Взаимодействие бактериофага Т4 и кишечной палочки в кишечнике мышей: прототипная модель для изучения динамики бактериофагов хозяина in vivo

Nicola Pett; Michael Hunter; Natalia A. Carranza García; Jung Hee Seo; Samuel R. Collins; Forest Rohwer; Lisa C. Osborne; Carolina Tropini

doi:10.3791/65906

Методическая статья

Взаимодействие бактериофага Т4 и кишечной палочки в кишечнике мышей: прототипная модель для изучения динамики бактериофагов хозяина in vivo

DOI:

10.3791/65906

⸱

26 января 2024 г.

Nicola Pett¹ , Michael Hunter¹ , Natalia A. Carranza García¹ , Jung Hee Seo¹ , Samuel R. Collins¹ , Forest Rohwer² , Lisa C. Osborne¹ , Carolina Tropini¹^,³^,⁴

¹Department of Microbiology and Immunology, Life Sciences Institute, University of British Columbia, ²Department of Biology, San Diego State University, ³School of Biomedical Engineering, University of British Columbia, ⁴Humans and the Microbiome Program, Canadian Institute for Advanced Research

В этой статье

Краткое содержание

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Бактериофаги (фаги), вирусы, заражающие бактерии, являются неотъемлемым компонентом микробиома кишечника. Хотя эти симбиотические обитатели управляют бактериальной приспособленностью и динамикой популяции, мало что известно о том, как они влияют на гомеостаз кишечника и болезни. Этот протокол изучает изолированные фаги Т4 в мышиной модели, адаптируемые к другим фаго-бактериальным парам.

Аннотация

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Бактериофаги (фаги) — это вирусы, которые инфицируют бактерии со специфичностью на уровне видов и штаммов и являются наиболее распространенными биологическими объектами во всех известных экосистемах. В бактериальных сообществах, таких как микробиоты кишечника, фаги участвуют в регулировании динамики популяций микробиоты и стимулируют эволюцию бактерий. В последнее десятилетие возобновился интерес к исследованиям фагов, отчасти из-за специфичной для хозяина способности литических фагов убивать, что является многообещающим инструментом для противодействия растущей угрозе устойчивых к противомикробным препаратам бактерий. Кроме того, недавние исследования, демонстрирующие, что фаги прилипают к кишечной слизи, позволяют предположить, что они могут играть защитную роль в предотвращении бактериальной инвазии в нижележащий эпителий. Важно отметить, что, как и бактериальные микробиомы, нарушенные фагеомы связаны с ухудшением исходов таких заболеваний, как воспалительные заболевания кишечника. Предыдущие исследования показали, что фаги могут модулировать микробиом животных и людей с помощью трансплантации фекальных фильтратов, принося пользу здоровью хозяина. В связи с недавней волной исследований возникла необходимость в разработке и стандартизации протоколов изучения фагов в контексте микробиома кишечника. Данный протокол предусматривает комплекс процедур для изучения изолированных фагов Т4 и их бактериального хозяина, кишечной палочки, в контексте желудочно-кишечного тракта мышей. Методы, описанные здесь, описывают, как начать с лизата фага, ввести его мышам и оценить влияние на бактериальный хозяин и уровни фагов. Этот протокол может быть модифицирован и применен к другим фаго-бактериальным парам и является отправной точкой для изучения динамики хозяин-фаг in vivo.

Введение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Бактериофаги, или фаги, — это вирусы, которые инфицируют и убивают бактерии со специфичностью на уровне видов и штаммов¹. Фаги играют важную роль в сложных бактериальных сообществах, таких как микробиота кишечника, где они участвуют в регулировании динамики популяций и обеспечении приспособленности бактерий². В течение последнего десятилетия возродился интерес к исследованиям фагов в связи с ростом числа устойчивых к противомикробным^{препаратам} патогенов3 и потенциалом фаговой терапии в качестве альтернативной стратегии лечения. В последние годы коктейли с литическими фагами используются внутривенно с некоторым успехом при серьезных, устойчивых к антибиотикам бактериальных септических инфекциях у людей ^3,4. Пероральная фаговая терапия также была предложена в качестве потенциальной альтернативы антибиотикам для лечения кишечных инфекций и воспалений. Кроме того, фаги участвуют в успешном проведении трансплантации фекального фильтрата (БПФ), представляющего собой препараты фекальной микробиоты, фильтруемые для удаления бактерий, при лечении рецидивирующей инфекции Clostridioides difficile (rCDI)^5,6, воспалительных заболеваний кишечника (ВЗК)^7,8 и некротизирующего энтероколита у недоношенных свиней⁹. Учитывая эти результаты, важно учитывать взаимодействие как между фагами и микробиотой кишечника, так и между фагами и хозяином млекопитающих, поскольку добавление новых фагов в уже существующее сообщество может иметь косвенное влияние на сообщество в целом, а не только на его целевые^{бактерии} ^2,10.

Изучение взаимодействия фагов с бактериями-мишенями in vitro оказалось полезным для понимания механизмов и последствий взаимодействия фагов и бактерий в кишечнике. В этих условиях было показано, что специфическим Т4-фагам Escherichia coli порядка Caudovirales требуются иммуноглобулиновые (Ig)-подобные домены, расположенные в высокоантигенных белках внешнего капсида (Hoc) на поверхности вириона, для прилипания к кишечной слизи¹¹. Кроме того, трансвелл-анализы показали, что фаги Т4 способны взаимодействовать с эпителиальными клеточными культурами и транслоцироваться через клеточные слои путем макропиноцитоза^12,13. Эти результаты подтверждают гипотезу о том, что фаги могут взаимодействовать со своим многоклеточным хозяином, даже если они не способны инфицировать эукариотические клетки. Эти модели, хотя и полезны, не учитывают весь спектр сложных взаимодействий, происходящих в экосистеме кишечника, которые необходимы для всестороннего исследования трехстороннего взаимодействия между фагами, бактериями и многоклеточным хозяином.

Мышиные модели являются важным инструментом для исследования фагов в сложных средах. Желательным применением фагового введения является альтернативная стратегия лечения инфекций, устойчивых к противомикробным препаратам, или патологий, связанных с хроническими воспалительными заболеваниями, включая ВЗК. Тем не менее, в новой литературе высказывается предположение, что поведение фагов in vitro не в полной мере отражает функции in vivo. Buttimer et ^al.14 продемонстрировали, что фаговый коктейль способен истощать целевые бактерии в упрощенном консорциуме микробиоты человека in vitro, но не может быть воспроизведен in vivo на гнотобиотических мышах, колонизированных тем же бактериально-фаговым консорциумом. Кроме того, в обычном микробиоме мышей фаг Т7 приводил к селективному истощению кишечных бактерий-мишеней, хотя со временем наблюдалось постепенное восстановление, что свидетельствует об эволюционировавшей резистентности¹⁵. Другие исследования продемонстрировали сосуществование перорально вводимых фагов и их штаммов-мишеней бактерий in vivo ^2,16. Действительно, помимо сосуществования фагов и бактерий, введение фагов привело к широкомасштабным изменениям в общем составе и функционировании сообщества микробиоты ^2,16. Это актуально в условиях заболевания, поскольку в нескольких исследованиях была обнаружена связь между повышенным относительным количеством Caudovirales и ВЗК ^7,8,17, которые не зависели от изменений в бактериальной численности⁷. Остается неизвестным, является ли это драйвером или следствием патогенеза заболевания.

Исторически в центре внимания фаговых исследований были отношения между фагом и его бактерией-мишенью. Однако также важно учитывать потенциальные взаимодействия между фагом и слизистой оболочкой, эпителием и иммунной системой многоклеточного хозяина. Все эти взаимодействия играют важную роль в общей реакции на кишечную фаговую инфекцию. Чтобы продемонстрировать это, фаги были изучены на безмикробных мышах (GF), чтобы выяснить их влияние на иммунную систему без вмешательства микробиоты⁸. В этой системе фаговые нуклеиновые кислоты детектировались толл-подобными рецепторами (TLR), расположенными в эндосомах фагоцитарных иммунных клеток (макрофагов и дендритных клеток). Это активировало нисходящую передачу сигналов и стимулировало Т-клеточную зависимую продукцию интерферона (ИФН)-γ⁸ или ИФН I типа¹⁸. Кроме того, Fluckiger et ^al.19 вовлекали CD8⁺ Т-клетки памяти в распознавание фаг-кодируемых (профаговых) антигенов, что приводило к перекрестной реактивности Т-клеток с опухолевыми антигенами, что приводило к снижению опухолевой нагрузки. Наконец, выработка фагоспецифических антител была задокументирована в исследованиях на мышах, где фаги доставлялись животным моделям непрерывно через питьевую воду ^8,20 или путем многократного перорального зондирования в течение нескольких^{месяцев20}, демонстрируя способность фаговых белков стимулировать гуморальный иммунный ответ. Несмотря на то, что эти способы фаговой инокуляции позволяют обеспечить оптимальную и непрерывную подготовку иммунной системы, они могут не отражать естественное взаимодействие между фагами и кишечной средой, а также кинетику пероральной фаговой терапии. До сих пор в ограниченном числе исследований изучалось взаимодействие фага с одним видом бактерий в моноколонизированных мышиных моделях²¹. Тем не менее, моноколонизированные мыши оказались критически важными в расшифровке микробно-специфических эффектов отдельных видов на желудочно-кишечный тракт (ЖКТ) и иммунное развитие 22,23,24, и они еще могут оказаться полезными для понимания трехсторонних взаимодействий между фагами, их бактериями-мишенями и многоклеточным хозяином.

Интересно, что еще многое предстоит узнать о взаимодействии между кишечным фагом и кишечными комменсальными бактериями, а также о взаимодействиях, которые происходят между многоклеточным хозяином и фагами, которые в нем находятся. Этот протокол предусматривает набор процедур для изучения изолированного фага Т4 и его бактериального аналога E. coli (K-12, BW25113) с использованием гнотобиотической мышиной модели. Эти стандартизированные процедуры также обеспечивают основу для оптимизации других диад фаг/бактерия путем адаптации параметров роста к интересующим парам. Методы, описанные здесь, включают: (1) Приготовление фагов Т4 и носителей лизатов для перорального зондирования мышей; (2) Пероральное введение фага Т4 моноколонизированным гнотобиотическим мышам E. coli ; (3) Мониторинг уровня фагов Т4 в фекалиях и тканях мышей с течением времени.

