Методическая статья

Реконструкция гематоэнцефалического барьера in vitro для моделирования и терапевтического воздействия на неврологические заболевания

3.3K просмотров

⸱

DOI:

10.3791/65921

⸱

20 октября 2023 г.

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Icahn School of Medicine at Mount Sinai, 2Black Family Stem Cell Institute at Mount Sinai, 3Ronald M. Loeb Center for Alzheimer’s Disease at Mount Sinai, 4Friedman Brain Institute at Mount Sinai, 5Nash Family Department of Neuroscience at Mount Sinai

* These authors contributed equally

В этой статье

Краткое содержание

Гематоэнцефалический барьер (ГЭБ) играет решающую роль в поддержании стабильной и здоровой среды мозга. Дисфункция ГЭБ связана со многими неврологическими заболеваниями. Мы разработали 3D-модель ГЭБ на основе стволовых клеток для изучения цереброваскулярной патологии, целостности ГЭБ и того, как ГЭБ изменяется генетикой и заболеванием.

Аннотация

Гематоэнцефалический барьер (ГЭБ) является ключевым физиологическим компонентом центральной нервной системы (ЦНС), поддерживая питательные вещества, очищая отходы и защищая мозг от патогенов. Барьерные свойства, присущие ГЭБ, создают трудности для доставки терапевтических препаратов в ЦНС для лечения неврологических заболеваний. Нарушение функции ГЭБ связано с неврологическими заболеваниями. Церебральная амилоидная ангиопатия (САА), отложение амилоида в сосудах головного мозга, приводящее к нарушению ГЭБ, является сопутствующим заболеванием в большинстве случаев болезни Альцгеймера (БА), что позволяет предположить, что дисфункция или распад ГЭБ могут быть вовлечены в нейродегенерацию. Из-за ограниченного доступа к тканям ГЭБ человека механизмы, способствующие правильному функционированию ГЭБ и дегенерации ГЭБ, остаются неизвестными. Чтобы устранить эти ограничения, мы разработали ГЭБ, полученный из плюрипотентных стволовых клеток человека (iBBB), включив эндотелиальные клетки, перициты и астроциты в 3D-матрицу. iBBB самоорганизуется, чтобы повторить анатомию и клеточные взаимодействия, присутствующие в BBB. Посев iBBB амилоидом отражает ключевые аспекты CAA. Кроме того, iBBB предлагает гибкую платформу для модуляции генетических факторов и факторов окружающей среды, вовлеченных в цереброваскулярные заболевания и нейродегенерацию, чтобы исследовать, как генетика и образ жизни влияют на риск заболевания. Наконец, iBBB может быть использован для скрининга лекарственных препаратов и медико-химических исследований для оптимизации терапевтической доставки в ЦНС. В этом протоколе мы описываем дифференцировку трех типов клеток (эндотелиальных клеток, перицитов и астроцитов), возникающих из плюрипотентных стволовых клеток человека, как собрать дифференцированные клетки в iBBB и как смоделировать CAA in vitro с использованием экзогенного амилоида. Эта модель решает проблему изучения живой ткани человеческого мозга с помощью системы, которая обладает как биологической точностью, так и экспериментальной гибкостью, и позволяет исследовать человеческий ГЭБ и его роль в нейродегенерации.

Введение

Гематоэнцефалический барьер (ГЭБ) является ключевой микрососудистой сетью, отделяющей центральную нервную систему (ЦНС) от периферии для поддержания идеальной среды для правильного функционирования нейронов. Он играет важнейшую роль в регулировании притока и оттока веществ в ЦНС, поддерживая метаболический гомеостаз 1,2,3,4, очищая отходы 4,5,6 и защищая мозг от патогенов и токсинов 7,8.

Первичным типом клеток ГЭБ является эндотелиальная клетка (ЭК). Эндотелиальные клетки, происходящие из мезодермы, образуют стенки сосудистой сети 1,9. Микрососудистые ЭК образуют плотные соединения друг с другом, чтобы значительно уменьшить проницаемость своей мембраны 10,11,12,13,14, в то же время экспрессируя транспортеры для облегчения движения питательных веществ в ЦНС и из ЦНС 1,4,12,14. Микрососудистые ЭК окружены перицитами (ПК) - клетками-стенками, которые регулируют функцию микрососудов и гомеостаз и имеют решающее значение для регуляции проницаемости ГЭБ для молекул и иммунных клеток 15,16,17. Астроцит, основной тип глиальных клеток, является последним типом клеток, составляющих ГЭБ. Концевые ножки астроцитов оборачиваются вокруг сосудистых трубок EC-PC, в то время как клеточные тела простираются в паренхиму мозга, образуя связь между нейронами и сосудистой сетью1. На концевых ножках астроцитов локализуются различные переносчики растворенных веществ и субстратов (например, аквапорин 4 [AQP-4]), которые играют решающую роль в функции ГЭБ 18,19,20,21.

ГЭБ имеет решающее значение для поддержания надлежащего функционирования мозга, и дисфункция ГЭБ была зарегистрирована при многих неврологических заболеваниях, включая болезнь Альцгеймера (БА)22,23,24,25, рассеянный склероз 7,26,27,28, эпилепсию 29,30 и инсульт31,32. Все чаще признается, что цереброваскулярные аномалии играют центральную роль в нейродегенерации, способствуя повышенной восприимчивости к ишемическим и геморрагическим событиям. Например, более 90% пациентов с болезнью Альцгеймера имеют церебральную амилоидную ангиопатию (ЦАА), состояние, характеризующееся отложением амилоидной β (Aβ) вдоль сосудистой сети головного мозга. ЧАА увеличивает проницаемость ГЭБ и снижает функцию ГЭБ, делая ЦНС уязвимой к ишемии, геморрагическим событиям и ускоренномуснижению когнитивных функций.

Недавно мы разработали in vitro модель человеческого ГЭБ, полученную из индуцированных пациентом плюрипотентных стволовых клеток, которая включает в себя ЭК, ПК и астроциты, инкапсулированные в 3D-матрицу (рис. 1A). iBBB повторяет физиологически значимые взаимодействия, включая формирование сосудистых трубок и локализацию концевых ножек астроцитов с сосудистой сетью24. Мы применили iBBB для моделирования восприимчивости к CAA, опосредованной APOE4 (рис. 1B). Это позволило нам идентифицировать причинно-следственные клеточные и молекулярные механизмы, с помощью которых APOE4 способствует развитию CAA, и использовать эти знания для разработки терапевтических стратегий, которые уменьшают патологию CAA и улучшают обучение и память in vivo у мышей APOE424. Здесь мы приводим подробный протокол и видеоурок по реконструкции ГЭБ из ИПСК человека и моделированию САА in vitro.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

1. Дифференцировка ИПСК в клетки iBBB

ПРИМЕЧАНИЕ: Эти протоколы дифференцировки были ранее описаны в работе Mesentier-Louro et al.34.

  1. Покрытие планшетов для клеточных культур
    1. Оттаивание мембранной матрицы с пониженным фактором роста (GF) в течение ночи при 4 °C. Развести 500 мкл матрицы базальной мембраны в 49,5 мл DMEM. Храните этот раствор в холодном виде, чтобы предотвратить преждевременную полимеризацию раствора покрытия.
    2. Добавьте 1-2 мл на лунку 6-луночного планшета, обработанного культурой тканей. Оставьте раствор для покрытия не менее чем на 20 минут при температуре 37 °C, прежде чем заменить его соответствующей подогретой питательной средой.
  2. Дифференцировка ИПСК человека в ETV2-индуцируемые эндотелиальные клетки
    Сроки: 8 дней
    ПРИМЕЧАНИЕ: Этот протокол адаптирован из Blanchard et al.24 и Qian et al.35. Мы используем индуцируемую доксициклином экспрессию транскрипционного фактора ETV2, описанную Wang et al.36 , для повышения выхода. ETV2 вводили через плазмиду PiggyBac, а затем клетки трансфицировали.
    1. Культивирование ИПСК на планшетах, покрытых матрицей базальной мембраны с пониженным GF, в безпитательной среде плюрипотентных стволовых клеток до тех пор, пока клетки не достигнут ~70% слияния.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Мы рекомендуем поддерживать индуцируемые ИПСК путем отбора для плазмиды PiggyBac (т.е. пуромицина)
    2. День 0: Диссоциируют клетки смесью протеазы и коллагеназы в течение 5 мин. Перенесите диссоциированные клетки в коническую пробирку с соотношением протеазно-коллагеназной смеси 1:3 к среде стволовых клеток. Отжим клетки при 300 × г в течение 3 мин. Ресуспендируйте клеточную гранулу со средой стволовых клеток и поместите клетки со скоростью 20 800 клеток/см2 на пластины с матричным покрытием из базальной мембраны с пониженным GF в среде стволовых клеток с добавлением 10 мкМ Y27632.
    3. День 1: Замените среду на DeSR1 [DMEM/F12 + добавка глютамина, 1x минимальное количество заменимых аминокислот (MEM-NEAA), 1% пенициллин-стрептомицин (P/S)], дополненное 10 нг/мл BMP4, 6 мкМ CHIR99021 и 5 мкг/мл доксициклина.
    4. День 3: Замените среду на DeSR2 [DMEM/F12 + добавка глютамина, 1x MEM-NEAA, 1x N-2, 1x B-27, 1% P/S] с добавлением 5 мкг/мл доксициклина.
    5. День 5: Замените среду на hECSR [среда без эндотелия сыворотки человека, 1x MEM-NEAA, 1x B-27, 1% P/S] с добавлением 50 нг/мл VEGF-A, 2 мкМ форсколина и 5 мкг/мл доксициклина.
    6. День 7: Замените среду на hECSR с добавлением 50 нг/мл VEGF-A, 2 мкМ форсколина и 5 мкг/мл доксициклина.
    7. День 8: Расщепляют ECs 1:3 со смесью протеазы и коллагеназы и повторно высевают на свежие планшеты с матричным покрытием из базальной мембраны GF в hECSR с добавлением 50 нг/мл VEGF-A и 5 мкг/мл доксициклина.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Это наилучший момент времени для инкапсуляции EC в iBBB для равномерного формирования сосудистой сети.
    8. День 10+: Каждые 2-3 дня кормите клетки hECSR с добавлением 50 нг/мл VEGF-A и 5 мкг/мл доксициклина. Продолжайте разделять клетки в соотношении 1:3 смесью протеазы и коллагеназы, когда пластины сливаются.
      ПРИМЕЧАНИЕ: ЭК, полученные из ИПСК, могут быть заморожены в любой момент, начиная с 8-го дня. Приподнимите ячейки, как бы для прохода. Ресуспендируйте гранулы в среде замораживания EC [60% нокаут-замены сыворотки (KSR), 30% hECSR, 10% DMSO, 50 нг/мл VEGF-A и 10 мкМ Y27632], разделив клетки 1:3, и заморозьте с помощью контейнера для заморозки при -80 °C. Размораживают на пластинах с матричным покрытием базальной мембраны GF в hECSR с добавлением 50 нг/мл VEGF-A, 5 мкг/мл доксициклина.
    9. Подтвердить дифференцировку микрососудистых эндотелиальных клеток головного мозга иммуноцитохимическим методом с использованием антител к CD31/PECAM1 или VE-кадгерину (рис. 2A).
  3. Дифференцировка ИПСК человека в перициты
    Сроки: 6 дней
    ПРИМЕЧАНИЕ: Этот протокол был адаптирован из Patsch et al.36.
    1. Культивирование ИПСК на планшетах с матриксным покрытием из базальной мембраны с пониженным GF в безпитательных условиях в среде стволовых клеток до тех пор, пока клетки не достигнут ~70% слияния.
    2. День 0: Диссоциируют клетки смесью протеазы и коллагеназы в течение 5 мин. Перенесите диссоциированные клетки в коническую пробирку с соотношением протеазно-коллагеназной смеси 1:3 к среде стволовых клеток. Отжим клетки при 300 × г в течение 3 мин. Ресуспендировать клеточную гранулу со средой стволовых клеток и поместить клетки с концентрацией 37 000-40 000 клеток/см2 (в зависимости от клеточной линии) на пластины с матричным покрытием из базальной мембраны GF в среде стволовых клеток, дополненную 10 мкМ Y27632.
    3. День 1: Замените среду N2B27 [50% DMEM/F12 + добавка глютамина, 50% Neurobasal, 1x MEM-NEAA, 0,5x, добавка глютамина, 1x N-2, 1x-B-27, 1% P/S] с добавлением 25 нг/мл BMP4 и 8 мкМ CHIR99021.
    4. Дни 3-4: Замените носитель на N2B27 с добавлением 2 нг/мл активина А и 10 нг/мл PDGF-BB и ежедневно скармливайте.
    5. День 5: Расщепляют ПК со смесью протеазы и коллагеназы и высевают на 0,1% пластины, покрытые желатином, в концентрации 35 000 клеток/см2 в N2B27 с добавлением 10 нг/мл PDGF-BB.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Разделяйте ячейки только после слияния. Некоторым линиям может потребоваться еще несколько дней, прежде чем они будут готовы к разделению; Продолжайте ежедневно менять носитель до тех пор, пока ячейки не соединятся.
    6. Расширьте ПК в N2B27 с добавлением 10 нг/мл PDGF-BB, меняя носитель каждые 2-3 дня. Удалите PDGF-BB из среды после того, как клетки снова достигнут слияния и пройдут повторное прохождение.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Перициты готовы к использованию в iBBB после второго пассажа. После развертывания ПК можно заморозить. Поднимите клетки, как будто для прохода, повторно суспендируйте гранулы клеток в замораживающей среде [90% KSR и 10% DMSO] и заморозьте в контейнере для заморозки при -80 °C. Размораживают на пластинах с 0,1%-ным желатиновым покрытием при концентрации 35 000 клеток/см2 в N2B27.
    7. Подтвердить дифференцировку перицитов иммуноцитохимическим методом с помощью антител к PDGFRB и NG2 (рис. 2B).
  4. Дифференцировка ИПСК человека в нейральные клетки-предшественники (НПК) и астроциты
    Время: всего 45 дней (15 дней для NPC и 30 дней для астроцитов)
    ПРИМЕЧАНИЕ: Протокол дифференцировки NPC был адаптирован из Chambers et al.38, а дифференцировка астроцитов соответствует описанию в TCW et al.39.
    1. Культивирование ИПСК на планшетах с матриксным покрытием из базальной мембраны с пониженным GF в безпитательных условиях в среде стволовых клеток до тех пор, пока клетки не достигнут ~70% слияния.
    2. Диссоциируют клетки смесью протеазы и коллагеназы в течение 5 мин. Перенесите диссоциированные клетки в коническую пробирку с соотношением протеазно-коллагеназной смеси 1:3 к среде стволовых клеток. Отжим клетки при 300 × г в течение 3 мин. Ресуспендировать клеточную гранулу со средой стволовых клеток и поместить клетки со скоростью 100 000 клеток/см2 на пластины с матричным покрытием из базальной мембраны GF в среде стволовых клеток, дополненную 10 мкМ Y27632.
    3. Замените среду стволовых клеток на следующий день. Продолжайте кормить клетки через день, пока они не достигнут слияния >95% (3-4 дня в зависимости от клеточной линии).
    4. NPC День 0: Замените носитель на N2B27 [50% DMEM/F12 + добавка глютамина, 50% нейробазальный, 1x MEM-NEAA, 0,5x, добавка глютамина, 1x N-2, 1X-B-27, 1% P/S] с добавлением 10 мкМ SB43152 и 100 нМ LDN193189.
    5. NPC Дни 1-9: Ежедневно кормите клетки N2B27 с добавлением 10 мкМ SB43152 и 100 нМ LDN193189.
    6. NPC День 10: Разделите NPC в соотношении 1:3 со смесью протеазы и коллагеназы и затравите на свежие пластины с матричным покрытием из базальной мембраны GF в N2B27 с добавлением 20 нг/мл FGF-основного и 10 мкМ Y27632.
    7. NPC Дни 11 - 13: Ежедневно кормите NPC N2B27 с добавлением 20 нг/мл FGF-basic.
    8. NPC День 14: Разделите NPC в соотношении 1:3 со смесью протеазы и коллагеназы и пересейте на свежие пластины с матричным покрытием из базальной мембраны GF в N2B27 с добавлением 20 нг/мл FGF-основного и 10 мкМ Y27632.
    9. NPC День 15/Астроцит День 0: Это 0-й день дифференцировки астроцитов. Подкормите клетки полной средой астроцитов (АМ).
      ПРИМЕЧАНИЕ: NPC могут поддерживаться в N2B27 с добавлением 20 нг/мл FGF-basic и пассировать при слиянии. Чтобы заморозить NPC, повторно суспендируйте гранулы клеток в замораживающей среде [90% KSR и 10% DMSO], разделите клетки 1:3 и заморозьте в контейнере для замораживания при -80 °C. Размораживают на пластинах с матричным покрытием из N2B27 с добавлением 20 нг/мл bFGF и 10 мкМ Y27632.
    10. Дни 1-30 астроцитов: Подкармливают клетки каждые 2-3 дня АМ. При слиянии клеток >90% пассаж с использованием смеси протеазы и коллагеназы и планшета со скоростью 15 000 клеток/см2 на свежих пластинах с матричным покрытием из базальной мембраны GF в АМ.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Астроциты должны быть полностью дифференцированы через 30 дней. Астроциты могут быть заморожены в замораживающей среде [90% KSR и 10% DMSO] в морозильном контейнере при -80 °C. Размораживают на пластинах с матричным покрытием из базальной мембраны GF в АМ при 25 000-35 000 клеток/см2.
    11. Подтвердить дифференцировку NPC иммуноцитохимическим методом с использованием антител к Nestin и SOX2. Подтвердите дифференцировку астроцитов иммуноцитохимическим методом с помощью антител к S100B и CD44 (рис. 2C).

2. Сборка iBBB

  1. Оттаивание матрицы базальной мембраны с пониженным фактором роста (GF) в течение ночи при 4 °C. Не разбавляйте эту матрицу в DMEM, так как iBBB инкапсулированы в 100% восстановленную мембранную матрицу базального основания GF. Для каждого iBBB требуется 50 мкл матрицы.
  2. Диссоциируют дифференцированные ЭК смесью протеазы и коллагеназы при 37 °C в течение 5 мин. Перенесите диссоциированные клетки в коническую пробирку с соотношением 1:3 смеси протеазы и коллагеназы в hECSR (Human Endothelial Serum-Free Medium, 1x MEM-NEAA, 1x B-27, 1% P/S). Отжим клетки при 300 × г в течение 3 мин. Ресуспендируйте клеточную гранулу в hECSR.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Используйте коническую пробирку объемом 15 мл или 50 мл, достаточно большую, чтобы вместить объем диссоциированных клеток и среды. Клетки также могут быть разделены между несколькими пробирками, а затем рекомбинированы при ресуспензии.
  3. Диссоциируют дифференцированные ПК со смесью протеазы и коллагеназы при 37 °C в течение 5 мин. Перенесите диссоциированные клетки в коническую пробирку с соотношением 1:3 смеси протеазы и коллагеназы к N2B27 (50% DMEM/F12 + добавка глютамина, 50% Neurobasal, 1x MEM-NEAA, 0,5x добавка глютамина, 1x N-2, 1x B-27, 1% пенициллин-стрептомицин [P/S]). Отжим клетки при 300 × г в течение 3 мин. Ресуспендируйте гранулу ячейки в N2B27.
  4. Диссоциировать дифференцированные астроциты со смесью протеазы и коллагеназы при 37 °C в течение 5 мин. Перенесите диссоциированные клетки в коническую пробирку с соотношением протеазы и коллагеназы 1:3 до полной среды астроцитов (АМ). Отжим клетки при 300 × г в течение 3 мин. Ресуспендируйте гранулу ячейки в АМ.
  5. С помощью гемоцитометра подсчитайте каждый тип клеток. Разбавляют каждый тип клеточной суспензии до конечной концентрации 1 × 106 клеток/мл в соответствующей среде.
  6. Объедините рассчитанное количество клеток для каждого типа клеток в коническую пробирку: для 50 мкл iBBB требуется 2,5 × 105 ЕС, 5 × 104 ПК и 5 × 104 астроцитов. Включите на 10 % больше, чем расчетное количество ячеек, чтобы учесть ошибки пипетирования. Отжим клеточную смесь до 300 × г в течение 3 мин.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Настоятельно рекомендуется поместить некоторые оставшиеся клетки каждого типа клеток в 2D-монокультуры для фиксации и окрашивания для контроля качества входных клеток. Пластины каждого типа клеток со скоростью 35 000 клеток/см2 на заранее подготовленные пластины, покрытые матрицей мембраны базального основания GF, и фиксируют через 3-4 дня. В таблице 1 приведены специфические антитела клеточного типа.
  7. Отсасывайте среду из клеточной гранулы, оставляя примерно 50 мкл надосадочной жидкости над клеточной гранулой. Используя P200, осторожно ресуспендируйте гранулы в остаточной среде, чтобы создать одноячеистую суспензию.
  8. Смешайте клеточную суспензию с матрицей базальной мембраны GF с добавлением 10 нг/мл VEGF-A для получения желаемого количества iBBB при 50 мкл матрицы восстановленной мембраны базального слоя GF на iBBB, следя за тем, чтобы клетки смешивались однородно, не вводя при этом пузырьков воздуха.
    ПРИМЕЧАНИЕ: На этом этапе очень важно удерживать клетки и матрикс мембраны базального основания GF на льду, чтобы предотвратить преждевременную полимеризацию.
  9. Пипетку 50 мкл смеси матрицы базальной мембраны GF в лунку 48-луночной чашки для культивирования со стеклянным дном. Равномерно распределите объем по всему дну посуды (рисунок 1C).
  10. Инкубируют iBBB при 37 °C в течение 30-40 минут, чтобы позволить матрице мембраны базального слоя GF полимеризоваться, инкапсулировав клетки в матриксе.
  11. Добавьте 500 мкл АМ с добавлением 10 нг/мл VEGF-A, 5 мкг/мл доксициклина и 10 мкМ Y27632.
  12. На следующий день смените среду на AM с добавлением 10 нг/мл VEGF-A. Продолжайте менять среду каждые 2-3 дня. Через 2 недели прекратите прием добавок с VEGF-A; iBBB готовы к последующему анализу через 2 недели.

3. Индуцирование церебральной амилоидной ангиопатии (ЦАА) фибриллами Aβ

  1. Готовят исходные растворы амилоида-β1-40 и амилоида-β1-42 при 200 мкМ в ПБС.
  2. Добавьте Aβ к среде iBBB на 2-недельных iBBB до конечной концентрации 20 нМ. Инкубируют клетки в среде с добавлением Аβ в течение 96 ч (4 дня).
  3. Через 96 ч удалите носитель и продолжайте фиксацию (раздел 4).

4. Фиксация и окрашивание iBBB

  1. Чтобы зафиксировать iBBB, удалите среду, промойте в 1 мл PBS и инкубируйте в 500 мкл 4% параформальдегида в течение ночи при 4 °C.
  2. Удалите 4% раствор параформальдегида и промойте 4 раза (не менее) 15 минут в 1 мл PBS.
  3. Пермеабилизацию образцов в 0,3% ПБСТ (ПБС с 0,3% Тритоном Х-100) в течение 1 ч при комнатной температуре при легком встряхивании.
  4. Инкубируют культуры в блокирующем буфере (5% обычная сыворотка в 0,3% PBST) при комнатной температуре не менее 1 ч при легком встряхивании.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Тип используемой сыворотки зависит от вида хозяина для используемых вторичных антител. Например, если видом-хозяином вторичных антител является коза, используйте обычную козью сыворотку; Если хозяином является осел, используйте обычную ослиную сыворотку. