Методическая статья

Оптимизация культуры эпителиальных клеток первичного хрусталика мыши: подробное руководство по трипсинизации

DOI:

10.3791/65912

⸱

21 июня 2024 г.

 ,  , 
1Pharmaceutical Sciences, College of Pharmacy, University of North Texas Health Science Center, 2North Texas Eye Research Institute, University of North Texas Health Science Center

* These authors contributed equally

В этой статье

Краткое содержание

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

В этой рукописи описывается подробный видеопротокол культивирования первичных эпителиальных клеток хрусталика (LEC), направленный на улучшение воспроизводимости и помощь в исследованиях катаракты и помутнения задней капсулы (ПКЯ). Он предлагает пошаговые инструкции по препарированию хрусталика, изоляции и валидации LEC, что служит ценным руководством, особенно для новичков в этой области.

Аннотация

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Эпителиальные клетки хрусталика (LEC) играют несколько важных ролей в поддержании гомеостаза и нормального функционирования хрусталика. LEC определяют рост, развитие, размер и прозрачность хрусталика. И наоборот, дисфункциональные ЛЭК могут привести к образованию катаракты и помутнению задней капсулы (ПКЯ). Следовательно, создание надежной системы первичного культивирования LEC важно для исследователей, занимающихся разработкой хрусталиков, биохимией, терапией катаракты и профилактикой ПКЯ. Тем не менее, культивирование первичных ЛЭК уже давно представляет собой проблему из-за их ограниченной доступности, медленной скорости распространения и деликатного характера.

Данное исследование направлено на устранение этих препятствий путем представления комплексного протокола для первичной культуры LEC. Протокол включает в себя такие важные этапы, как разработка оптимизированной питательной среды, точная изоляция капсул хрусталика, методы трипсинизации, процедуры субкультуры, протоколы сбора урожая и рекомендации по хранению и транспортировке. На протяжении всего процесса культивирования морфологию клеток контролировали с помощью фазово-контрастной микроскопии.

Для подтверждения подлинности культивируемых ЛЭК были проведены иммунофлуоресцентные анализы для выявления наличия и субклеточного распределения критических белков хрусталика, а именно αA- и γ-кристаллинов. Этот подробный протокол предоставляет исследователям ценный ресурс для культивирования и характеристики первичных ЛЭК, что позволяет продвинуться в понимании биологии хрусталика и разработке терапевтических стратегий для расстройств, связанных с хрусталиком.

Введение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Хрусталик глаза играет решающую роль в зрении, фокусируя входящий свет на сетчатке. Он состоит из прозрачной аваскулярной структуры, состоящей из специализированных клеток, среди которых ключевыми игроками являются эпителиальные клетки хрусталика (LEC). ЛЭК располагаются на передней поверхности хрусталика и отвечают за поддержание его прозрачности, регулирование водного баланса и участие в росте и развитии хрусталика 1,2. LEC — это уникальный тип клеток, расположенных в передней части хрусталика, играющих важнейшую роль в поддержании четкости и функции хрусталика путем непрерывного производства волокон хрусталика на протяжении всей жизни.

Катаракта характеризуется прогрессирующим помутнением хрусталика, что приводит к искажению и рассеянию света, что приводит к ухудшению зрения 3,4. Точные механизмы, лежащие в основе образования катаракты, сложны и многофакторны, включая различные клеточные и молекулярные процессы, такие как ультрафиолетовое излучение, окислительное повреждение и гликирование 5,6. Было обнаружено, что LEC вносят значительный вклад в развитие катаракты, что делает их жизненно важным объектом исследований 1,2,7,8,9.

Кроме того, одной из наиболее актуальных проблем в офтальмологии на сегодняшний день является относительно высокая частота помутнения задней капсулы (СПКЯ), также известной как вторичная катаракта. ПКЯ остается наиболее распространенным осложнением после операции по удалению катаракты, поражая до 20-40% взрослых пациентов и 100% детей в течение 5 лет после операции10. ПКЯ в первую очередь вызывается остаточными ЛЭК, которые остаются в капсульном мешке после экстракции катаракты. Эти клетки претерпевают многогранную патофизиологическую трансформацию, включающую не только эпителиально-мезенхимальный переход (ЭМП), но и дифференцировку ЛЭК в волокна хрусталика, в результате чего образуется клеточная популяция, представляющая собой смесь ЛЭК, волокон и миофибробластов 11,12,13. Трансформированные клетки пролиферируют и мигрируют через заднюю капсулу хрусталика, что приводит к ухудшению зрения. Понимание поведения и механизмов контроля LEC в культуральных моделях может дать ценную информацию о профилактике и лечении ПКЯ. Таким образом, этот протокол культивирования LEC представляет собой жизненно важный инструмент для офтальмологических исследователей, стремящихся изучить, понять и, в конечном счете, бороться с этим распространенным послеоперационным осложнением.