Для получения репрезентативных результатов, представленных здесь, очищенные лизаты фагов Т4 размножали из запасов фаговых банков, поддерживаемых лабораторией Рохвера. Метод Phage-on-Tap для размножения фага Т4 был адаптирован²⁵, как указано в этом протоколе. Метод позволяет получить высокие титры и низкий уровень эндотоксинов в течение трех дней. Используя этот подход, обычно собирали 10 мл ≥^{10 10} бляшеобразующих единиц (БОЕ)/мл фага Т4 с < 0,5 единиц эндотоксина (ЕС)/мл. Рекомендуемые уровни эндотоксина для перорального или внутривенного введения мышам составляют ≤ 20 ЕС/мл и ≤ 5 ЕЗЕ/кг/ч (или 0,1 ЕИ, вводимых в течение 1 ч для мышей весом 20 г), соответственно, что делает этот метод подходящим методом подготовки фагов для инокуляции in vivo . Все запасы фагов хранили при температуре 4 °C в фаговом буфере на основе солевого магния (SM) (рецепт приведен на этапе 1.1.5.1). Кишечную палочку культивировали в средах LB. Для различных пар фаг-бактерии этот протокол может адаптировать различные питательные среды и условия роста. Фаги также могут быть получены из окружающей среды, такой как сточные воды, морская вода, почва и содержимое кишечника, и могут быть изолированы и очищены в соответствии с Сэмбруком и Расселом²⁶ перед приготовлением, используя соответствующие условия роста и размножения для каждой интересующей пары фаг-хозяин²⁵. В качестве альтернативы фаги могут быть получены из коммерческих источников (см. Таблицу материалов) или из фаговых банков.

Протокол

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Все эксперименты проводились в соответствии с рекомендациями, установленными Комитетом по уходу за животными UBC и протоколами, утвержденными Комитетом по биобезопасности (A23-0113, B19-0038). Мыши были помещены в Университет Британской Колумбии в условиях, свободных от патогенов, в Центре моделирования заболеваний. Мыши C57BL/6 были выращены на объекте в стерильном изоляторе из гибкой пленки, обеспеченном стерильным мышиным кормом, водой, подстилкой и гнездовым материалом. Мышей поддерживали в 12-часовом цикле день/ночь. Экспериментальные мыши, как самцы, так и самки, были сопоставимы по возрасту в каждом эксперименте, в возрасте от 6 до 12 недель и весом 15-30 г для всех экспериментов.

