней после оплодотворения для получения живых, жизнеспособных клеток, которые могут быть использованы для анализа секвенирования одноклеточной РНК (scRNA-seq). Этот протокол основан на ручном рассечении кишечника данио-рерио с последующей ферментативной диссоциацией папаином. Затем клетки подвергают флуоресцентно-активированной клеточной сортировке, а жизнеспособные клетки отбирают для scRNA-seq. С помощью этого метода мы смогли успешно идентифицировать различные типы кишечных клеток, включая эпителиальные, стромальные, кровяные, мышечные и иммунные клетки, а также кишечные нейроны и глию. Поэтому мы считаем его ценным ресурсом для изучения состава желудочно-кишечного тракта в норме и при заболеваниях, используя рыбок данио.

Введение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Желудочно-кишечный тракт (ЖКТ) — это сложная система, которая играет жизненно важную роль в общем здоровье и благополучии. Он отвечает за переваривание и усвоение питательных веществ, а также за выведение продуктов жизнедеятельности 1,2. Желудочно-кишечный тракт состоит из нескольких типов клеток, включая эпителиальные клетки, гладкомышечные клетки, иммунные клетки и энтеральную нервную систему (ЭНС), которые тесно взаимодействуют друг с другом, регулируя и поддерживая надлежащую функцию кишечника 3,4,5. Дефекты развития желудочно-кишечного тракта могут иметь далеко идущие последствия для различных аспектов, таких как всасывание питательных веществ, состав микробиоты, ось кишечник-мозг и ЭНС, приводя к ряду кишечных нервно-мышечных заболеваний, таких как болезнь Гиршпрунга и хроническая кишечная псевдообструкция 6,7. Эти расстройства характеризуются тяжелой дисмоторикой кишечника, вызванной изменениями в различных ключевых клетках, таких как интерстициальные клетки Кахаля, гладкомышечные клетки и ENS 6,8,9. Тем не менее, молекулярные механизмы, лежащие в основе развития и дисфункции желудочно-кишечного тракта, до сих пор плохо изучены.

Рыбка данио-рерио является ценным модельным организмом для изучения развития и дисфункции желудочно-кишечного тракта благодаря своему быстрому эмбриональному развитию, прозрачности на эмбриональной и личиночной стадиях, а также генетической трактовке 10,11,12,13,14. Существуют многочисленные трансгенные линии данио-рерио, экспрессирующие флуоресцентные белки. Примером такой линии является рыбка данио-рерио tg(phox2bb:GFP), обычно используемая для изучения ЭНС, поскольку все клетки phox2bb+, включая энтеральные нейроны, помечены15,16. Здесь, используя линию данио-рерио tg(phox2bb:GFP), мы представляем метод кишечной изоляции личинок через 5 дней после оплодотворения (dpf) для анализа секвенирования одноклеточной РНК (scRNA-seq) (рис. 1).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Все разведение рыбок данио и эксперименты проводились в соответствии с институциональными руководящими принципами Erasmus MC и законодательством о благополучии животных. Использование личинок данио-рерио через 5 дней после оплодотворения подпадает под категорию экспериментов, которые не требуют формального этического одобрения, как указано в голландских правилах.

1. Получение личинок дикого типа и tg(phox2bb:GFP) через 5 дней после оплодотворения (dpf)

  1. Наладьте разведение рыбок данио-рерио дикого типа и соберите 50 яиц в среде E3 с буфером HEPES (далее E3) в чашке Петри диаметром 15 см. Используйте этих рыб в качестве отрицательного контроля для флуоресцентно-активированной сортировки клеток (FAC).
  2. Наладьте разведение данио-рерио tg(phox2bb:GFP) и соберите около 300 икринок в E3 в чашке Петри диаметром 15 см.
  3. Храните оплодотворенные яйца в E3 (максимум 50 яиц в чашке) в течение 14 ч/10 ч светлый/темный, в инкубаторе при температуре 28,5 °C.
  4. При 1 dpf удалите неоплодотворенные яйцеклетки и дайте оплодотворенным развиться до 5 dpf.
  5. Выберите личинки tg(phox2bb:GFP) при 1 dpf.

2. Диссоциация целых личинок дикого типа

  1. Обезболивайте личинки 5 dpf 0,016% трикаином.
  2. Измельчите 30 рыбок данио на мелкие кусочки с помощью лезвия бритвы в чашке Петри, содержащей 1 мл 10-кратного раствора трипсина-ЭДТА.
  3. Переложите измельченных данио-рерио в микроцентрифужную пробирку общим объемом 2 мл 10-кратного раствора трипсина-ЭДТА и оставьте на льду на 3 ч. Пипетка вверх и вниз пипеткой P1000 каждый час, чтобы стимулировать диссоциацию.

3. Изоляция кишечника

  1. Помещают 6-10 личинок 5 dpf, обезболинных 0,016% трикаином, в ряд, на 1,8% агарозную пластину (0,45 г агарозы в 25 мл Е3), под микроскопом для вскрытия
  2. Вставьте одну булавку для насекомых в голову рыбки данио.
  3. Удалите все оставшиеся E3 с помощью салфетки.
  4. Изолируйте кишечник с помощью другого булавки от насекомых, не потревожив другие органы. Убедитесь, что желток удален (дополнительный рисунок S1A).
  5. После изоляции осмотрите кишечник и при необходимости удалите весь некишечный материал (например, кожу, жир, печень).
  6. Соберите кишечник пинцетом и поместите его в микроцентрифужную пробирку, содержащую фосфатно-солевой буфер (PBS) с 10% фетальной телячьей сывороткой (FCS), на лед.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Следует изолировать минимум 244 кишечника, сохраняя общее время вскрытия 3 ч. Это возможно при параллельной работе двух человек.

4. Диссоциация кишечника

  1. Сразу после вскрытия всех кишечников центрифугировать микроцентрифужную пробирку на полной скорости (13 800 × г) в течение 30 с.
  2. Удалите PBS/10% FCS, но оставьте небольшое количество (~100 мкл), чтобы предотвратить высыхание кишечника. Добавьте 500 мкл папаина 2,17 мг/мл в HBSS, содержащий CaCl2 и MgCl2, для диссоциации клеток.
  3. Активируйте папаин 2,5 мкл цистеина (1 М).
  4. Кишки инкубировать на водяной бане при температуре 37 °C в течение 10 мин. Пипетка вверх и вниз на полпути (через 5 минут) для стимуляции ферментативного переваривания тканей.
  5. Пересадите клетки в пробирку FACS с помощью ситечка для клеток 35 мкм, предварительно смочив 0,5 мл PBS/10% FCS.
  6. Промойте ситечко, добавив в общей сложности 2 мл PBS/10% FCS с шагом 0,5 мл.
  7. Центрифугу при 700 × г в течение 5 мин при 4 °С.
  8. Удалите надосадочную жидкость и повторно суспендируйте гранулу в 300 мкл PBS/10% FCS.
  9. Добавьте 1 мкг/мл 4',6-диамидино-2-фенилиндола (DAPI) для мечения мертвых клеток (1:1000) и инкубируйте в течение 5 мин, чтобы обеспечить их исключение во время FACS.

5. Обогащение FACS

  1. Используйте образец дикого типа, чтобы установить ворота отсортированной клеточной популяции, записав 3000 клеток на проточный цитометр (дополнительный рисунок S1B-E).
  2. Используйте сопло 100 мкм, установите точность сортировки по чистоте и поместите сборную пробирку, содержащую 200 мкл PBS/5% FCS, в машину FACS.
  3. Загрузите клеточную суспензию кишечника и отсортируйте живые (DAPI-отрицательные), одиночные клетки в пробирку для сбора (Рисунок 2C), исключив дублеты (Рисунок 2B) и мертвые клетки (Рисунок 2C).
    ПРИМЕЧАНИЕ: Для рыбок данио-рерио tg(phox2bb) пропорция клеток GFP+ проверяется только для справки, так как все одиночные живые клетки сортируются.
  4. После сортировки клеток держите сборную пробирку на льду.
  5. Подсчитывают клеточную суспензию гемоцитометром, включая проверку жизнеспособности трипановым синим. Если жизнеспособность составляет не менее 80%, переходите к следующему шагу.
  6. Теперь клетки готовы к обработке scRNAseq (т.е. 10-кратной платформы Genomics Chromium). Используйте примерно 20 000 клеток на образец.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

С помощью этого протокола мы добились успешной изоляции и диссоциации всего кишечника от 5 личинок dpf. Используя папаин в качестве фермента диссоциации, мы значительно повысили жизнеспособность клеток, позволив зафиксировать 46 139 событий, связанных с одиночными жизнеспособными клетками (6,4% всех клеток) из 244 изолированных кишок (рис. 2A). Целые личинки дикого типа использовались в качестве контроля, чтобы обеспечить оптимизацию процесса сортировки, что позволило эффективно идентифициро...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

В данной работе мы представляем метод выделения и диссоциации кишечника личинок данио-рерио 5 dpf с использованием FACS. С помощью этого метода различные типы клеток кишечника были успешно собраны и проанализированы с помощью scRNA-seq с использованием платформы 10x Genomics Chromium. Мы выбрали линию данио-рерио tg(phox2bb:GFP), так как хотели получить указание на то, что жизнеспособные клетки ENS также будут выделены (рис. 2D). Тем не менее, важно отметить, что этот метод может бы...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

У авторов нет конфликта интересов, который можно было бы раскрыть.

