Методическая статья

Выделение клеток с морфологической и пространственной информацией из образцов субмукозного фиброза полости рта методом лазерной микродиссекции

DOI:

10.3791/65890

⸱

11 августа 2023 г.

 ,  ,  , 
1Department of Oral Pathology, Peking University School and Hospital of Stomatology & National Center of Stomatology & National Clinical Research Center for Oral Diseases & National Engineering Research Center of Oral Biomaterials and Digital Medical Devices, 2Research Unit of Precision Pathologic Diagnosis in Tumors of the Oral and Maxillofacial Regions, Chinese Academy of Medical Sciences (2019RU034), 3Central Laboratory, Peking University School and Hospital of Stomatology

В этой статье

Краткое содержание

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Лазерная микродиссекция субмукозных фиброзных тканей полости рта позволяет точно извлекать клетки из интересующих гистологических областей для анализа мультиомиксных данных с морфологической и пространственной информацией.

Аннотация

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Субмукозный фиброз полости рта (ОСФ) является распространенным типом потенциально злокачественного заболевания полости рта. Атрофия эпителия и фиброз собственной пластинки и подслизистой оболочки часто обнаруживаются на гистопатологических предметных стеклах. Было высказано предположение, что дисплазия эпителия, атрофия эпителия и стареющие фибробласты связаны со злокачественной трансформацией OSF. Однако из-за гетерогенности потенциально злокачественных заболеваний полости рта и плоскоклеточного рака полости рта трудно выявить специфические молекулярные механизмы злокачественной трансформации при ОСФ. В данной работе представлен метод получения небольшого количества эпителиальных или мезенхимальных клеток, несущих морфологические данные и пространственную информацию, методом микродиссекции с лазерным захватом на фиксированных формалином предметных стеклах, залитых парафином. С помощью микроскопа мы можем точно захватить микромасштабную (~500 клеток) диспластическую или атрофическую эпителиальную ткань и фиброзную субэпителиальную ткань. Извлеченные клетки могут быть оценены с помощью секвенирования генома или транскриптома для получения геномных и транскриптомных данных с морфологической и пространственной информацией. Этот подход устраняет гетерогенность массового секвенирования тканей OSF и интерференцию, вызванную клетками в непораженных областях, что позволяет проводить точный пространственно-омиксный анализ тканей OSF.

Введение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Субмукозный фиброз полости рта (ОСФ) – это хроническое коварное заболевание, которое развивается преимущественно в слизистой оболочке щек и приводит к ограничению открывания рта1. В то время как OSF является многофакторным заболеванием, жевание ореха ареки или ореха бетеля является основной причиной OSF 2,3. Из-за этой географически специфической привычки OSF преимущественно концентрируется в популяциях в Юго-Восточной и Южной Азии3. Общие гистологические признаки OSF включают аномальное отложение коллагена в соединительной ткани под эпителием слизистой оболочки полости рта, стеноз сосудов и окклюзию1. Эпителиальная ткань OSF может проявляться атрофией или гиперплазией и даже дисплазией при одновременном применении с лейкоплакией полости рта 4,5.

OSF определяется Всемирной организацией здравоохранения как распространенное оральное потенциально злокачественное заболевание (OPMD), которое демонстрирует потенциал прогрессирования до плоскоклеточного рака полости рта со скоростью злокачественной трансформации 4%-6%6,7,8,9. Механизм, лежащий в основе злокачественной трансформации OSF, сложен10. Аномальный рост эпителия, включающий как дисплазию, так и атрофию, увеличивает потенциал канцерогенеза, а стареющие фибробласты в строме могут быть вовлечены в злокачественную прогрессию OSF путем индуцирования эпителиально-мезенхимального перехода (EMT) через активные формы кислорода (АФК) и другие молекулы10.

Технологии пространственно-омического анализа позволили получить мультиомные данные с морфологической и пространственной информацией, которые позволили получить представление о механизмах развития рака11,12,13. Здесь мы представляем протокол для захвата морфологических клеточных популяций из фиксированной формалином парафиносодержащей ткани OSF методом лазерной микродиссекции. Мультиомный анализ этих образцов может преодолеть проблемы, связанные с внутритканевой гетерогенностью, и улучшить понимание молекулярной патологии и механизмов злокачественной трансформации в OSF14.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Это исследование было одобрено институциональным наблюдательным советом школы и больницы Пекинского университета. От пациентов было получено информированное согласие. Образцы тканей, использованные в этом исследовании, были обезличены. Схема исследования показана на рисунке 1.

1. Пробоподготовка

  1. Разрезать на микротоме ткани ротовой полости с парафином, залитые парафином, на непрерывные участки толщиной 3 мкм и 10 мкм.
  2. Разложите секции в воде, а затем выловите рыбу на горках. Зафиксируйте участки 3 мкМ и 10 мкм на предметных стеклах адгезионного микроскопа (слайд А) и PEN-мембранных предметных стеклах (слайд Б) соответственно.
  3. Поместите предметные стекла на плиту при температуре 60 °C на 2 часа.

2. Окрашивание гематоксилин-эозином

  1. Поместите слайды А и Б в ксилол (ОСТОРОЖНО) на 10 минут и повторите этот шаг трижды.
  2. Гидратируйте предметные стекла А и В в градуированных растворах этанола порядка 100%, 100%, 90%, 80% и 70% в течение 1 мин в каждой концентрации.
  3. Поместите предметные стекла А и Б в сверхчистую дистиллированную воду на 30 с
  4. Поместите предметные стекла А и Б в раствор красителя гематоксилина Харриса на 90 с.
  5. Поместите предметные стекла А и Б в сверхчистую дистиллированную воду на 30 с и повторите этот шаг трижды.
  6. Поместите слайды А и Б в раствор див-гематоксилина (ОСТОРОЖНО) на 2 с.
  7. Поместите предметные стекла А и Б в сверхчистую дистиллированную воду на 30 с и повторите этот шаг трижды.
  8. Поместите предметные стекла в А и Б в 1%-ный раствор повторного синения на 2 с.
  9. Поместите предметные стекла А и Б в сверхчистую дистиллированную воду на 30 с и повторите этот шаг трижды.
  10. Поместите предметные стекла в раствор эозина на 2 с.
  11. Поместите предметные стекла А и Б в сверхчистую дистиллированную воду на 30 с и повторите этот шаг трижды.
  12. Обезвоживают предметные стекла в градуированных растворах этанола порядка 70%, 80%, 90%, 100% и 100% в течение 2 с в каждой концентрации.
  13. Поместите предметное стекло А в ксилол на 3 минуты и повторите этот шаг дважды.
  14. Добавьте каплю монтажного носителя (ОСТОРОЖНО) на слайд A и накройте его покровным стеклом.

3. Наблюдение за гистологической морфологией и микродиссекция с помощью лазерного захвата

  1. Запустите систему лазерной микродиссекции и программное обеспечение (рис. 2).
  2. Поместите предметное стекло А на предметное стекло и понаблюдайте за гистологической морфологией, чтобы определить область интереса для лазерной микродиссекции.
  3. Снимите слайд А и поместите слайд Б обратно на предметный столик.
  4. Нажмите кнопку «Выгрузить » (рис. 2), чтобы вытолкнуть устройство сбора. Вставьте пробирку для полимеразной цепной реакции (ПЦР) в устройство для сбора и убедитесь, что пробирка зафиксирована. Нажмите кнопку OK (рисунок 3).
  5. Выберите колпачок, щелкнув по соответствующему красному кружку, обозначающему устройство сбора: Крышки для трубок. Выбранный круг станет зеленым.
  6. Нажмите кнопки Рисовать и Рисовать + Вырезать и используйте мышь, чтобы нарисовать интересующую область.
  7. Нажмите кнопку «Начать вырезание », чтобы захватить интересующую область; захваченный образец будет собран колпачком (рис. 4).
  8. Нажмите кнопку Lower , чтобы убедиться в том, что захваченный образец собран (рис. 5).
  9. Нажмите кнопку Образец , чтобы получить следующий образец.
  10. Нажмите кнопку «Выгрузить», чтобы выгрузить пробирку для ПЦР с захваченным образцом.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Выполняя лазерную микродиссекцию тканей OSF, мы получили образцы диспластического эпителия, стромы под диспластическим эпителием, атрофического эпителия и стромы под атрофической эпителиальной тканью (рис. 1). Благодаря выделению ДНК и низкоглубинному секвенированию всего генома мы смогли проанализировать связанные с морфологией изменения числа копий (CNA)15. CNA является распространенной формой геномной нестабильности, связанной с повышенным риском злокачественной тр...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