1. Приготовление фагов и носителей лизатов для перорального зондирования мышей

Фаговая очистка и формирование запасов
ПРИМЕЧАНИЕ: В этом исследовании фаги Т4 выращивают и титруют путем нанесения на газон из бактерий с использованием метода одного слоя агара, описанного ниже. Метод двойного агарового слоя был описан ранее²⁵^,²⁷а также может использоваться с аналогичной эффективностью. Для этого протокола был выбран метод одного слоя агара, поскольку он обеспечивает улучшенную видимость зубного налета²⁸.
1. Выращивают кишечную палочку в 5 мл стерильной среды LB в стерильных пробирках из полистирола или стеклянных культуральных пробирок (с крышками). Инкубируйте пробирки при температуре 37 °C при встряхивании при 200 об/мин в течение ночи, пока не будет достигнута неподвижная фаза.
2. Готовят мягкий агар в стеклянной бутылке с наполнителем путем автоклавирования LB с 0,5% агаром и охлаждения до 50 °C или ниже (оставаясь при этом жидкостью) перед добавлением. Приготовьте достаточное количество мягкого агара по 15 мл на тарелку.
3. Добавьте мягкий агар с MgSO₄и CaCl₂ до конечной концентрации 1 мМ для каждого. Добавьте 100 мкл ночной культуры кишечной палочки на каждые 3 мл мягкого агара. Осторожно перемешайте с помощью магнитной мешалки, чтобы гомогенизировать добавки и культуру в мягком агаре.
  ПРИМЕЧАНИЕ: Постоянство объема и плотности кишечной палочки , добавляемой в препарат мягкого агара, имеет решающее значение (указано в разделе репрезентативных результатов).
4. Добавьте 15 мл мягкого агара + кишечной палочки в чашку Петри (диаметр 15 см) с помощью серологической пипетки. Дайте тарелкам застыть при комнатной температуре для использования в тот же день.
  ПРИМЕЧАНИЕ: Тарелки застынут примерно через 20 минут с открытыми крышками. Агар останется мягким, но не будет смещаться при переворачивании пластин.
5. Готовят 8-10 серийных разведений исходного фага Т4 в коэффициентах 10 путем разведения в буфере СМ. Нанесите по 5 мкл каждого раствора на планшеты. Дайте пятнам высохнуть, переверните и инкубируйте пластины при 37 °C в течение ночи.
  1. Для приготовления фагового буфера на основе солевого магния (СМ) в 1 л деионизированного H₂O растворяют 100 мМ NaCl, 8 мМ MgSO₄·7H₂O и 50 мМ Tris-HCl (рН 7,4). Автоклавируйте и храните при комнатной температуре.
    ПРИМЕЧАНИЕ: На следующий день кишечная палочка должна была вырасти в газон по всему мягкому агару LB. Бляшки или расчищенные участки роста, видимые на газоне E. coli , появятся там, где произошло фаговое уничтожение инфицированных хозяев E. coli . Каждая табличка представляет собой единицу формирования бляшки (БОУ).
6. Возьмите одну бляшку из мягкой агаровой пластины, вдавливая стерильный наконечник пипетки в центр бляшки, создавая агаровую пробку на конце наконечника. Повторно суспендируйте пробку бляшки в 1 мл буфера SM в пробирке для микроцентрифуги объемом 1,7 мл. Встряхните трубку на максимальной скорости в течение 1 минуты для смешивания.
7. Центрифугируйте пробирку при 4000 x g в течение 5 минут при комнатной температуре, чтобы удалить мусор из лизата. Перелейте надосадочную жидкость в новую микроцентрифужную пробирку.
8. Для размножения изолированного фага повторите шаги 1.1.1-1.1.3. Добавьте 100 мкл изолированного фага к 15 мл аликвоты мягкого агара, содержащего кишечную палочку, в конической пробирке. Переверните пробирку три раза, чтобы перемешать, и вылейте агар в чашку Петри.
9. Дайте планшетам высохнуть, прежде чем переворачивать и инкубировать в течение ночи при 37 °C. Подготовьте контрольную пластину для газона без фага для подтверждения жизнеспособности кишечной палочки .
  ПРИМЕЧАНИЕ: После ночной инкубации контрольная пластина должна иметь газон E.coli, в то время как пластина, содержащая фаги, должна быть полностью лизирована.
10. Чтобы извлечь фаг из планшета, добавьте 5 мл буфера SM на поверхность планшета, очищенного фагом, и встряхните при 70 об/мин на коромысле в течение 15 мин при комнатной температуре.
11. Соберите буфер с планшета в коническую центрифужную пробирку объемом 50 мл и центрифугируйте при 4000 x g в течение 5 минут при комнатной температуре, чтобы гранулировать любой мусор из агаровой пластины.
12. Соберите лизат фага Т4 в новую пробирку и храните при температуре 4 °C до титрования и распространения.
  ПРИМЕЧАНИЕ: Фаги Т4 стабильны более 10 лет²⁵; Однако стабильность будет зависеть от типа фага и условий хранения. Титр фага также будет меняться в зависимости от времени хранения. Фаги чувствительны к замораживанию. Поэтому рекомендуется проводить криоконсервацию в жидком азоте и избегать циклов замораживания-оттаивания, так как это может привести к повреждению фагов, снижая титр фагов²⁵.
13. Титр лизата фага Т4 для определения концентрации в БОЕ/мл, как описано ранее 25,29,30. Фаговый запас Т4 с высоким титром будет содержать 10⁸ КОЕ/мл или более.
Получение экспериментальных фаговых лизатов
1. Бактериологическое исследование E. coli в 5 мл жидких сред в стерильных пробирках из полистирола или стекла (с крышками). Инкубируйте пробирки в течение ночи при температуре 37 °C при встряхивании при 200 об/мин, пока не будет достигнута неподвижная фаза.
2. Субкультура: ночная культура кишечной палочки 1:50 в 100 мл LB среды в стеклянной конической колбе. Инкубируйте при температуре 37 °C при встряхивании при 200 об/мин до тех пор, пока бактерии не достигнут ранней или средней экспоненциальной фазы (около 1,5 ч).
  ПРИМЕЧАНИЕ: Начальная кривая роста может быть выполнена для определения оптической плотности в диапазоне 600 нм (OD₆₀₀), в котором бактериальная культура находится в экспоненциальной фазе. Предполагается культивирование в стеклянной конической пробирке, поскольку недавние данные показали, что фаги способны прилипать к пластмассам, таким как полипропилен³¹.
3. Добавьте 100 мкл высокотитрового фагового запаса Т4 из стадии 1.1 в субкультуру E. coli и инкубируйте при 37 °C при встряхивании в течение 3 ч или до тех пор, пока новый лизат не перестанет мутнеть. Соберите лизат фага Т4 в конические пробирки по 50 мл и либо приступайте непосредственно к этапам очистки, либо, при необходимости, храните при температуре 4 °C до следующего дня.
  ПРИМЕЧАНИЕ: Больший размер фагового всплеска (указывающий на более высокое среднее количество вирионов, высвобождаемых за цикл репликации) требует более длительного инкубационного периода для бактериальной субкультуры на этапе 1.2.2. Это обеспечивает повышенную плотность бактерий перед спайком с запасами фагов.
4. Центрифуга лисаты при 4000 x g в течение 20 минут при комнатной температуре, чтобы гранулировать оставшиеся бактерии и клеточный мусор. Полученную надосадочную жидкость процедить-стерилизовать с помощью нейлонового фильтра 0,22 мкм и перенести фильтрат в новые конические центрифужные пробирки объемом 50 мл.
5. Добавьте 0,1 объема хлороформа к каждому объему отфильтрованного лизата фага Т4, чтобы убить все оставшиеся бактерии и предотвратить рост бактерий. Быстро перемешать и инкубировать при комнатной температуре в течение 10 мин.
  ПРИМЕЧАНИЕ: Фаги с липидной оболочкой чувствительны к хлороформу, что может снижать титр фага²⁵. При необходимости пропустите этот шаг.
  ВНИМАНИЕ: Хлороформ является токсичным органическим растворителем, который опасен при вдыхании, проглатывании или всасывании через кожу. При работе с хлороформом используйте вытяжной шкаф и соответствующие средства индивидуальной защиты (СИЗ). При работе с хлороформом используйте стекло вместо полистирольных серологических пипеток, так как он не совместим с большинством пластмасс. Хлороформ можно помещать в полипропиленовые конические центрифужные пробирки для этапов 1.2.5-1.2.6, но не следует хранить длительное время в пластиковых пробирках.
6. Центрифугируйте лизат при 4000 x g в течение 5 минут при комнатной температуре, чтобы отделить хлороформ от лизата. С помощью серологической пипетки осторожно переложите верхний слой лизата в новую коническую пробирку объемом 50 мл, не нарушая нижележащий слой хлороформа. Выбросьте отходы хлороформа в соответствующий контейнер для опасных жидких отходов. Хранят лизаты при температуре 4 °C до концентрации и замены буфера на следующий день.
7. Сконцентрируйте лизаты фагов в центробежном фильтрующем устройстве с давлением 100 кДа (см. таблицу материалов), добавив 13 мл лизата фага в верхний резервуар устройства и центрифугируя при 4000 x g в течение 5 мин или до тех пор, пока большая часть лизата не пройдет через фильтр в нижний резервуар.
  ПРИМЕЧАНИЕ: Стремитесь получить примерно 2 мл лизата в конце времени отжима. По мере увеличения концентрации фагов в фильтре с добавлением лизата, время отжима, вероятно, будет увеличиваться. Центробежные фильтрующие устройства имеют физическую мертвую остановку, предотвращающую их сухое вращение³². Не допускайте высыхания фильтрующей мембраны, если предполагается ее дальнейшее использование (например, путем удаления всей жидкости из верхнего резервуара). Время вращения может варьироваться в зависимости от типа фага и титра.
8. Используя пипетку P200 или P1000, осторожно пипетируйте оставшиеся ~2 мл лизата вверх и вниз в верхнем резервуаре, чтобы прочистить фильтрующую мембрану после каждого отжима. Выбросьте фильтрат из нижнего резервуара в контейнер для отходов, оставив концентрированный фаг в верхнем резервуаре.
9. Повторяйте шаги 1.2.7-1.2.8 до тех пор, пока весь объем лизата фага не будет пропущен через фильтрующее устройство, при этом ~2 мл концентрированного фага остаются в верхнем резервуаре после каждого отжима.
10. Очистите фильтрующую мембрану после последнего отжима, пипетируя оставшийся лизат (~2 мл) в верхнем резервуаре вверх и вниз. Промыть фаг (буферный обмен), добавив 12 мл буфера SM в верхний резервуар и центрифугу при 4000 x g в течение 10 мин или до тех пор, пока большая часть буфера не пройдет через фильтр.
11. Выбросьте фильтрат и повторите этап промывки (шаг 1.2.10). Ресуспендируйте оставшиеся 2 мл лизата в буфере SM до конечного объема 10 мл (или меньше) для длительного хранения. Перелейте лизат в коническую центрифужную пробирку объемом 50 мл и храните при температуре 4 °C до удаления эндотоксина.
  ПРИМЕЧАНИЕ: Титрование фага на этом этапе не является обязательным, чтобы убедиться в концентрации лизата фага (> 10⁸ КОЕ/мл), а также для определения потери фага в процессе удаления эндотоксина.
12. Удаляют контаминирующие эндотоксины из лизата фага Т4, добавляя 0,4 объема 1-октанола (см. таблицу материалов) к общему объему лизата.
  ПРИМЕЧАНИЕ: Эндотоксины удаляются, так как они обладают высокой иммуностимулирующей способностью, и поэтому их присутствие может привести к индукции фагонезависимого врожденного иммунного ответа²⁵.
  ВНИМАНИЕ: 1-Октанол является ароматическим, органическим, легковоспламеняющимся соединением с сильным запахом и раздражает глаза. При работе с 1-октанолом носите соответствующие СИЗ. Все работы выполняйте в вытяжном шкафу, чтобы избежать вдыхания пара. Используйте уплотнительную пленку, чтобы предотвратить протекание трубок при работе вне вытяжного шкафа.
13. Закройте крышку конической центрифужной пробирки уплотнительной пленкой, чтобы предотвратить утечку. Встряхивают при 120 об/мин на платформе или качающемся шейкере при комнатной температуре в течение 1 ч с последующей инкубацией при 4 °С в течение 1,5 ч, не встряхивая.
14. Центрифуга при 4000 x g в течение 10 мин для отделения очищенного эндотоксином лизата от 1-октанола. Слой 1-октанола будет плавать поверх лизата. Используйте пипетку P1000, чтобы осторожно удалить как можно больше 1-октанола и вылить в соответствующий контейнер для опасных/легковоспламеняющихся жидких отходов.
15. Используйте иглу 18 G и шприц объемом 10 мл для сбора лизата фага под оставшимся слоем 1-октанола, стараясь не собирать слой 1-октанола. Храните лизат при температуре 4 °C до быстрого вакуумирования.
16. Переносят 1 мл аликвоты лизата фага Т4 в стерильные пробирки микроцентрифуг объемом 1,5 мл. Скоростной вакуум с открытыми крышками при 4000 x g при комнатной температуре для испарения остаточного 1-октанола из лизата. Скорость вакуумирования в течение 3 ч или до тех пор, пока объем лизата фага не уменьшится на 30%²⁵. Хранить при температуре 4 °C до титрования.
17. Титр лизата фага для определения концентрации в БОЕ/мл. Разбавьте полученный лизат фага Т4 в буфере SM до желаемой концентрации и повторите титр для подтверждения.
18. Количественное определение эндотоксинов, присутствующих в лизате фага Т4, с помощью набора для количественного определения хромогенного эндотоксина в соответствии с инструкциями производителя (см. таблицу материалов). Сравните уровни эндотоксина в конечном лизате фага с образцом до удаления эндотоксина, контрольными элементами транспортного средства, буфером и питьевой водой для мышей.
  ПРИМЕЧАНИЕ: Набор для количественного определения хромогенного эндотоксина инактивирован 1-октанолом²⁵. Выполните ускоренные вакуумные шаги для удаления 1-октанола (шаг 1.2.16) перед количественным определением эндотоксинов. Содержание эндотоксинов в дистиллированной воде оценивается в 20 ЕС/мл²⁵; Однако содержание эндотоксинов в питьевой воде для мышей может варьироваться в зависимости от учреждения. Если уровни эндотоксина в лизате фага превышают количество, присутствующее в питьевой воде, рассмотрите возможность повторения этапов удаления эндотоксина (1.2.12-1.2.16).
19. Концентрированные, очищенные от эндотоксинов лизаты фагов Т4 хранят в буфере SM при температуре 4 °C.
Приготовление бесфагового бактериального лизата для управления транспортными средствами
ПРИМЕЧАНИЕ: Бесфаговый бактериальный лизат может быть приготовлен в качестве средства для контроля любых эффектов, вызванных бактериальными загрязнителями (например, эндотоксином), образующимися при производстве лизата фагов на этапе 1.2, которые могут повлиять на экспериментальные результаты при инокуляции мышам.
1. Из ночной культуры кишечной палочки, субкультуры кишечной палочки 1:50 в 100 мл среды LB. Без добавления фага продолжают культивировать бактерии, встряхивая при 37 °C в течение 3 ч или сопоставляя время инкубации для лизата фага, полученного на этапе 1.2.
2. Перенесите культуру E. coli в конические пробирки объемом 50 мл и лизируйте клетки с помощью зонда-ультразвукатора (см. Таблицу материалов) на льду с частотой 30 кГц в течение 30 с импульсов (3x) для ручного лизиса бактериальных клеток.
3. Следуйте остальной части протокола в соответствии с шагом 1.2, начиная с шага 1.2.4, включая все этапы очистки, промывки и удаления эндотоксинов.
  ПРИМЕЧАНИЕ: Во время концентрирования с использованием центробежного фильтрующего устройства автомобильный лизат будет проходить через фильтр быстрее, чем лизат фага, из-за отсутствия фага. Поэтому сократите время центрифугирования с 5 минут до 2-5 минут, чтобы мембрана ультрафильтра не высыхала при длительном центрифугировании.
4. Измерьте титр лизата, чтобы убедиться, что он не содержит фагов.
5. Используйте набор для количественного определения хромогенного эндотоксина в соответствии с инструкциями производителя для измерения уровня эндотоксинов в лизате автомобиля. Разбавьте транспортный лизат в буфере SM в соответствии с уровнями эндотоксинов в лизате фага.
Альтернативный экспериментальный контроль: получение термоинактивированного фагового лизата
ПРИМЕЧАНИЕ: Альтернативой бесфаговому бактериальному лизату является термоинактивированный лизат фагов. Тепловая инактивация диссоциирует вирионы фагов, в то время как остаточные эндотоксины, такие как липополисахариды (ЛПС), термостабильны ^8,33. Этот метод был использован Gogokhia et ^al.8 для определения того, требуются ли интактные, жизнеспособные вирионы фагов для иммунной активации. Исследователям предлагается протестировать оба метода (без фагов и с инактивацией при нагревании) и определить, какой контроль наиболее подходит для их экспериментальных нужд. Какой бы вариант ни был выбран, важно признать, что буферный контроль вряд ли будет подходящим из-за значительных манипуляций, которые требуются для концентрации и очистки запаса фагов.
1. Переложите необходимый объем очищенного, очищенного и разбавленного лизата фага Т4 со стадии 1,2 (100 мкл на мышь) в стерильные пробирки для микроцентрифуг с замками крышки.
2. Нагревают лизаты на тепловом блоке при температуре 95 °C в течение 15 мин¹⁶.
3. НЕОБЯЗАТЕЛЬНО: Если требуется удаление фаговых/бактериальных нуклеиновых кислот, выполните обработку ДНКазой I и РНКазой А в соответствии с Jakočiūnė и Moodley³⁴. Кратко:
  1. Добавьте 50 мкл 10-кратного буфера ДНКазы I, 1 мкл ДНКазы I (1 мЕд/мкл) и 1 мкл РНКазы А (10 мг/мл) (см. таблицу материалов) к 450 мкл термоинактивированного фагового лизата.
  2. Лизаты инкубируют при 37 °C в течение 1,5 ч в тепловом блоке, не встряхивая.
  3. Инактивируйте ДНКазу I и РНКазу А, добавив 20 мкл 0,5 М этилендиаминтетрауксусной кислоты (ЭДТА)³⁴.
4. Подержите лизаты при комнатной температуре в течение 10 минут, чтобы охладить и соединить лизаты, если используется несколько пробирок. Хранить при температуре 4 °C до титрования.
5. Выполните титр фага, чтобы убедиться, что в лизате нет жизнеспособного фага Т4. Хранить термоинактивированные лизаты при температуре 4 °C.
6. Используйте набор для количественного определения хромогенного эндотоксина в соответствии с инструкциями производителя для измерения уровня эндотоксинов в термоинактивированном лизате. Разбавляют инактивированный теплом лизат в буфере SM в соответствии с уровнями эндотоксинов, присутствующими в подобранном фаговом лизате.