Чтобы разобраться в хитросплетениях биологии LEC и ее роли в формировании катаракты и ПКЯ, необходимо создать надежные и воспроизводимые системы первичных клеточных культур in vitro . Первичная культура LEC предоставляет исследователям контролируемую среду для изучения функций, сигнализации и молекулярных характеристик LEC. Кроме того, он позволяет исследовать клеточные процессы и эффекты различных экспериментальных условий, предоставляя ценную информацию о физиологии и патологии хрусталика.

Предыдущие исследования обогатили наше понимание методов культивирования LEC 14,15,16,17,18,19,20. Несмотря на то, что в этих исследованиях использовались различные методологии и были получены важные результаты о поведении и характеристиках LEC, в современной литературе отсутствует всеобъемлющий и доступный протокол видеозаписи для культивирования LEC. Это ограничение может препятствовать способности начинающих исследователей точно воспроизводить методы и может привести к несоответствиям и вариациям в экспериментальных результатах. Предоставляя протокол видеозаписи, данная исследовательская работа направлена на то, чтобы восполнить этот пробел и предоставить стандартизированный ресурс, который может повысить воспроизводимость и облегчить передачу знаний в области культуры LEC.

Протокол

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Все эксперименты на животных проводились в соответствии с рекомендациями Ассоциации исследований в области зрения и офтальмологии для использования животных в офтальмологических исследованиях и исследованиях зрения. Процедурное одобрение было предоставлено Комитетом по уходу за животными и использованию Научного центра здоровья Университета Северного Техаса (номер протокола: IACUC-2022-0008). В этих исследованиях использовали молодых мышей C57BL/6J, как правило, в возрасте до 2 недель.

1. Подготовка питательной среды и диссекция хрусталика

  1. Приготовьте питательную среду, добавив 50 мл фетальной бычьей сыворотки (FBS) и 0,1 мл гентамицина 50 мг/мл к 450 мл DMEM.
  2. Гуманная эвтаназия мышей C57BL/6J младше 2 недель.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Мы усыпляли методом ингаляцииСО2 . Оптимальная скорость потока для систем эвтаназииCO2 должна смещать от 30% до 70% объема камеры или клетки/мин.
  3. Аккуратно удалите веки хирургическими ножницами и слегка надавите изогнутым пинцетом на противоположные стороны глазницы, в результате чего глаз выпячивается наружу. Сделайте аккуратный надрез на роговице с помощью катарактального ножа и осторожно извлеките хрусталик изогнутым пинцетом, следя за тем, чтобы не повредить хрусталик или его капсулу.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Соблюдайте осторожность при выполнении этих действий, чтобы сохранить целостность капсулы хрусталика. Из-за деликатного характера линзы важно использовать препарирующие инструменты с изогнутыми и тупыми концами, чтобы свести к минимуму риск повреждения линзы.
  4. Используйте изогнутый пинцет с тупыми кончиками для переноса линз в 60-миллиметровую пластиковую чашку для культивирования тканей, наполненную 5 мл предварительно подогретого и стерильного раствора фосфатного буфера (DPBS) Dulbecco, содержащего 10 мкг/мл гентамицина.
  5. Осторожно промойте линзы раствором DPBS, содержащим 10 мкг/мл гентамицина, чтобы удалить любой потенциальный мусор или загрязнения, подготовить линзы к дальнейшей обработке и поддерживать стерильную культуральную среду.
  6. Чтобы получить достаточное количество LEC, объедините четыре линзы для 24-луночного культурального планшета и шесть линз для 6-луночного культурального планшета.

2. Изоляция LEC

  1. После завершения процесса промывки поместите линзу на лист фильтровальной бумаги, дав ей высохнуть.
  2. После того, как хрусталик достаточно высохнет, осторожно перенесите его на крышку чашки Петри, чтобы подготовиться к извлечению капсулы хрусталика.
  3. Поверните линзу вверх, убедившись, что передний сегмент направлен вверх. Используя пинцет для удержания передней капсулы, используйте щипцы капсулогексиса в доминирующей руке, чтобы создать небольшой разрыв в капсуле. Осторожно потяните два инструмента в противоположных направлениях, чтобы снять капсулу, и поместите ее в DPBS до тех пор, пока не будут завершены все вскрытия линз.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Чтобы избежать каких-либо расхождений, исследователи должны оперативно препарировать каждую эпителиальную капсулу хрусталика и временно хранить их в DPBS. Только после завершения всех вскрытий капсулы коллективно переводятся на трипсин, поддерживаемый при 37 °C, что обеспечивает синхронизированное и равномерное воздействие.
  4. Осторожно перенесите капсулу объектива на 6-луночную пластину. Добавьте 1 мл 0,05% раствора трипсина в каждую лунку, чтобы инициировать процесс ферментативного сбраживания.
  5. Осторожно перемешайте раствор трипсина, чтобы обеспечить равномерное проникновение. Поместите планшет в инкубатор для клеточных культур и дайте капсуле перевариться в течение 8-10 минут при 37 °C.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Этот этап способствует разрушению ткани капсулы хрусталика и последующему высвобождению отдельных эпителиальных клеток.
  6. После инкубации тщательно измельчите переваренную капсулу хрусталика с помощью ножниц для препарирования, чтобы разрушить оставшиеся скопления тканей и способствовать отделению клеток.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Особое внимание уделяется тщательности измельчения тканей, чтобы обеспечить эффективное высвобождение клеток из переваренных капсул хрусталика.
  7. Добавьте 0,5 мл питательной среды, содержащей 10% FBS, для гашения трипсина. Переложите образцы тканей в центрифугируемую пробирку и центрифугу при 1000 × г в течение 5 мин.
  8. Осторожно удалите надосадочную жидкость, не повредив гранулу клетки. Используйте 1 мл питательной среды для ресуспендирования клеток и посева клеток в 24-луночный планшет.
  9. Меняйте питательную среду каждые 2-3 дня.