В этом протоколе сообщалось о конвейере для захвата образцов тканей OSF с морфологической и пространственной информацией для дальнейшего пространственно-омического анализа с помощью лазерной микродиссекции. Исходя из репрезентативных результатов, мы идентифицировали различные паттерны CNA среди различных образцов, связанных с морфологией.

OSF, тип OPMD, является распространенным предраковым состоянием плоскоклеточной карциномы полости рта6. Сообщалось, что геномная нест...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.

Благодарности

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Работа выполнена при поддержке исследовательских грантов Национального фонда естественных наук Китая (81671006, 81300894), Инновационного фонда медицинских наук CAMS (2019-I2M-5-038), Национального проекта по построению ключевой клинической дисциплины (PKUSSNKP-202102), Инновационного фонда для выдающихся докторантов Центра медицинских наук Пекинского университета (BMU2022BSS001).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
Предметные стекла для адгезионного микроскопаCITOTESTREF.188105
Div-гематоксилинYiLi20230326
раствор эозинаBASO BA4098
ЭтанолПЕКИН РЕАГЕНТNo32061
Раствор гематоксилина красителя HarrisYiLi20230326
Горячая пластинаLEICAHI1220
Лазерная система микродиссекцииLEICALMD7Машина
лазерной микродиссекцииLEICA8.2.3.7603Программное обеспечение
Монтажный носитель для микромонтированияLEICAREF.3801731
Защитное стекло микроскопаCITOTESTREF.10212450C
МикротомLEICARM2235
ПЦР-пробиркиAXYGEN16421959
PEN-мембранные слайдыLEICANo11505158
Re-blue растворYiLi20230326
Ультрачистая дистиллированная водаInvitrogenREF.10977-015
КсилолПЕКИНРЕАГЕНТ No33535

Ссылки

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Cai, X., et al. Oral submucous fibrosis: A clinicopathological study of 674 cases in China. Journal of Oral Pathology & Medicine. 48 (4), 321-325 (2019).
  2. Cai, X., Huang, J. Clinicopathological factors associated with progression of oral submucous fibrosis: A population-based retrospective study. Oral Oncology. 130, 105949(2022).
  3. Ray, J. G., Chatterjee, R., Chaudhuri, K. Oral submucous fibrosis: A global challenge. Rising incidence, risk factors, management, and research priorities. Periodontology 2000. 80 (1), 200-212 (2019).
  4. Shih, Y. H., Wang, T. H., Shieh, T. M., Tseng, Y. H. Oral submucous fibrosis: A Review on etiopathogenesis, diagnosis, and therapy. International Journal of Molecular Sciences. 20 (12), 2940(2019).
  5. Cai, X., et al. The preliminary exploration of immune microenvironment in oral leukoplakia concomitant with oral submucosal fibrosis: A comparative immunohistochemical study. Journal of Oral Pathology & Medicine. , (2023).
  6. Warnakulasuriya, S., et al. Oral potentially malignant disorders: A consensus report from an international seminar on nomenclature and classification, convened by the WHO Collaborating Centre for Oral Cancer. Oral Diseases. 27 (8), 1862-1880 (2021).
  7. Cai, X., et al. Development and validation of a nomogram prediction model for malignant transformation of oral potentially malignant disorders. Oral Oncology. 123, 105619(2021).
  8. Murthy, V., et al. Malignant transformation rate of oral submucous fibrosis: A systematic review and meta-analysis. Journal of Clinical Medicine. 11 (7), 1793(2022).
  9. Kujan, O., Mello, F. W., Warnakulasuriya, S. Malignant transformation of oral submucous fibrosis: A systematic review and meta-analysis. Oral Diseases. 27 (8), 1936-1946 (2020).
  10. Qin, X., Ning, Y., Zhou, L., Zhu, Y. Oral submucous fibrosis: Etiological mechanism, malignant transformation, therapeutic approaches and targets. International Journal of Molecular Sciences. 24 (5), 4992(2023).
  11. Sun, L., et al. Single-cell and spatial dissection of precancerous lesions underlying the initiation process of oral squamous cell carcinoma. Cell Discovery. 9 (1), 28(2023).
  12. Zhu, J., et al. Delineating the dynamic evolution from preneoplasia to invasive lung adenocarcinoma by integrating single-cell RNA sequencing and spatial transcriptomics. Experimental & Molecular Medicine. 54 (11), 2060-2076 (2022).
  13. Ji, A. L., et al. Multimodal analysis of composition and spatial architecture in human squamous cell carcinoma. Cell. 182 (2), 497-514 (2020).
  14. Van den Bossche, V., et al. Microenvironment-driven intratumoral heterogeneity in head and neck cancers: clinical challenges and opportunities for precision medicine. Drug Resistance Updates. 60, 100806(2022).
  15. Li, X., et al. Improvement in the risk assessment of oral leukoplakia through morphology-related copy number analysis. Science China. Life sciences. 64 (9), 1379-1391 (2021).
  16. Watkins, T. B. K., et al. Pervasive chromosomal instability and karyotype order in tumour evolution. Nature. 587 (7832), 126-132 (2020).
  17. Odell, E. W. Aneuploidy and loss of heterozygosity as risk markers for malignant transformation in oral mucosa. Oral Diseases. 27 (8), 1993-2007 (2021).
  18. Wood, H. M., et al. The genomic road to invasion-examining the similarities and differences in the genomes of associated oral pre-cancer and cancer samples. Genome Medicine. 9 (1), 53(2017).
  19. Venugopal, D. C., et al. Integrated proteomics based on 2D gel electrophoresis and mass spectrometry with validations: Identification of a biomarker compendium for oral submucous fibrosis-An indian study. Journal of Personalized Medicine. 12 (2), 208(2022).
  20. Kundu, P., Pant, I., Jain, R., Rao, S. G., Kondaiah, P. Genome-wide DNA methylation changes in oral submucous fibrosis. Oral Diseases. 28 (4), 1094-1103 (2022).
  21. Cai, X., Zhang, H., Li, T. Multi-target pharmacological mechanisms of Salvia miltiorrhiza against oral submucous fibrosis: A network pharmacology approach. Archives of Oral Biology. 126, 105131(2021).
  22. Xiao, X., Hu, Y., Li, C., Shi, L., Liu, W. DNA content abnormality in oral submucous fibrosis concomitant leukoplakia: A preliminary evaluation of the diagnostic and clinical implications. Diagnostic Cytopathology. 48 (11), 1111-1114 (2020).
  23. Zhou, S., et al. Long non-coding RNA expression profile associated with malignant progression of oral submucous fibrosis. Journal of Oncology. 2019, 6835176(2019).
  24. Lunde, M. L., et al. Profiling of chromosomal changes in potentially malignant and malignant oral mucosal lesions from South and Southeast Asia using array-comparative genomic hybridization. Cancer Genomics & Proteomics. 11 (3), 127-140 (2014).
  25. Sun, C., et al. Spatially resolved metabolomics to discover tumor-associated metabolic alterations. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 116 (1), 52-57 (2019).
  26. Ma, M., et al. Copy number alteration profiling facilitates differential diagnosis between ossifying fibroma and fibrous dysplasia of the jaws. International Journal of Oral Science. 13 (1), 21(2021).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на повторное использование текста или иллюстраций этой статьи JoVE

Запросить разрешение

Теги

Похожие статьи