2. Введение и мониторинг фага Т4 у моноколонизированных мышей E. coli

Моноколонизация мышей E. coli
1. Подготовьте E. coli к введению мышам GF⁸ путем культивирования E. coli , взятой из одной колонии в среде LB, в течение ночи.
2. В строгих стерильных условиях³⁵ вводят 200 мкл культивирования E. coli мышам GF, помещенным либо в стерильные виниловые изоляторы, либо в герметичные клетки с биоэксклюзией, через ротовой зонд. При использовании аэротолерантных бактерий мышей также можно колонизировать путем нанесения 200 мкл бактериальной культуры на спину каждой мыши.
  ПРИМЕЧАНИЕ: Доза инокуляции будет зависеть от штамма, так как разные бактерии демонстрируют разную способность к выживанию рН^36,37. Zucoloto et ^al.35 рекомендуют инокуляцию 1 х 10⁸ КОЕ на животное. Репрезентативные результаты, показанные здесь, были получены от мышей, привитых ночной культурой (КОЕ не определяли). Пилотные эксперименты могут быть проведены для определения дозы, которая приводит к надежной колонизации интересующего штамма мышей. На количество бактерий, вводимых через пероральный зонд, может влиять возраст и вес мышей. Проконсультируйтесь с протоколом этики отдельных лабораторий или учреждений для определения максимально допустимых доз. Предлагаемый здесь объем основан на припуске на зонд в 10% от массы тела мыши (например, максимум 200 мкл для мыши весом 20 г). Некоторые виды бактерий не переносят кислотность желудка и не могут колонизировать кишечник. Рассмотрите возможность первого измерения со 100 мкл 1 М NaHCO₃для нейтрализации желудочных кислот². Если для колонизации используется строгий анаэроб, микроб необходимо будет выращивать в анаэробных условиях и переносить в гнотобиотический животноводческий комплекс в индивидуально подготовленных герметичных контейнерах (по 1 для каждой мыши). Выполняйте каждый зонд быстро после вскрытия контейнера, чтобы ограничить потерю жизнеспособности микробов из-за воздействия кислорода.
3. Следите за мышами на предмет неблагоприятных последствий для здоровья.
  ПРИМЕЧАНИЕ: В случае неблагоприятных последствий для здоровья руководствуйтесь стандартами, установленными соответствующим учреждением по уходу за животными. Возможные неблагоприятные последствия для здоровья включают, но не ограничиваются: (1) Аспирация жидкости из зонда: симптомы включают выталкивание пузырьков через нос, дыхание/дыхание «открытым ртом». (2) Перфорация пищевода: симптомы включают быстрое ухудшение здоровья, сгорбление, вялость, приводящие к смерти животного в течение 24 ч. (3) Воспаление пищевода из-за повторных пересадок через зонд: симптомы включают трудности с введением иглы для зондирования. (4) Диарея из-за изменений в микробиоме.
4. Подтвердите бактериальную колонизацию в фекальных гранулах путем культивирования не реже одного раза в неделю и/или секвенирования 16S рРНК³⁵.
  ПРИМЕЧАНИЕ: Если вы колонизируете заводчиков в пределах гнотобиотического изолятора для производства экспериментальных мышей, планируйте по крайней мере за 9 недель до рождения 6-недельного потомства первого поколения (F1) экспериментальных мышей. В качестве альтернативы взрослые мыши GF могут быть моноколонизированы. При таком подходе рекомендуется подождать 7 недель после колонизации перед инокуляцией фагов, так как это время, необходимое для стабилизации слизистой оболочки кишечника после введения сложной микробиоты мышам GF³⁸.
Пероральная инокуляция фага Т4 моноколонизированным мышам E. coli
1. Разбавляют лизаты фагов Т4 и контроль транспортных средств до заданной концентрации в буфере SM. Согласно Hsu et ^al.2, разбавляют лизаты фагов для введения 2 x 10⁶ БОЕ на мышь².
  ПРИМЕЧАНИЕ: Более высокая или более низкая концентрация фага может быть использована в зависимости от стабильности фага in vivo. Дозы 2 x 10², 2 x 10⁴ и 2 x 10⁶ pfu фага Т4 на мышь приводили к стабильной и длительной колонизации в кишечнике, которая, по-видимому, не была дозозависимой (показано в разделе репрезентативных результатов). Поэтому кинетика фаговых бактерий должна быть опробована in vivo перед крупномасштабными экспериментами.
2. В стерильных гнотобиотических условиях обмочите каждую мышь 100 мкл автоклавного 1 M NaHCO₃для нейтрализации желудочных кислот. Подождите 10 мин, затем проведите зонд со 100 мкл лизата фага Т4 или контролем транспортного средства.
3. Следите за мышами на предмет неблагоприятных последствий для здоровья.

3. Мониторинг уровня фагов Т4 in vivo

ПРИМЕЧАНИЕ: После того, как мыши были инокулированы фагом, концентрация как фагов, так и целевых бактерий может быть измерена в образцах фекалий или тканей. Это дает информацию о кинетике фаговой инфекции и динамике колонизации обоих организмов.

Точечное нанесение фага Т4 для определения концентрации в фекальных гранулах
1. Соберите фекальные гранулы с каждой мыши в стерильные, предварительно взвешенные микроцентрифужные пробирки для измерения уровня фага Т4 и кишечной палочки . Храните тюбики на льду до покрытия.
  ПРИМЕЧАНИЕ: Поместите образцы на лед в промежутке между сбором и нанесением покрытия, чтобы замедлить рост аэротолерантных бактерий. В течение нескольких часов все еще может наблюдаться рост аэробных бактерий или некоторая гибель анаэробных бактерий из-за воздействия кислорода, что может привести к искажению количества бактерий. Поэтому бактериальное и фаговое покрытие следует проводить как можно скорее после взятия пробы. Облигатные анаэробные бактерии плохо переносят воздействие кислорода. Чтобы сохранить пробу, соберите пробы в герметичные пробирки и перенесите пробирки в анаэробную камеру как можно скорее после сбора. Если в образцах фекалий не обнаружено роста, рассмотрите альтернативные варианты, такие как кПЦР 16S рРНК для количественного определения бактерий.
2. Запишите окончательный вес каждой пробирки и рассчитайте вес образца путем вычитания начального веса пробирки. Это будет использоваться для нормализации концентрации фага Т4 и кишечной палочки до массы образца (КОЕ/г или КОЕ/г соответственно).
3. Добавьте 1 мл стерильного буфера SM в каждую пробирку и тщательно перемешайте на максимальной скорости (>1 мин) для гомогенизации фекальных гранул. Если проба содержит менее 15 мг, можно добавить меньший объем SM-буфера. Запишите объем буфера SM, добавленного к каждой выборке, для расчета КОЕ/г или КОЕ/г образца.
4. Приготовьте серию из 8 (или более в зависимости от ожидаемой концентрации фагов) серийных разведений по 20 мкл каждого образца в буфере SM объемом 180 мкл с коэффициентом 10. Кратковременно перемешайте каждый гомогенизированный образец, чтобы перемешать перед добавлением в первую пробирку/лунку. Пипетка для смешивания между каждым добавлением и сменой наконечников между каждым разведением, чтобы предотвратить завышение количества фагов или бактерий при переносе образца.
  ПРИМЕЧАНИЕ: Если волокна и мусор, присутствующие в образце, препятствуют пипетированию, добавьте дополнительный буфер к фекальной суспензии для дальнейшего разбавления исходного образца.
5. Наносите по 5 мкл каждого разведения на мягкие агаровые планшеты LB , содержащие E. coli (для анализа фаговых бляшек) или пластины из агара LB (1,5% агара для анализа бактериальных колоний) для определения концентрации фага T4 и E. coli в каждом образце. Для точности расположите каждый образец в трех экземплярах.
  ПРИМЕЧАНИЕ: При приготовлении последовательных разведений в 96-луночном планшете можно использовать 8-канальную многоканальную пипетку P20 для пипетирования каждой колонки последовательно разбавленного образца на планшеты. Меняйте наконечники между каждым разведением, даже при переходе от наиболее разбавленного к наиболее концентрированному, так как фаг может прилипать к стенкам наконечника пипетки и изменять количество фага, добавляемого в каждую новую лунку³¹.
6. Дайте каждому пятну высохнуть, прежде чем переворачивать тарелку и помещать ее в инкубатор. Инкубировать в течение ночи при температуре 37 °C.
7. Для каждого образца выберите разведение, при котором на пятно приходится от 3 до 30 счетных бляшек. Подсчитайте и запишите количество бляшек в пятне и используемое разведение.
8. Рассчитайте pfu/г образца, разделив количество бляшек на объем, нанесенный в каждой точке, чтобы получить pfu/мкл. Умножьте это значение на коэффициент разбавления и на объем SM-буфера, добавленного к каждому образцу, чтобы получить pfu/образец. Наконец, разделите на вес образца, чтобы получить pfu/g³⁰.
Забор образцов тканей в экспериментальных конечных точках
1. В каждый выбранный момент времени усыпляйте мышей в соответствии с утвержденным институциональным протоколом этики животных и собирайте содержимое слепой кишки, содержимое тонкой и толстой кишки, а также любые ткани, представляющие интерес, в стерильные, предварительно взвешенные 2 мл пробирки для микроцентрифуг с круглым дном.
2. Запишите окончательный вес каждой пробирки, чтобы рассчитать вес образца. Храните салфетки и содержимое слепой кишки на льду до нанесения покрытия в тот же день.
3. Добавьте стерильный буфер SM в каждую пробирку и запишите добавленные объемы.
4. Для содержимого слепой кишки и кишечника тщательно (>1 мин) проводят вихревые пробы в соответствии с этапом 3.1.3.
5. Для образцов тканей добавьте по одной стерильной металлической бусине в каждую пробирку. Гомогенизируйте ткани с помощью тканевого лизера (см. Таблицу материалов) при частоте 20 Гц в течение 5 мин или до тех пор, пока ткани не диссоциируют и суспензия не станет однородной.
  ПРИМЕЧАНИЕ: Если образцы плохо гомогенизируются, рассмотрите возможность увеличения объема добавляемого буфера SM, увеличения времени гомогенизации или увеличения частоты гомогенизации до 30 Гц. Тканевый гомогенизатор также может быть использован для диссоциации тканей, обеспечивая при этом бактериальное и фаговое восстановление^39,40. Гомогенизаторы работают на более высоких частотах, чем тканевые лизеры, сохраняя при этом целостность бактерий.
6. Приготовьте последовательные разведения каждого образца в коэффициентах 10 и выполните точечное покрытие для определения концентраций E. coli и Т4-фагов в каждом образце, как описано в шаге 3.1.4-3.1.8⁴¹.