3. Субкультура LECs

  1. Как только клетки достигнут слияния, извлеките среду из чашки для культивирования. Промойте клетки 2 раза 1 мл DPBS.
  2. Добавьте 200 мкл раствора трипсина-ЭДТА и поместите клетки в инкубатор на 5 минут.
  3. После инкубации извлеките клетки из инкубатора и осмотрите их под микроскопом, чтобы убедиться, что они отделились от чашки для культивирования и начали плавать.
  4. Добавьте 1 мл питательной среды и осторожно пропипетируйте клетки 3-5 раз, чтобы отделить все клетки.
  5. Переложите клетки в центрифужные пробирки и центрифугу при 1 000 × г в течение 5 мин.
  6. Осторожно удаляют надосадочную жидкость и ресуспендируют клетки в полной питательной среде.
  7. При необходимости подсчитайте количество клеток с помощью гемоцитометра.
  8. Разделите клеточную суспензию в соотношении 1:2 или 1:3 для целей субкультивирования.
  9. Когда культура снова станет сливающейся, повторите вышеупомянутые процедуры.
    ПРИМЕЧАНИЕ: LEC процветают в условиях высокой плотности культивирования. Избегайте чрезмерного разбавления клеток, так как это может препятствовать их росту.

4. Хранение и отгрузка

ПРИМЕЧАНИЕ: Идеальное количество ячеек для хранения ~1 × 106.

  1. Тщательно промойте клетки 3 раза 1 мл DPBS. После промывки добавляют 1 мл раствора трипсина-ЭДТА и помещают клетки в инкубатор на 5 мин.
  2. Добавьте 2 мл полной питательной среды и перенесите клеточную суспензию в центрифужную пробирку и центрифугу при 1000 × г в течение 5 мин.
  3. Выбросьте надосадочную жидкость и повторно суспендируйте клетки в замораживающей среде, состоящей из 90% FBS и 10% DMSO, стремясь к плотности клеток 1 × 106 клеток/мл. Переведите клеточную суспензию в криовиальную.
  4. Немедленно переместите ячейки в среду с температурой -20 °C на 1 час, а затем -80 °C на ночь, а затем на постоянное хранение в жидком азоте.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Если жидкий азот недоступен, ячейки можно хранить при температуре -80 °C после первого часа при -20 °C.
  5. Если требуется отгрузка, отправьте клетки в криовиальной камере в упаковке с сухим льдом для доставки в течение ночи.
  6. После получения клеток обеспечьте быстрое восстановление и поместите клетки в субкультуру. Если немедленное культивирование невозможно, пересадите клетки в жидкий азот для длительного хранения.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Если ячейки должны быть отправлены, убедитесь, что образцы глубоко погружены в сухой лед, чтобы предотвратить возможное повреждение от колебаний температуры.

5. Валидация LEC

  1. Распределите LEC в 35-миллиметровые чашки для культур с помощью защитных стекол и культивируйте их в течение примерно 48 ч.
  2. Промойте ячейки 2 раза PBS и зафиксируйте ячейки холодным метанолом в течение 10 мин при -20 °C.
  3. Промывают фиксированные клетки в течение 3 х 5 мин PBS и инкубируют фиксированные клетки с блокирующим буфером в течение 1 ч при комнатной температуре для предотвращения неспецифического связывания.
  4. После блокирования клетки инкубируют в течение ночи при 4 °C с первичными антителами (αA-кристаллин, γ-кристаллин и антитела PROX1), индивидуально разбавленными в соотношении 1:50 в буфере разбавителя.
  5. Промывают клетки в течение 3 х 5 мин PBS и инкубируют клетки со вторичными антителами, разведенными 1:100 в буфере разбавителя в течение 1 ч.
  6. Промойте клетки в течение 3 x 5 минут PBS и окрасьте клетки 5 мкг/мл Hoechst 33342 в PBS в течение 10 минут при комнатной температуре для визуализации ядер.
  7. Промывают клетки в течение 2 x 5 мин PBS, чтобы удалить излишки красящего раствора и получить флуоресцентные изображения клеток с помощью флуоресцентного микроскопа с использованием канала DAPI для ядер и канала FITC для αA-, γ-кристаллинов и PROX1.

Результаты

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Как показано на рисунке 2, следуя этому протоколу, первичные ЛЭК мышей C57BL/6J прилипали к чашкам в течение 4 ч. Примечательно, что были видны остатки других тканей, таких как срезы задней капсулы и клетки волокон хрусталика. Однако эти непредусмотренные элементы не прикреплялись к чашке и, следовательно, могли быть удалены путем смены питательной среды. Впоследствии, между третьим и пятым днем, LEC вступили в фазу распространения. Быстрый рост, характерный для логарифмической фазы пролиферации, можно было наблюдать между седьмым и десятым днем. В тех случаях, когда клетки не переходят в фазу быстрого роста, может быть целесообразно включить в питательную среду добавки для роста, такие как EpiCGS-a. Кроме того, мы наблюдали, что клетки демонстрируют более высокую скорость роста в среде, содержащей 20% FBS, по сравнению с 10% FBS. Более низкая концентрация FBS обычно способствует замедлению роста, отражая черты центрального эпителия хрусталика, в то время как 20%-ная концентрация FBS воспроизводит атрибуты пролиферативной зоны хрусталика.

Согласно Reddy et al. и Andley et al., которые разработали иммортализированную клеточную линию эпителия хрусталика человека B3, ожидается, что LEC должны экспрессировать различные хрусталиковые специфические белки, такие как αA- и γ-кристаллины 2,21. Таким образом, в этом исследовании мы использовали αA- и γ-кристаллины в качестве клеточных маркеров для подтверждения идентичности клеток как LEC. LEC в пределах первых трех проходов культивировались на стеклянных покровных стеклах. Первичные антитела, специфичные к αA- и γ-кристаллинам, использовали для инкубации клеток в течение ночи. Как показано на рисунке 3, эти клетки продемонстрировали сильную экспрессию как αA-, так и γ-кристаллинов, что является окончательным доказательством того, что они являются эпителиальными клетками, полученными из хрусталика. Кроме того, мы использовали PROX1 в качестве хорошо зарекомендовавшего себя маркера для волоконных клеток для маркировки первичных LEC. Данные показали, что эти LEC показали отрицательное окрашивание на PROX1, подтверждая, что эти клетки являются эпителиальными клетками и еще не подверглись дифференцировке в волоконные клетки.

figure-results-1
Рисунок 1: Пошаговый рабочий процесс для культуры LEC. На рисунке изображены последовательные этапы культивирования эпителиальных клеток первичного хрусталика. Шаг 1 включает в себя создание небольшого разрыва в передней капсуле. Шаг 2 заключается в аккуратном снятии капсулы хрусталика. На этапе 3 капсулу хрусталика осторожно переносят в 24-луночный планшет и инкубируют с 0,05% раствором трипсина при 37 °C в течение 10 мин. После инкубации переваренную капсулу хрусталика измельчают с помощью ножниц для препарирования, чтобы способствовать разделению клеток. Этап 4 включает в себя гашение трипсина путем добавления 0,5 мл питательной среды, содержащей 20% FBS, в центрифугирование пробирки и центрифугирование образцов тканей при 1000 × г в течение 5 мин. Шаг 5 требует ресуспендирования клеток в 1 мл питательной среды и посева их в 24-луночный планшет. Наконец, шаг 6 включает в себя смену питательных сред каждые 2-3 дня для поддержки роста и поддержания клеток на протяжении всего эксперимента. Сокращения: LECs = эпителиальные клетки хрусталика; FBS = фетальная бычья сыворотка. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этого рисунка.

figure-results-2
Рисунок 2: Динамика роста LEC с течением времени. Морфологические изменения эпителиальных клеток первичного хрусталика в различные моменты времени их роста регистрировали под фазово-контрастным микроскопом. Изображения, сделанные на 1-й, 2-й, 3-й, 5-й, 7-й и 10-й дни, отображают эволюцию морфологии клеток, давая представление о развитии и поведении эпителиальных клеток хрусталика с течением времени. Красная стрелка, указывающая на расположение активно пролиферирующих эпителиальных клеток хрусталика. Масштабные линейки = 100 мкм. Аббревиатура: LECs = эпителиальные клетки хрусталика. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этого рисунка.

figure-results-3
Рисунок 3: Валидация ЛЭК. (А) Иммуноокрашивание αА-кристаллина в ЛЭК мышей. Первичные mLEC окрашивали Hoechst 33342 (синий) и αA-кристаллиновые антитела (зеленый). (B) Иммуноокрашивание γ-кристаллина в ЛЭК мышей. (C) Иммуноокрашивание PROX1 в мышиных ЛЭК. Первичные mLEC окрашивали Hoechst 33342 (синий) и антитела PROX1 (зеленый). Масштабные линейки = 50 мкм. Аббревиатура: LECs = эпителиальные клетки хрусталика. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этого рисунка.

Обсуждение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Протокол, представленный в этом документе, представляет собой всеобъемлющее, пошаговое руководство по успешной изоляции, культуре и субкультуре первичных LEC, дополненное сопроводительной видеодокументацией. Подробное визуальное руководство вместе с письменными инструкциями повышает ясность и доступность протокола, способствуя его использованию и воспроизводимости среди исследователей в этой области. Конечная цель состоит в том, чтобы внести свой вклад в растущий объем знаний, связанных с ролью LECs в формировании катаракты и ПКЯ, распространенном осложнении после операции по удалению катаракты.

При сравнении первичных LEC с линиями клеток хрусталикового эпителия, такими как HLE-B3 и SRA01/04, каждая из них имеет уникальные преимущества и проблемы в контексте исследования. Клеточная линия HLE-B3, наряду с SRA01/04, представляет собой категорию клеточных линий, которые, будучи простыми в обращении и долговечными, часто демонстрируют генетические и фенотипические изменения из-за их непрерывной репликации и длительных условий культивирования. Это может привести к существенным отличиям от функции исходных LEC, тем самым снижая достоверность их ответов. И наоборот, первичные ЛЭК, непосредственно выделенные из живых тканей пациентов или исследовательских животных, более точно отражают естественную клеточную среду и врожденные реакции хрусталика in vivo. Несмотря на дополнительную сложность их извлечения и культивирования, им часто отдают предпочтение в исследованиях, требующих высокой физиологической значимости, поскольку они дают более точные и надежные результаты.

При следовании этому протоколу необходимо учитывать некоторые ключевые моменты. В этих исследованиях использовали молодых мышей C57BL/6J, как правило, в возрасте до 2 недель. Мы заметили, что LEC, полученные от этих молодых мышей, продемонстрировали более энергичный рост по сравнению с LEC от мышей в возрасте 2 месяцев и старше. Это указывает на отрицательную корреляцию между возрастом мышей и ростом клеток.

Вскрытие хрусталика из глаза мыши является деликатной задачей, требующей осторожного использования инструментов для препарирования для сохранения целостности хрусталика и его капсулы. Процедура, описанная в разделе 1 протокола, гарантирует, что хрусталик будет успешно извлечен с минимальными повреждениями. Несмотря на то, что поддержание здоровья и целостности капсулы хрусталика является сложной задачей, ее важность нельзя недооценивать, поскольку любое повреждение потенциально может повлиять на качество и количество выделенных LEC. Примечательно, что большинство клеточных делений обычно происходит в зародышевой зоне вблизи экваториальной области хрусталика, области, недоступной для культивирования. По данным Zetterberg et al., несмотря на то, что центральная часть эпителия хрусталика демонстрирует минимальную митотическую активность в нормальных условиях, эксперименты с использованием мечения тритированного тимидина (3H-Tdr) пометили эти клетки эпителия хрусталика как потенциальные стволовые клетки17,22. Стволовые клетки обладают отличительными характеристиками, такими как неограниченная способность к пролиферации, несмотря на низкую скорость пролиферации в стандартных условиях. Таким образом, центральная часть эпителия хрусталика может обеспечить лучшее представление о пролиферативной способности LECs, чем герминативная зона.

Изоляция LEC, как подробно описано в разделе 2 протокола, представляет собой ключевой шаг в этой экспериментальной процедуре. Интегральные действия, включая удаление капсулы хрусталика, ферментативное расщепление и фрагментацию тканей, тщательно выполняются для отделения отдельных эпителиальных клеток от капсулы. Одним из важнейших элементов в этом процессе является продолжительность расщепления трипсина. Рекомендуется установить период пищеварения от 8 до 10 минут. Если этот период сократится до менее чем 5 минут, это может привести к неполному разделению клеток. И наоборот, чрезмерное продление этого периода времени может значительно поставить под угрозу жизнеспособность клеток. Стратегический выбор использования трипсина-ЭДТА в качестве реагента для диссоциации клеток в сочетании с питательной средой DMEM, дополненной 20% FBS и гентамицином в дозе 10 мкг/мл, оптимизирует высвобождение клеток и последующую пролиферацию, снижая при этом потенциальные риски контаминации.

Антибиотики часто используются для предотвращения бактериального загрязнения во время первичных культур LEC. Однако к выбору антибиотиков следует подходить тщательно. Широко используемые антибиотики, такие как пенициллин и стрептомицин, а также противогрибковые средства, могут влиять на жизнеспособность ЛЭК. В качестве альтернативы рекомендуется использовать раствор гентамицина в концентрации 10 мкг/мл для оптимального роста ЛЭК.

Кроме того, поддержание высокой плотности клеток является еще одним решающим фактором для успешной первичной культуры LEC. В отличие от устоявшихся клеточных линий, первичные LEC нуждаются в более высокой плотности клеток для оптимального роста. В первую очередь это связано с тем, что они полагаются на эффективную межклеточную коммуникацию, чему способствует прямой контакт или паракринная сигнализация, которая помогает поддерживать их дифференцировочный статус и функцию. Высокая плотность клеток также смягчает неблагоприятные последствия «культурального шока», состояния, испытываемого первичными клетками при выделении и помещении в среду in vitro , значительно отличающуюся от их происхождения in vivo 23. Имитируя среду, более похожую на среду in vivo, высокая плотность клеток увеличивает выживаемость. Кроме того, эта плотность помогает установить градиент концентрации факторов роста и цитокинов, который поддерживает рост и функционирование клеток. Учитывая, что многие первичные клетки зависят от якоря, требуя поверхностного прикрепления для пролиферации, высокая плотность клеток обеспечивает достаточное количество соседних клеток для адгезии, тем самым способствуя здоровому росту. Следовательно, регуляция плотности клеток является решающим фактором при культивировании первичных клеток из-за ее значительного влияния на клеточную коммуникацию, выживание и пролиферацию. Рекомендуется выбирать небольшие чашки для культур, такие как 24-луночные или 6-луночные тарелки, чтобы создать идеальную среду для LEC. Следование этому протоколу обычно приводит к тому, что LEC достигают состояния слияния через ~10-14 дней после культивирования. Мы рекомендуем использовать LEC при небольшом количестве проходов, в идеале между P0 и P6, чтобы обеспечить наиболее естественное поведение в экспериментах. После 7-10 пассажей LEC могут демонстрировать замедленный рост и могут не реагировать на экспериментальные условия так же, как клетки в нижних пассажах.

Концентрация в сыворотке крови напрямую связана со скоростью роста клеток. Более низкие уровни FBS с большей вероятностью индуцируют более медленный рост, напоминая характеристики центрального эпителия. Напротив, более высокие уровни FBS имитируют условия пролиферативной зоны. Если рост клеток медленный, как это может произойти, когда LEC необходимо выделить из более старых или генетически модифицированных животных, может быть полезно увеличить FBS до 20% или добавить добавку для роста, такую как EpiCGS-a (5 мл, см. таблицу материалов) в питательную среду. Эта сыворотка и добавка могут усилить пролиферацию клеток и способствовать оптимальному росту эпителиальных клеток.

Протокол хранения и транспортировки (раздел 5 протокола) учитывает проблемы, связанные с сохранением и транспортировкой живых клеток. Выбор замораживающей среды имеет решающее значение для выживания ЛЭК при хранении и транспортировке. Мы экспериментировали с различными средами для замораживания, в том числе с 70% полной питательной средой + 20% FBS + 10% ДМСО; 90% ФБС + 10% ДМСО; и замораживающая среда без ДМСО и сыворотки. Данные наших экспериментов свидетельствуют о том, что раствор, содержащий 10% ДМСО и 90% ФБС, демонстрирует превосходную эффективность в сохранении жизнеспособности клеток. Используя эту специфическую формулу, мы успешно храним первичные ЛЭК при температуре -80 °C в течение более 10 лет, демонстрируя надежность этого подхода и его способность способствовать возрождению клеток после хранения.

αA-кристаллин и γ-кристаллин использовали в качестве маркеров LEC. PROX1 был использован в качестве маркера для волоконных клеток хрусталика. Дополнительные маркеры, такие как PAX6, FOXE3 и E-кадгерин, также могут быть использованы для характеристики фенотипа LEC. Если исследователи заинтересованы в изучении ЭМП, αSMA следует использовать в качестве маркера. Необходимо корректировать время инкубации и разведения в соответствии с конкретными требованиями эксперимента и рекомендациями, предоставленными для соответствующих используемых антител.

Несмотря на то, что в данном исследовании представлена надежная методология культивирования первичных ЛЭК, важно признать ее ограничения. В то время как клетки, выделенные на начальном этапе, являются первичными ЛЭК, любые процедуры субкультивирования, трипсинизации и реанимации приведут к изменениям в их статусе. Протокол, который мы разработали, в основном использует мышиный объектив в качестве источника LEC; тем не менее, LEC также могут быть культивированы из других источников, включая образцы пациентов с катарактой, глазные банки или пациентов с различными заболеваниями глаз, включая глаукому и диабетическую ретинопатию17,24. LEC, взятые у пожилых людей или людей с определенными заболеваниями глаз, могут не соответствовать протоколу так же эффективно, как клетки более молодых и здоровых собратьев. Культивирование ЛЭК от более старых или генетически модифицированных особей или животных может потребовать оптимизации питательной среды, возможно, путем увеличения FBS до 20% или включения дополнительных факторов роста. Кроме того, предыдущие исследования Menko et al., проведенные на первичных культурах эпителиальных клеток хрусталика хрусталика первичного эмбриона, продемонстрировали спонтанную дифференцировку, происходящую после второго дня культивирования25. Поэтому исследователям следует проявлять осторожность и учитывать различия в методологиях, особенно если изучение дифференциации является их основной исследовательской целью.