Благодарности

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Эта работа была профинансирована Фондом друзей Софии (SSWO WAR-63).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
10x Трипсин (0.5%)-ЭДТА (0.2%)Sigma59418C
5 мл пробирка с круглым дном и колпачком для клеточного фильтраFalcon352235
агарозаSigma-AldrichA9539
BD Falcon Трубка с круглым дном 5 мл (пробирки FACS) защелкивающаяся крышкаBD Biosciences352054
Cell Ranger v3.0.210X GenomicsN/A
DAPISigma-AldrichCat#D-9542
Микроскоп для препарированияOlympus SZX16
Сортировщик FACSAria IIIBD BiosciencesN/A
HBSS с CaCl2 и MgCl2Gibco14025050
Булавки для насекомыхFine Science Tools26000-25
L-цистеинSigmaC7352
MS-222, трикаинSupelcoA5040-250G
PapainSigmaP4762
Seurat v3Stuart et al. (2019)N/A
Trypan blue Сигма Кат#T8154

Ссылки

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Saldana-Morales, F. B., Kim, D. V., Tsai, M. T., Diehl, G. E. Healthy intestinal function relies on coordinated enteric nervous system, immune system, and epithelium eesponses. Gut Microbes. 13 (1), 1-14 (2021).
  2. Sitrin, M. The Gastrointestinal System. , (2014).
  3. Furness, J. B. The organisation of the autonomic nervous system: peripheral connections. Autonomic Neuroscience: Basic and Clinical. 130 (1-2), 1-5 (2006).
  4. Furness, J. B. The enteric nervous system and neurogastroenterology. Nature Reviews. Gastroenterology & Hepatology. 9 (5), 286-294 (2012).
  5. Obata, Y., Pachnis, V. The effect of microbiota and the immune system on the development and organization of the enteric nervous system. Gastroenterology. 151 (5), 836-844 (2016).
  6. Heuckeroth, R. O. Hirschsprung disease - integrating basic science and clinical medicine to improve outcomes. Nature Reviews. Gastroenterology & Hepatology. 15 (3), 152-167 (2018).
  7. Antonucci, A., et al. Chronic intestinal pseudo-obstruction. World Journal of Gastroenterology. 14 (19), 2953-2961 (2008).
  8. De Giorgio, R., Sarnelli, G., Corinaldesi, R., Stanghellini, V. Advances in our understanding of the pathology of chronic intestinal pseudo-obstruction. Gut. 53 (11), 1549-1552 (2004).
  9. Bianco, F., et al. Enteric neuromyopathies: highlights on genetic mechanisms underlying chronic intestinal pseudo-obstruction. Biomolecules. 12 (12), 1849(2022).
  10. Kimmel, C. B., Ballard, W. W., Kimmel, S. R., Ullmann, B., Schilling, T. F. Stages of embryonic development of the zebrafish. Dev Dyn. 203 (3), 253-310 (1995).
  11. Lieschke, G. J., Currie, P. D. Animal models of human disease: zebrafish swim into view. Nature Reviews. Genetics. 8 (5), 353-367 (2007).
  12. Howe, K., et al. The zebrafish reference genome sequence and its relationship to the human genome. Nature. 496 (7446), 498-503 (2013).
  13. Wallace, K. N., Akhter, S., Smith, E. M., Lorent, K., Pack, M. Intestinal growth and differentiation in zebrafish. Mechanisms of Development. 122 (2), 157-173 (2005).
  14. Wallace, K. N., Pack, M. Unique and conserved aspects of gut development in zebrafish. Developmental Biology. 255 (1), 12-29 (2003).
  15. Harrison, C., Wabbersen, T., Shepherd, I. T. In vivo visualization of the development of the enteric nervous system using a Tg(-8.3bphox2b:Kaede) transgenic zebrafish. Genesis. 52 (12), 985-990 (2014).
  16. Kuil, L. E., Chauhan, R. K., Cheng, W. W., Hofstra, R. M. W., Alves, M. M. Zebrafish: a model organism for studying enteric nervous system development and disease. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 8, 629073(2020).
  17. Stuart, T., et al. Comprehensive Integration of Single-Cell Data. Cell. 177 (7), 1888-1902 (2019).
  18. Kuil, L. E., et al. Unbiased characterization of the larval zebrafish enteric nervous system at a single cell transcriptomic level. iScience. 26 (7), 107070(2023).
  19. Gao, Y., et al. Unraveling differential transcriptomes and cell types in zebrafish larvae intestine and liver. Cells. 11 (20), 3290(2022).
  20. Jin, Q., et al. Cdx1b protects intestinal cell fate by repressing signaling networks for liver specification. Journal of Genetics and Genomics. 49 (12), 1101-1113 (2022).
  21. Willms, R. J., Jones, L. O., Hocking, J. C., Foley, E. A cell atlas of microbe-responsive processes in the zebrafish intestine. Cell Reports. 38 (5), 110311(2022).
  22. Kline, M. Fishing for answers: Isolating enteric neurons and identifying putative ENS mutants. , Iowa State University. https://doi.org/10.31274/etd-180810-5368 (2016).
  23. Allan, K., DiCicco, R., Ramos, M., Asosingh, K., Yuan, A. Preparing a single cell suspension from zebrafish retinal tissue for flow cytometric cell sorting of Muller glia. Cytometry A. 97 (6), 638-646 (2020).
  24. Lopez-Ramirez, M. A., Calvo, C. F., Ristori, E., Thomas, J. L., Nicoli, S. Isolation and culture of adult zebrafish brain-derived neurospheres. Journal of Visualized Experiments. 53617 (108), 53617(2016).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на повторное использование текста или иллюстраций этой статьи JoVE

Запросить разрешение

Теги

Похожие статьи