Результаты

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Для изучения взаимодействий между диадой Т4-фаг/E. coli в кишечнике мышей были приготовлены, очищены и очищены Т4-фаг и транспортные лизаты (рис. 1А). Титрование лизатов фагов Т4 проводили методом бляшечного анализа и разбавляли до 2 х 10⁷ КОЕ/мл (2 х 10⁶ КОЕ/мышь) в буфере СМ. Транспортные лизаты также титровали для подтверждения отсутствия жизнеспособных фагов и разбавляли в том же объеме SM-буфера, что и лизат фага Т4. Уровни эндотоксинов количественно определяли в разбавленных лизатах с помощью набора для количественного определения хромогенных эндотоксинов. Уровни эндотоксина в фаге Т4, термоинактивированном фаге и лизатах транспортных средств были ниже допустимых уровней для питьевой воды (<20 EU/мл)²⁵ (рис. 1B). Поскольку транспортный лизат содержал такое же количество эндотоксина, как и лизат фага Т4, он был признан подходящим контролем. Термоинактивированный лизат фага (2 x 10,⁷КОЕ/мл до термической обработки) содержал меньше эндотоксина, чем носитель и лизат фага Т4. В соответствии с инструкцией к набору, образцы, обработанные 1-октанолом, были протестированы на ингибирование анализа путем добавления стандарта эндотоксина к лизату носителя (носитель с шипами), чтобы получить конечную концентрацию 0,5 EU/мл. В соответствии с рекомендациями производителя концентрация эндотоксина в транспортных средствах за вычетом уровней эндотоксина транспортных средств составила 0,5 EU/мл ±25%). Это продемонстрировало, что 1-октанол был успешно удален и что не было никакого ингибирования анализа, вызванного лизатами, которое могло бы повлиять на результаты анализа.

Кишечная палочка Моноколонизированных мышей C57BL/6 K-12 (BW25113) разводили в стерильном гибком пленочном виниловом изоляторе в гнотобиотических условиях (рис. 2A). Мыши поколения F0 были колонизированы кишечной палочкой путем ее добавления в окружающую среду и совместного проживания. Для экспериментов использовали только потомство (поколения F1 и F2), которое было колонизировано кишечной палочкой с рождения путем вертикальной передачи и совместного проживания. Эта стратегия контролировала изменения в иммунной системе, выработке слизи и развитии желудочно-кишечного тракта, которые происходят в ответ на бактериальную инокуляцию^22,37, что позволяет измерять изменения, которые происходят только из-за внедрения фагов. После созревания экспериментальные мыши были переведены в стерильные изоклетки, где каждая из них получала 2 x 10⁶ ФОЕ фага Т4 или равный объем носителя лизата через пероральный зонд в возрасте 6-8 недель. Численность фага Т4 и E. coli контролировали в течение четырех недель путем сбора фекальных гранул и точечных анализов на 0,5% (мягком) агаре или 1,5% агаре, соответственно. В ходе этого эксперимента фаг Т4 и кишечная палочка смогли сосуществовать без истощения популяции (рис. 2B, C). Пероральное введение фага Т4 в более низких дозах 2 х 10² и 2 х 10⁴ БОЕ/мышь не снижало способность фага Т4 колонизировать кишечник по сравнению с 2 х 10⁶ ФОЕ (рис. 2D). Аналогичным образом, дозозависимого влияния инокуляции Т4 на уровень E. coli не наблюдалось (рис. 2E).

Важно отметить, что постоянство покрытия между образцами имеет решающее значение для количества бляшек. Например, при добавлении бактерий в мягкий агар было установлено, что плотность бактерий сильно влияет на результат анализа. Добавление E. coli , которая подвергалась субкультивированию в течение 1 ч, 1,5 ч или 2 ч, приводило к более низкому количеству бляшек, чем при добавлении E. coli , субкультивируемой в течение 2,8 ч и более. Кроме того, количественное определение бляшек стабилизировалось на уровне ~1 x 10⁹ pfu/мл при субкультивировании E. coli в течение 2,8–16 ч (в течение ночи), что было примерно в 5 раз больше по сравнению со значением, рассчитанным на основе субкультуры через 1 ч (~2 x 10⁸ pfu/мл) (рис. 3A). Вместо субкультивирования целевые бактерии могут быть инокулированы в мягкий агар из ночных культур. При этом объем 16-часовой (в течение ночи) культуры E. coli , которая была инокулирована в мягкую агаровую бляшку, имеет значение (рис. 3B). Эти результаты указывают на то, что плотность кишечной палочки в агаре может влиять на количество бляшек. В обоих подходах результаты количественного определения фагов оставались на одном и том же значении (^10,9 КОЕ/мл), что позволяет предположить, что бактерии-мишени должны иметь достаточно высокую плотность в мягком агаре, чтобы обеспечить точность подсчета бляшек.

Взятые вместе, эти результаты подчеркивают важность развития понимания кинетики фаговых бактерий с помощью пилотных экспериментов in vitro и in vivo перед выполнением экспериментальных манипуляций.

figure-results-1
Рисунок 1: Подготовка фаговых лизатов. (A) Рабочий процесс для запуска лизата фага из запаса фагов с высоким титром. Лизаты размножали, очищали, концентрировали, удаляли эндотоксины. Загрязняющий 1-октанол удаляли с помощью скоростного вакуума. (B) Эндотоксины количественно определяли в фаговых и транспортных лизатах с использованием набора для количественного определения хромогенных эндотоксинов. Пунктирными синими линиями обозначены верхняя и нижняя границы, чтобы опровергнуть ингибирование продукта при контроле ингибирования продукта (0,5 EU/мл ± 25%). Каждая точка представляет собой одну из двух технических копий. Высота столбца представляет собой среднее значение по репликам. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этого рисунка.

figure-results-2
Рисунок 2: Генерация моноколонизированных мышей и мониторинг уровней фагов и бактерий в фекальных гранулах. (A) Рабочий процесс колонизации безмикробных мышей одним видом бактерий и генерация моноколонизированных мышей F1 и F2. (Б-Е) Уровни фага Т4 и кишечной палочки обнаружены в фекальных гранулах мышей линии C57BL/6, которые родились моноколонизированными кишечной палочкой и были инокулированы фагом Т4 в возрасте 6-8 недель. На 0-е сутки (до колонизации) и в указанные дни после колонизации уровни фагов Т4 измеряли методом точечного покрытия и бляшек методом одиночного агарового слоя. Уровни E. coli измеряли методом точечного покрытия на 1,5% LB-агаре. (В, В) Кинетика уровней (B) Т4 фага и (C) E. coli в восстановленных фекальных гранулах после инокуляции 2 x 10⁶ pME фага Т4 или транспортного лизата (нормализовано по объему и уровням эндотоксина). (Г, Д) (D) Уровни фага Т4 и (E) кишечной палочки в восстановленных фекальных гранулах после инокуляции 2 x 10² pfu, 2 x 10⁴ pfu или 2 x 10⁶ pfu фага T4. Столбцы погрешности представляют собой среднее значение и стандартную ошибку среднего значения (SEM). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этого рисунка.

figure-results-3
Рисунок 3: Точность поиска и устранения неисправностей при анализе бляшек. (A) Титр лизата фага Т4 с использованием ночных культур или субкультур E. coli для приготовления мягкого агара (0,5% агар, LB). Субкультуры проводили с использованием разведения ночной культуры E. coli в соотношении 1:50 в свежий LB. 5 мл препаратов мягкого агара высевали 100 мкл E. coli и 20 мкл фага Т4. CaCl₂ и MgSO₄не добавлялись к мягкому агару для этих тестов, но могут быть добавлены при желании. Субкультура E. coli менее 2,8 ч приводила к более низкому явному титру фагов. (B) Титр лизата фага Т4 с использованием различных плотностей E. coli в приготовлении мягкого агара. Добавление различных объемов E. coli из ночной культуры (не субкультуры, как в А) в мягкий агар приводило к различным видимым титрам фагов. Столбцы погрешности представляют собой вычисленную неопределенность титра фага. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этого рисунка.

Обсуждение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Изучение фагов в микробиоме представляет собой серьезную проблему по сравнению с их бактериальными аналогами. В частности, фаги не содержат консервативного филогенетического маркера, общего для всех фагов, сходного с 16S и 18S рибосомными субъединицами, которые позволяют легко секвенировать и идентифицировать прокариотические и эукариотические виды,^{соответственно.} Тем не менее, с развитием подходов к секвенированию следующего поколения, включая увеличение длины чтения, пропускной способности и снижение затрат, происходит быстрое расширение баз данных геномов бактериофагов 42,43,44. Благодаря тому, что в настоящее время ведется большая работа по открытию фагов, исследования фагов стали более доступными, чем когда-либо. Являясь ключевыми членами микробиома кишечника и самыми генетически разнообразными организмами на Земле, фаги представляют собой захватывающий угол для новых исследований, изучающих сложность микробиома. Описанные здесь протоколы сосредоточены на исследовании известных видов фагов у мышей, колонизированных бактериями-мишенями. Следует отметить, что эти протоколы служат ориентиром для изучения фагов in vivo и могут быть расширены по мере развития этой области.

Исследования бактериофагов для терапевтического лечения бактериальных инфекций в значительной степени вышли из моды с появлением антибиотиков в 1940-х годах. Тем не менее, чрезмерное назначение и неправильное использование антибиотиков ускорило появление патогенов с множественной лекарственной устойчивостью в качестве одной из^{основных проблем общественного} здравоохранения3. Фаги представляют собой привлекательную потенциальную альтернативу антибиотикам из-за их высокой степени специфичности хозяина³. Важно отметить, что, поскольку фаги естественным образом становятся членами микробиома кишечника человека, необходимо сначала понять, какую роль фаги играют в этих сложных средах. Несмотря на то, что во многих исследованиях изучались взаимоотношения между фагом и его бактериями-мишенями in vitro, важно учитывать, как эти отношения могут сохраняться в ландшафте желудочно-кишечного тракта. Как и в поисковых исследованиях, изучающих бактериальные компоненты микробиоты, упрощенные мышиные модели, такие как GF и моноколонизированные мыши, позволяют нам изолировать влияние фага на его целевые виды и то, как эта взаимосвязь способствует иммунному ответу. Это важный шаг на пути к фаговой терапии, так как некоторые фаги могут не принести пользы при введении в кишечник. Например, фаг Pseudomonas aeruginosa Pf4 усугубляет заболевание, вызываемое его хозяином, ингибируя как антибактериальный иммунный ответ, так и миграцию кератиноцитов, что приводит к нарушению заживления ран^18,45. Описанные здесь процедуры направлены на стандартизацию методов изучения фагов как членов микробиоты мышей. Перекликаясь с новаторскими исследованиями, изучающими влияние микробиоты на многоклеточного хозяина, продолжение исследований фагов в контексте микробиоты может оказаться захватывающим и значимым для более широкого понимания мультибиома⁴⁶.

Ограничения
Описанные здесь протоколы были оптимизированы для изучения конкуренции между фагом Т4 и его бактерией-мишенью E. coli, когда фаг Т4 вводится через пероральный зонд моноколонизированным мышам E. coli. Как и бактерии, различные виды фагов ведут себя по-разному, имея различное время репликации, размеры всплесков и диапазоны бактериальных мишеней⁴⁷. Поэтому при исследовании других фаго-бактериальных пар на аналогичных животных моделях следует позаботиться об оптимизации этих протоколов на всех этапах. Например, фагам с более длительным временем репликации и/или меньшим размером всплеска может потребоваться более длительная инкубация с бактериальной мишенью для производства лизата с высоким титром. Аналогичным образом, может потребоваться увеличить время инкубации планшетов для анализа бляшек. Кроме того, фагам с коротким временем репликации и/или большим размером серии может потребоваться более короткая инкубация планшетов, так как ночная инкубация может привести к разрастанию бляшек. Если условия размножения неизвестны для конкретного интересующего фага, то перед началом работы in vivo ⁴⁸ должна быть создана основа для определения условий роста.

Ig-подобные домены, обнаруженные в белках капсида Hoc фага Т4, облегчают адгезию кишечной слизи¹¹. В зависимости от слизистой способности выбранного фага кинетика уровней фаговых бактерий в образцах фекалий может отличаться от результатов, показанных на рисунке 2B-E. Например, в системах «кишечник-на-чипе» было показано, что фаг, содержащий интактные белки Hoc, обладает повышенной способностью убивать E. coli по сравнению с Hoc-дефицитным фагом¹¹. Хотя есть подозрение, что фаги Т4 удерживаются за счет связывания слизи in vivo 11,12,13, нельзя исключать влияние повторной инокуляции через копрофагическое поведение мышей. Эти эффекты можно уменьшить, используя днища проволочных клеток или часто меняя сепараторы. Поскольку Ig-подобные домены не были идентифицированы в мцДНК или РНК-фагах⁴⁹, будет интересно выделить другие стратегии, используемые фагами для удержания в слизистой оболочке кишечника.

Наконец, в этих поисковых исследованиях изучалось взаимодействие фагов, бактерий и хозяина только при гомеостазе. В животных моделях болезней человека неизвестно, как изменения целостности кишечного барьера, например, при ВЗК, могут влиять на эти взаимодействия. Недавние исследования показали, что фаги Caudovirales обладают повышенным богатством и разнообразием у пациентов с ВЗК ^7,8. На мышиных моделях было показано, что непрерывное лечение фагами усугубляло экспериментальный колит, индуцированный декстраном сульфатом натрия (DSS)⁸. Еще предстоит определить, как взаимодействие фаг-бактерия-хозяин проявляется в воспалительной среде, и способствует ли нарушение целостности барьера воспалению, индуцированному фагами.

Устранение неполадок и альтернативные методы

Модели мышей
Моноколонизированные мышиные модели позволяют исследовать физиологию хозяина одного вида бактерий¹⁶. Исследования с участием моноколонизированных мышей сыграли решающую роль в выяснении того, как микробиота влияет на иммунную систему²². В качестве модельной системы моноколонизированные мыши не повторяют физиологию своих обычных собратьев из микробиоты. Более похожие на мышей GF, мыши с моноколонизацией E. coli имеют сниженную выработку слизи (аналогично мышам GF⁵⁰) и незрелую иммунную систему²³. Тем не менее, моноколонизированные мыши сыграли неоценимую роль в разгадке микробно-специфического влияния отдельных видов на желудочно-кишечный тракт и развитие иммунитета. Классическим примером является открытие того, что сегментированные нитевидные бактерии (SFB) являются мощными индукторами CD4⁺ Т-хелперов 17 у мышей²⁴. Что касается слизи, то существуют микробно-специфические эффекты на транскрипцию генов слизи⁵¹и толщину слизи⁵⁰. Несмотря на ограниченность, моноколонизированные мыши дают возможность исследовать влияние одной пары фаг-бактерия на млекопитающего-хозяина в контролируемой модели. Важно отметить, что фаги можно и нужно исследовать в контексте сложной микробиоты. На момент написания этой статьи было проведено несколько исследований, посвященных влиянию фагового хищничества на комменсальные виды бактерий в пределах обычного микробиома. Это будущее применение протоколов, представленных в этой статье, которое может быть адаптировано для облегчения этих исследований.

Использование соответствующих органов управления транспортным средством
В любом эксперименте необходимы надлежащие средства контроля. Здесь было определено подходящее средство для перорального введения мышам, которое контролирует многоступенчатую очистку и очистку лизатов фагов Т4. Важным требованием является то, что средство контроля содержит такой же уровень бактериальных эндотоксинов, как и лизат фага, для контроля любого иммунного ответа, опосредованного эндотоксинами. Хлороформ и 1-октанол добавляются к лизату в процессе очистки и впоследствии удаляются. Для контроля потенциальных иммунных реакций, которые могут быть вызваны следовыми уровнями этих химических веществ, в качестве средства контроля может быть произведен бесфаговый бактериальный лизат. Фаговые и транспортные лизаты Т4 содержали очень низкую концентрацию бактериальных эндотоксинов, значительно ниже уровней, допустимых в питьевой воде²⁵ (рис. 1B). Могут быть использованы альтернативные элементы управления, которые могут быть изменены в соответствии с предполагаемым исследовательским вопросом. Проще всего, можно использовать фаговый буфер, содержащий эквивалентное количество эндотоксина, хотя это не учитывает многоступенчатые процессы очистки и очистки. Gogokhia et ^al.8сообщили об использовании термоинактивированного фага в качестве контроля того, достаточен ли фаговый белок без ДНК для вызова иммунного ответа. В наших руках термоинактивированный фаг имел более низкие уровни эндотоксина, чем лизат фага Т4 (рис. 1B), и поэтому не использовался для контроля уровня эндотоксинов в этом исследовании. Тем не менее, мы рекомендуем протестировать оба протокола, чтобы определить, какой метод наиболее подходит для отдельных экспериментальных целей. Если носитель и лизаты фага Т4 значительно различаются по количеству присутствующего эндотоксина, лизат, содержащий более низкие уровни, может быть дополнен очищенным эндотоксином. 1-Октанол добавляется к лизатам в процессе очистки, но инактивирует набор для количественного определения хромогенных эндотоксинов. Важно проверить ингибирование продукта потенциально мешающими веществами в образце, чтобы убедиться в точности измерений эндотоксина. Если есть подозрение на ингибирование продукта, возможно, что образец не был пропылесован достаточно долго. Если проблемы сохраняются, диализ может быть использован для удаления оставшегося 1-октанола²⁵.

Способ применения и доза
Из-за способности фага Т4 связывать слизь, мышиным моделям вводили однократную пероральную дозу через зонд. Целью этого исследования было наблюдение за продолжительностью совместного проживания фагов и кишечной палочки в желудочно-кишечном тракте; Однако сообщалось о других подходах к изучению фагов in vivo. Например, питьевая вода, обогащенная фагами, использовалась для обеспечения непрерывного снабжения мышей^фагами ^8,20. Преимущество этого метода введения заключается в том, что фаги постоянно пополняются, даже при отсутствии бактериального хозяина, как это было продемонстрировано Gogokhia et al.⁸. Этот дизайн эксперимента позволил оценить иммунный ответ на фаги в отсутствие бактерий и обеспечил непрерывную иммунную стимуляцию в течение всего эксперимента. С физиологической точки зрения, этот метод не представляет собой естественное течение фаговой инфекции или фаговой колонизации кишечной среды, но он дает важную информацию о том, как повторное воздействие фагов может стимулировать иммунную систему. Это имеет значение в контексте развития фаготерапии, так как фаговые коктейли могут вводиться в качестве курса лечения кишечных бактериальных инфекций, аналогично схемам антибиотикотерапии. В контексте пары Т4-фаг-кишечная палочка было определено, что снижение дозы фага Т4, применяемого перорально моноколонизированным мышам, не изменяло уровни фекальных фагов или бактерий (рис. 2D, E). Таким образом, в данном случае инокуляционная доза фага Т4 не имеет решающего значения для поддержания стабильной колонизации Т4-фага-Е. в кишечнике биколонизированных мышей. Отмечается, что самая низкая введенная доза составила 200 КОЕ/мышь, а самая высокая доза составила 2 x 10,6 КОЕ/мышь (по данным Hsu et al.) ². Таким образом, данные, подтверждающие кинетику T4 фага-E. coli за пределами этого диапазона, в данном исследовании отсутствуют.

Титры точечных и цельных пластинчатых фагов
Для измерения уровней фагов Т4 в фекалиях и тканях протоколы, изложенные здесь, полагаются на методы точечного покрытия, а не на анализы целых пластинчатых бляшек, что может способствовать вариабельности уровней фагов у мышей (рис. 2B). При использовании целых пластин бляшки подсчитываются на большей площади, что позволяет проводить более точную количественную оценку. Тем не менее, соответствующее разбавление каждого образца, как правило, должно быть заранее определено с помощью точечного покрытия. Поскольку пробы анализировались в день отбора проб, точечное покрытие было признано наиболее подходящим методом для более высокопроизводительного подхода. Поэтому разрешение этих данных наиболее точно представлено порядком величины фага в каждом образце. Для точных измерений фагов существуют дополнительные рекомендации для каждого фага. Более точные измерения могут быть получены с помощью целых планшетных анализов или путем использования меньших диапазонов последовательного разведения для каждого образца. Если эти методы по-прежнему приводят к вариабельному количеству фагов или бактерий-мишеней, было бы разумно оценить, могут ли уникальные взаимодействия между фагом и бактериями объяснить различия между отдельными мышами с помощью метагеномного секвенирования или других методов экспериментальной оценки коэволюции и резистентности. Согласно Bonilla et ^al.25, при приготовлении мягкого агара для анализа бляшек важно соответствовать количеству добавленного бактериального хозяина²⁵. Как показано на рисунке 3, даже относительно небольшие изменения во времени культивирования бактерий (рис. 3A) и плотности (рис. 3B) могут повлиять на точность анализа бляшек. Эти результаты могут отличаться для других пар фаг-бактерии, и аналогичные эксперименты рекомендуются при работе с новыми организмами. Кроме того, для новых пар фаг-бактерии следует провести поисковые эксперименты для определения ростовых характеристик каждой из них. Например, кривые роста могут быть выполнены для определения запаздывающей, экспоненциальной и стационарной фаз, а также скорости роста бактерий. Одноэтапный эксперимент по росту может быть использован для определения латентного периода (времени до лизиса) и размера всплеска (количества фагов, высвобождаемых при лизисе бактерий) фагов^52,53.

Альтернативное измерение фагов Т4 методом кПЦР
Количественная оценка фага может быть проведена с помощью бляшечного анализа, как описано выше, или с помощью количественной полимеразной цепной реакции (кПЦР). Эти два подхода имеют важное различие: бляшечные анализы определяют количество жизнеспособных фагов, способных инфицировать и убивать своих бактериальных хозяев, в то время как кПЦР количественно определяет фаг-специфичный генетический материал (в качестве косвенного показателя количества присутствующих фагов), но не дает информации о жизнеспособности и инфекционности фага. Для сравнения количественной оценки копий фаговых генов с бляшками, образующимися при анализе бляшек с использованием праймеров, описанных Hsu et ^al.2 (рис. 4). ДНК фага Т4 выделяли и амплифицировали из содержимого слепой кишки мышей, биколонизированных фагом Т4/E. coli . У большинства мышей кПЦР и бляшки выявили сходные уровни фага Т4 в содержимом слепой кишки (рис. 4A, B). Несмотря на то, что некоторая амплификация была обнаружена в содержимом слепой кишки, привитой транспортным средством, расчетные копии генов/г были ниже предела обнаружения (LOD) (рис. 4A). Отсутствие количественно поддающегося количественному определению фага в этих образцах было подтверждено методом гель-электрофореза. Продукты фагового гена Т4 (96.н.) были легко визуализированы в ДНК, выделенной из содержимого слепой кишки мышей, привитых Т4, но отсутствовали в контрольной группе (рис. 4C).

В этих тестах копии фагового гена Т4 были обнаружены в содержимом слепой кишки одной мыши, колонизированной фагом Т4, методом кПЦР (рис. 4А, стрелка), несмотря на невозможность обнаружить Т4 в анализах бляшек из того же образца (рис. 4Б, стрелка). Эти результаты свидетельствуют о том, что вирусные частицы, которые не образуют бляшек, могут возникать in vivo либо из-за производства дефектных вирусных частиц, либо из-за коэволюции фагов и/или бактерий. Методы бактериального покрытия твердого агара могут быть использованы для определения восприимчивости фекальных бактерий к фагу¹⁴. Мы предполагаем, что кПЦР-опосредованное обнаружение может быть ценным дополнением к рабочим процессам фагов in vivo , поскольку оно может быть более устойчивым к эволюции фагов в кишечной среде, учитывая, что оно нацелено на короткие, консервативные последовательности генов. Непредвзятые подходы, такие как метагеномика, ценны для изучения коэволюции фагов и бактерий и относительной численности, но в конечном итоге могут быть более дорогостоящими.

figure-discussion-1
Рисунок 4: Обнаружение фага Т4 методом кПЦР. (A,B) Т4-фаговую нагрузку измеряли с помощью (A) абсолютной кПЦР или (B) анализа бляшек в содержимом слепой кишки мышей C57BL/6, колонизированных E. coli, на 29-й день после инокуляции фагом или носителем Т4. Стрелка показывает результаты, полученные от отдельных мышей, у которых были обнаружены копии генома Т4, но не было плякуируемого вируса в содержимом слепой кишки. (C) Гель-электрофорез продуктов ПЦР, показывающий наличие полосы 96.о. в образцах слепой кишки, выделенных фагом Т4, но не в образцах, инокулированных в транспортные средства. Использовалась 100-.н. ДНК-лестница. LOD = предел обнаружения. Полосы погрешности обозначают среднее значение и SEM. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Приложений
Бактериофаги составляют более 90% вирусоподобных частиц, присутствующих в микробиоме⁴⁴; Однако влияние фагов на микробиом кишечника плохо изучено. Первоначальные исследования, изучающие бактериальный компонент микробиома, были проведены путем выделения определенных видов и изучения их влияния на иммунное созревание^22,24. Подобные исследования фагеома представляют собой сложную, но необходимую задачу и требование для получения всестороннего понимания мультибиома⁴⁶. В то время как основное внимание в разработке фаговой терапии, как правило, направлено на лечение септических бактериальных инфекций, важно понимать, как добавление фагового коктейля в желудочно-кишечный тракт может изменить экосистему кишечника. Кроме того, безопасность терапевтических фаговых коктейлей должна оцениваться путем формирования иммунного профиля. Фаги были исследованы в качестве потенциальных методов лечения кишечных бактериальных инфекций, таких как C. difficile⁵ и Salmonella enterica serovar Typhimurium⁵⁴. Недавние исследования также продемонстрировали, что БПФ столь же или более эффективны при лечении некротизирующего энтероколита у^{недоношенных} свиней9, что позволяет предположить, что вирусный компонент трансплантации фекальной микробиоты (ТФМ) может играть активную роль в снижении заболеваемости. Продолжение исследований, изучающих роль фагов в микробиоме, необходимо для дальнейшего развития фаговой терапии против кишечных патогенов, а также для лучшего информирования о ТФМ в качестве лечения заболеваний. Стандартизация методов изучения фагов in vivo повысит прозрачность и воспроизводимость фаговых исследований, а также даст рекомендации для тех, кто распространяет свою работу на мышиные модели.

Раскрытие информации

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Авторам нечего раскрывать.

Благодарности

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Авторы признают, что земля, на которой они проводили это исследование, является традиционной, исконной и незаселенной территорией народа xwməθkwəy̓əm (Musqueam). Земля, на которой он расположен, всегда была местом обучения для народа Маскеам, который на протяжении тысячелетий передавал свою культуру, историю и традиции из поколения в поколение на этом месте. Мы призываем других узнать больше о родных землях, в которых они живут и работают в https://native-land.ca. Авторы выражают признательность за поддержку со стороны Совета по естественным наукам и инженерным наукам Канады (NSERC) Canadian Graduate Scholarships - Master's (N.P.), Michael Smith Health Research BC Trainee Award (RT-2023-3174, to MH), Программы грантов на открытие Совета по естественным наукам и инженерным исследованиям Канады (NSERC) (RGPIN-2019-04591 для C.T., RGPIN-2016-04282 для LCO), Канадского института перспективных исследований / Люди и микробиом (FL-001253 Appt 3362, Премия Фонда Майкла Смита (Michael Smith Foundation for Health Research Scholar Award) (18239, C.T.), Канадских институтов исследований в области здравоохранения (PJT-159458 LCO) и Канадского фонда инноваций (34673 для LCO и 38277 для CT). Мы благодарны за техническую поддержку со стороны Центра моделирования заболеваний UBC и ubcFLOW, который поддерживается Инициативой биологической устойчивости UBC GREx, а также членам лабораторий Осборна и Тропини за критическое обсуждение и оценку рукописи. Рисунки 1А и 2А были созданы с помощью Biorender.com.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
Имя	Компания	Каталожный номер
1-октанол (99%)	Thermofisher	CAAAA15977-AP
50 мл PES Steriflip Стерильные одноразовые вакуумные фильтрующие блоки	Millipore Sigma
Агароза (класс Low-EEO/Multi-Purpose/Molecular Biology)	Биореактивы Fisher	BP160-500
Amicon® 100kDa Ultra-15 центробежный фильтрующий устройство, Ultracel-100	Millipore Sigma	UFC910008
BD Microtainer® Трубки, SST	BD Medical	365967
BioExclusion герметичные клетки (ISO cages)	Techiplast	1245ISOCAGE
C1000 Touch™ Термоамплификатор с 96-луночным модулем быстрой реакции	BioRad	1851196
дигидрат хлорида кальция (белые кристаллы в порошок)	Fisher BioReagents	BP510-500
Cap Locks для пробирки 1,5 мл 100/уп	Andwin Scientific
Хлороформ (этанол в качестве консерванта/сертифицированный ACS)	Fisher	C298-500
Стальные бусины с медным покрытием (4,5 мм)	Crosman Corporation	0767
DNeasy Blood & Набор салфеток (50)	Thermo Scientific	69504
DreamTaq Green PCR Master Mix (2X)	Thermo Scientific	K1081
Этилендиаминтетрауксусная кислота (ЭДТА) раствор динатриевой соли, для молекулярной биологии, 0,5 М в H2O	Sigma Aldrich	E7889
Fisher BioReagents&торговля; Агар, порошок / хлопья, биореагенты Fisher и торговля;	Биореагенты Fisher	BP1423-500
Биореагенты Fisher и торговля; Микробиологические среды: LB бульон (порошок) - Lennox	Биореагенты Fisher	BP1427-500
GeneRuler 100 bp DNA Ladder	Thermo Scientific	SM0241
Green FastMix® qPCR mix, 1250 rxns	QuantaBio	95072-012
HEPA фильтры для изокажных крышек, АВТОКЛАВИРУЕМЫЕ H14 ФИЛЬТРЫ ДЛЯ ISO LINE- ОБЛУЧЕННЫЙ	Techiplast	UISOHEPAXTBOX-300
Сульфат магния гептагидрат	Fisher BioReagents	BP213-1
MaxQ 6000 Инкубированный шейкер	Thermo Scientific	8354-30-0009
Микробиологические среды: LB бульон (порошок) - Lennox	Fisher BioReagents	BP1427-500
Микроцентрифужные пробирки с фиксирующим защелкивающимся колпачком, 2мл	Fisher	14-666-315
Парапленочная герметизирующая пленка	Bemis	PM-996
Фаговые запасы	Carolina Biological Supply	н/д
PicoLab® Мышиный рацион 20 EXT	LabDiet	5R58
Pierce™ Набор для хромогенного эндотоксина Quant Thermo	Scientific
РНКаза А (17 500 МЕ)	Qiagen	19101
РНКаза-свободный набор ДНКазы	Qiagen	79254
Бикарбонат натрия (мелкий белый порошок)	Fisher Chemical	BP328-500
Хлорид натрия (кристаллический/сертифицированный ACS)	Ультразвуковой аппарат Fisher Chemical	S271
(модель зонда CL-18; модель источника питания FB50)	Fisher scentific	н/д
Стерильный изолятор из гибкой пленки	Класс Биологически чистый	н/д
СИБР&трейд; Безопасный ДНК гелевый морилка	Invitrogen	S33102
T100 Термический амплификатор	BioRad	1861096
Т4 фаговый праймер, прямой (CCACACATAGCGCGAGTATAA)	IDT	n/a
Т4 фаговый праймер, прямой (GAAACTCGGTCAGGCTATCAA)	IDT	n/a
TissueLyser II	Qiagen	85300
Tris-HCl, 1М раствор, pH 8,0, класс молекулярной биологии, сверхчистый	термо научный
Вода, (без ДНКАЗЫ, РНКАЗ)	Биореагенты Fisher	BP2484100

SCGP0052516812612A39552SAAJ22638AE

Ссылки

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Rohwer, F., Segall, A. M. A century of phage lessons. Nature. 528 (7580), 46-47 (2015).
Hsu, B. B., et al. Dynamic modulation of the gut microbiota and metabolome by bacteriophages in a mouse model. Cell Host & Microbe. 25 (6), 803-814.e5 (2019).
Gordillo Altamirano, F. L., Barr, J. J. Phage Therapy in the postantibiotic era. Clinical Microbiology Reviews. 32 (2), (2019).
Schooley, R. T., et al. Development and use of personalized bacteriophage-based therapeutic cocktails to treat a patient with a disseminated resistant Acinetobacter baumannii infection. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 61 (10), (2017).
Ott, S. J., et al. Efficacy of Sterile Fecal Filtrate Transfer for Treating Patients With Clostridium difficile Infection. Gastroenterology. 152 (4), 799-811.e7 (2017).
Zuo, T., et al. Bacteriophage transfer during faecal microbiota transplantation in Clostridium difficile infection is associated with treatment outcome. Gut. 67 (4), 634-643 (2018).
Norman, J. M., et al. Disease-specific alterations in the enteric virome in inflammatory bowel disease. Cell. 160 (3), 447-460 (2015).
Gogokhia, L., et al. Expansion of bacteriophages is linked to aggravated intestinal inflammation and colitis. Cell Host & Microbe. 25 (2), 285-299.e8 (2019).
Brunse, A., et al. Fecal filtrate transplantation protects against necrotizing enterocolitis. The ISME Journal. 16 (3), 686-694 (2022).
Duerkop, B. A., Clements, C. V., Rollins, D., Rodrigues, J. L. M., Hooper, L. V. A composite bacteriophage alters colonization by an intestinal commensal bacterium. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109 (43), 17621-17626 (2012).
Barr, J. J., et al. Bacteriophage adhering to mucus provide a non-host-derived immunity. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (26), 10771-10776 (2013).
Nguyen, S., et al. Bacteriophage Transcytosis provides a mechanism to cross epithelial cell layers. mBio. 8 (6), (2017).
Bichet, M. C., et al. Bacteriophage uptake by mammalian cell layers represents a potential sink that may impact phage therapy. iScience. 24 (4), 102287(2021).
Buttimer, C., et al. Impact of a phage cocktail targeting Escherichia coli and Enterococcus faecalis as members of a gut bacterial consortium in vitro and in vivo. Frontiers in Microbiology. 13, 936083(2022).
Li, Y., et al. Bacteriophages allow selective depletion of gut bacteria to produce a targeted-bacterium-depleted mouse model. Cell Reports Methods. 2 (11), 100324(2022).
Reyes, A., Wu, M., McNulty, N. P., Rohwer, F. L., Gordon, J. I. Gnotobiotic mouse model of phage-bacterial host dynamics in the human gut. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (50), 20236-20241 (2013).
Federici, S., et al. Targeted suppression of human IBD-associated gut microbiota commensals by phage consortia for treatment of intestinal inflammation. Cell. 185 (16), 2879-2898.e4 (2022).
Sweere, J. M., et al. Bacteriophage trigger antiviral immunity and prevent clearance of bacterial infection. Science (New York, N.Y.). 363 (6434), (2019).
Fluckiger, A., et al. Cross-reactivity between tumor MHC class I-restricted antigens and an enterococcal bacteriophage. Science (New York, N.Y.). 369 (6506), 936-942 (2020).
Majewska, J., et al. Induction of Phage-Specific Antibodies by Two Therapeutic Staphylococcal Bacteriophages Administered per os. Frontiers in Immunology. 10, 2607(2019).
Weiss, M., et al. In vivo replication of T4 and T7 bacteriophages in germ-free mice colonized with Escherichia coli. Virology. 393 (1), 16-23 (2009).
Thomson, C. A., Morgan, S. C., Ohland, C., McCoy, K. D. From germ-free to wild: modulating microbiome complexity to understand mucosal immunology. Mucosal Immunology. 15 (6), 1085-1094 (2022).
Al-Asmakh, M., Zadjali, F. Use of germ-free animal models in microbiota-related research. Journal of Microbiology and Biotechnology. 25 (10), 1583-1588 (2015).
Ivanov, I. I., et al. Induction of intestinal Th17 cells by segmented filamentous bacteria. Cell. 139 (3), 485-498 (2009).
Bonilla, N., et al. Phage on tap-a quick and efficient protocol for the preparation of bacteriophage laboratory stocks. PeerJ. 4, e2261(2016).
Sambrook, J., Russell, D. W. Molecular Cloning: A Laboratory Manual. 1, Cold Spring Harbor Laboratory Press. New York, NY. (2001).
Kropinski, A. M., Mazzocco, A., Waddell, T. E., Lingohr, E., Johnson, R. P. Enumeration of bacteriophages by double agar overlay plaque assay. Methods in Molecular Biology (Clifton, N.J). 501, 69-76 (2009).
Manikantha, B., Karthika, R., Murugadas, V., Vishnuvinayagam, S., Rao, B. M. Comparison of the single agar and double agar layer methods for enumeration of bacteriophages. Fishery Technology. 59, 60-63 (2022).
Sanders, E. R. Aseptic laboratory techniques: plating methods. Journal of Visualized Experiments. 63, e3064(2012).
Louten, J. Chapter 7 - Detection and diagnosis of viral infections. Essential Human Virology. , 111-132 (2016).
Richter, Ł, et al. Adsorption of bacteriophages on polypropylene labware affects the reproducibility of phage research. Scientific Reports. 11 (1), 7387(2021).
Merck KGaA. Amicon Ultra-15 Centrifugal Filter Devices. , Darmstadt, Germany. https://www.emdmillipore.com/CA/en/product/Amicon-Ultra-15-Centrifugal-Filter-Unit,MM_NF-UFC901024#documentation (2018).
Hecker, W., Witthauer, D., Staerk, A. Validation of dry heat inactivation of bacterial endotoxins. PDA Journal of Pharmaceutical Science and Technology. 48 (4), 197-204 (1994).
Jakočiūnė, D., Moodley, A. A Rapid bacteriophage DNA extraction method. Methods and Protocols. 1 (3), 27(2018).
Zucoloto, A. Z., Yu, I. L., McCoy, K. D., McDonald, B. Generation, maintenance, and monitoring of gnotobiotic mice. STAR Protocols. 2 (2), 100536(2021).
Ng, K. M., et al. Single-strain behavior predicts responses to environmental pH and osmolality in the gut microbiota. mBio. 14 (4), e0075323(2023).
McCallum, G., Tropini, C. The gut microbiota and its biogeography. Nature Reviews. Microbiology. , (2023).
Bergstrom, K., Xia, L. The barrier and beyond: Roles of intestinal mucus and mucin-type O-glycosylation in resistance and tolerance defense strategies guiding host-microbe symbiosis. Gut Microbes. 14 (1), 2052699(2022).
Askar, M., Ashraf, W., Scammell, B., Bayston, R. Comparison of different human tissue processing methods for maximization of bacterial recovery. European Journal of Clinical Microbiology & Infectious Diseases. 38 (1), 149-155 (2019).
Redanz, S., Podbielski, A., Warnke, P. Improved microbiological diagnostic due to utilization of a high-throughput homogenizer for routine tissue processing. Diagnostic Microbiology and Infectious Disease. 82 (3), 189-193 (2015).
Bhinder, G., et al. The Citrobacter rodentium mouse model: studying pathogen and host contributions to infectious colitis. Journal of Visualized Experiments. 72, e50222(2013).
Reyes, A., Semenkovich, N. P., Whiteson, K., Rohwer, F., Gordon, J. I. Going viral: next-generation sequencing applied to phage populations in the human gut. Nature Reviews Microbiology. 10 (9), 607-617 (2012).
Camarillo-Guerrero, L. F., Almeida, A., Rangel-Pineros, G., Finn, R. D., Lawley, T. D. Massive expansion of human gut bacteriophage diversity. Cell. 184 (4), 1098-1109.e9 (2021).
Reyes, A., et al. Viruses in the faecal microbiota of monozygotic twins and their mothers. Nature. 466 (7304), 334-338 (2010).
Bach, M. S., et al. Filamentous bacteriophage delays healing of Pseudomonas-infected wounds. Cell Reports. Medicine. 3 (6), 100656(2022).
Filyk, H. A., Osborne, L. C. The multibiome: The intestinal ecosystem's influence on immune homeostasis, health, and disease. EBioMedicine. 13, 46-54 (2016).
Rohwer, F., Merry, Y., Maughan, H., Hisakawa, N. Heather Life in Our Phage World: A Centennial Field Guide to the Earth's Most Diverse Inhabitants. Wholon. , San Diego. (2014).
Glonti, T., Pirnay, J. P. In Vitro techniques and measurements of phage characteristics that are important for phage therapy success. Viruses. 14 (7), 1490(2022).
Fraser, J. S., Yu, Z., Maxwell, K. L., Davidson, A. R. Ig-like domains on bacteriophages: a tale of promiscuity and deceit. Journal of Molecular Biology. 359 (2), 496-507 (2006).
Li, H., et al. The outer mucus layer hosts a distinct intestinal microbial niche. Nature Communications. 6, 8292(2015).
Bergström, A., et al. Nature of bacterial colonization influences transcription of mucin genes in mice during the first week of life. BMC Research Notes. 5, 402(2012).
Adams, M. H. Bacteriophages. , Interscience Publishers. https://books.google.co.uk/books?id=3wVrAAAAMAAJ (1959).
Kutter, E., Sulakvelidze, A. Bacteriophages: Biology and Applications. , CRC Press. https://books.google.co.uk/books?id=flHOvAEACAAJ (2004).
Bao, H., et al. Dysbiosis and intestinal inflammation caused by Salmonella Typhimurium in mice can be alleviated by preadministration of a lytic phage. Microbiological Research. 260, 127020(2022).

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на повторное использование текста или иллюстраций этой статьи JoVE

Запросить разрешение

Взаимодействие бактериофага Т4 и кишечной палочки в кишечнике мышей: прототипная модель для изучения динамики бактериофагов хозяина in vivo

В этой статье

Краткое содержание

Аннотация

Введение

Протокол

Результаты

Обсуждение

Раскрытие информации

Благодарности

Материалы

Ссылки

Перепечатки и разрешения

Теги

Похожие статьи