Для культивирования первичных ЛЭК могут использоваться различные методы. Например, методы, разработанные Ibaraki et al., Sundelin et al. и Andjelic et al., включают культивирование первичных LEC непосредственно на чашке Петри с использованием передней части капсулы хрусталика, собранной во время операции по удалению катаракты 16,17,19,20. Этот подход поддерживает естественные межклеточные контакты и внеклеточный матрикс, обеспечивая высокую физиологическую значимость, имеющую решающее значение для таких состояний, как ПКЯ. В качестве альтернативы, метод эксплантации хрусталика, описанный Zelenka et al., сохраняет нативную тканевую архитектуру, что позволяет проводить более физиологически значимые исследования, что особенно полезно для изучения терминальной дифференцировки LEC, клеточных взаимодействий и процессов развития хрусталика, обеспечивая детальное понимание последовательных клеточных и молекулярных событий во время дифференцировки26.

В отличие от этого, метод трипсинизации, описанный в этом протоколе, позволяет получить однородную одноклеточную суспензию, упрощая равномерный посев и точный подсчет клеток, что полезно для определенных экспериментов, таких как анализ жизнеспособности и пролиферации клеток, скрининг лекарств и анализ клеточных сигнальных путей. Тем не менее, важно признать, что, хотя этот метод облегчает контролируемые и точные исследования из-за своей однородной клеточной популяции, он может изменить клеточное поведение и поставить под угрозу физиологическую значимость, наблюдаемую в методах эксплантов и прямых культур из-за ферментативной обработки. Для исследователей, сосредоточенных исключительно на изучении эпителиальных клеток, этот метод оказывается очень применимым и удобным, предлагая достоверное представление о характеристиках и поведении этих клеток. Тем не менее, для тех, чьи научные исследования простираются до клеточной дифференциации, становится важным рассмотреть альтернативные методы, такие как методы эксплантации, или адаптировать и оптимизировать существующий, чтобы охватить эти аспекты.

В целом, этот протокол разработан с тщательным учетом конкретных потребностей и требований LEC. Каждый шаг, от вскрытия до валидации, тщательно продуман для поддержания жизнеспособности и функциональности клеток. В результате, она может стать ценным руководством для исследователей, изучающих LEC и их роль в физиологии и патологии глаз. Будущие исследования могут адаптировать и модифицировать этот протокол для изучения различных аспектов биологии LEC, обеспечивая платформу для дальнейшего прогресса в понимании заболеваний, связанных с хрусталиком, и разработки новых терапевтических стратегий для профилактики катаракты и ПКЯ.

Раскрытие информации

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Авторы заявляют, что у них нет конфликта интересов.

Благодарности

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Эта работа была поддержана NEI R21EY033941 (Hongli Wu); Министерство обороны W81XWH2010896 (Хунли Ву); R15GM123463-02 (Кайле Грин и Хунли Ву)

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
0,05% Trypsin-EDTAThermo Fisher#25300054Для диссоциации LECs
Alexa Fluor 488 Secondbody  Jackson ImmunoResearch#715-545-150Для валидации клеток
Alexa Fluor 647 AffiniPure Goat Anti-rabbit IgG (H+L)Jackson ImmunoResearch111-605-003Для валидации клеток
Буфер для разведения антителLicor#927-60001Для валидации клеток
Безопасный нож Beaver-VisitecInternational#3782235Для диссекции
хрусталикаБлокирующий буферLicor#927-60001Для валидации клеток
Capsulorhexis щипцыTitan Medical InstrumentsTMF-124Для изоляции капсулы хрусталика
DMEMSigma AldrichD6429Для культуральной среды LEC
DMSOSigma Aldrich#D2650Для изготовления замораживающей среды 
Фосфатный буферный солевой раствор Dulbecco Thermo Fisher#J67802Для рассечения линз
пинцетом DumontRoboz Surgical InstrumentRS-4976Для выделения капсулы хрусталика
EpiCGS-a (опционально)ScienCell4182Для культуральной среды LEC
FBSSigma AldrichF2442Для культуральной среды LEC
Gentamicin (50  мг/мл)Sigma-AldrichG1397Для культуральной среды LECs
Hoechst 33342 растворThermo Fisher#62249Для валидации клеток
Микродиссекционные ножницыRoboz Surgical Instrument RS-5983Для рассечения хрусталика
микрорассекающий пинцетRoboz Surgical Instrument RS5137 Для рассечения хрусталика
PROX1 антителоThermo Fisher11067-2-APДля валидации клеток
микродиссекционные пружинные ножницыVannas Roboz Surgical InstrumentRS-5608Для выделения капсулы хрусталика
&альфа; Антитело к A-кристаллинуSanta Cruzsc-28306Для валидации клеток 
γ-кристаллиновое антителоSanta Cruzsc-365256Для валидации клеток

Ссылки

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Bermbach, G., Mayer, U., Naumann, G. O. Human lens epithelial cells in tissue culture. Experimental Eye Research. 52 (2), 113-119 (1991).
  2. Reddy, V. N., Lin, L. R., Arita, T., Zigler, J. S. Jr, Huang, Q. L. Crystallins and their synthesis in human lens epithelial cells in tissue culture. Experimental Eye Research. 47 (3), 465-478 (1988).
  3. Lee, C. M., Afshari, N. A. The global state of cataract blindness. Current Opinion in Ophthalmology. 28 (1), 98-103 (2017).
  4. Khairallah, M., et al. Number of people blind or visually impaired by cataract worldwide and in world regions, 1990 to 2010. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 56 (11), 6762-6769 (2015).
  5. Beebe, D. C., Holekamp, N. M., Shui, Y. B. Oxidative damage and the prevention of age-related cataracts. Ophthalmic Research. 44 (3), 155-165 (2010).
  6. Lou, M. F. Redox regulation in the lens. Progress in Retinal and Eye Research. 22 (5), 657-682 (2003).
  7. Charakidas, A., et al. Lens epithelial apoptosis and cell proliferation in human age-related cortical cataract. European Journal of Ophthalmology. 15 (2), 213-220 (2005).
  8. Lou, M. F. Glutathione and glutaredoxin in redox regulation and cell signaling of the lens. Antioxidants (Basel). 11 (10), 1973(2022).
  9. Wilhelm, J., Smistik, Z., Mahelkova, G., Vytasek, R. Redox regulation of proliferation of lens epithelial cells in culture. Cell Biochemistry & Function. 25 (3), 317-321 (2007).
  10. Zhang, Y., et al. Research progress concerning a novel intraocular lens for the prevention of posterior capsular opacification. Pharmaceutics. 14 (7), 1343(2022).
  11. Konopinska, J., Mlynarczyk, M., Dmuchowska, D. A., Obuchowska, I. Posterior capsule opacification: A review of experimental studies. Journal of Clinical Medicine. 10 (13), 2847(2021).
  12. Pandey, S. K., Apple, D. J., Werner, L., Maloof, A. J., Milverton, E. J. Posterior capsule opacification: A review of the aetiopathogenesis, experimental and clinical studies and factors for prevention. Indian Journal of Ophthalmology. 52 (2), 99-112 (2004).
  13. Wei, Z., et al. Aged lens epithelial cells suppress proliferation and epithelial-mesenchymal transition-relevance for posterior capsule opacification. Cells. 11 (13), 2001(2022).
  14. Creighton, M. O., Mousa, G. Y., Miller, G. G., Blair, D. G., Trevithick, J. R. Differentiation of rat lens epithelial cells in tissue culture--iv. Some characteristics of the process, including possible in vitro models for pathogenic processes in cataractogenesis. Vision Research. 21 (1), 25-35 (1981).
  15. Creighton, M. O., Mousa, G. Y., Trevithick, J. R. Differentiation of rat lens epithelial cells in tissue culture. (i) effects of cell density, medium and embryonic age of initial culture. Differentiation. 6 (3), 155-167 (1976).
  16. Ibaraki, N., Ohara, K., Shimizu, H. Explant culture of human lens epithelial cells from senile cataract patients. Japanese Journal of Ophthalmology. 37 (3), 310-317 (1993).
  17. Sundelin, K., Petersen, A., Soltanpour, Y., Zetterberg, M. In vitro growth of lens epithelial cells from cataract patients - association with possible risk factors for posterior capsule opacification. The Open Ophthalmology Journal. 8, 19-23 (2014).
  18. Parreno, J., et al. Methodologies to unlock the molecular expression and cellular structure of ocular lens epithelial cells. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 10, 983178(2022).
  19. Andjelic, S., et al. Morphological and proliferative studies on ex vivo cultured human anterior lens epithelial cells - relevance to capsular opacification. Acta Ophthalmologica. 93 (6), e499-e506 (2015).
  20. Andjelic, S., et al. A simple method for establishing adherent ex vivo explant cultures from human eye pathologies for use in subsequent calcium imaging and inflammatory studies. Journal of Immunology Research. 2014, 232659(2014).
  21. Andley, U. P., Rhim, J. S., Chylack, L. T. Jr, Fleming, T. P. Propagation and immortalization of human lens epithelial cells in culture. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 35 (7), 3094-3102 (1994).
  22. Zhou, M., Leiberman, J., Xu, J., Lavker, R. M. A hierarchy of proliferative cells exists in mouse lens epithelium: Implications for lens maintenance. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 47 (7), 2997-3003 (2006).
  23. Wolffe, A. P., Glover, J. F., Tata, J. R. Culture shock. Synthesis of heat-shock-like proteins in fresh primary cell cultures. Experimental Cell Research. 154 (2), 581-590 (1984).
  24. Haykin, V., et al. Bioimage analysis of cell physiology of primary lens epithelial cells from diabetic and non-diabetic cataract patients. Biotechnology & Biotechnological Equipment. 35 (1), 170-178 (2021).
  25. Menko, A. S., Klukas, K. A., Johnson, R. G. Chicken embryo lens cultures mimic differentiation in the lens. Developmental Biology. 103 (1), 129-141 (1984).
  26. Zelenka, P. S., Gao, C. Y., Saravanamuthu, S. S. Preparation and culture of rat lens epithelial explants for studying terminal differentiation. Journal of Visualized Experiments. (31), 1591(2009).

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на повторное использование текста или иллюстраций этой статьи JoVE

Запросить разрешение

Теги

Похожие статьи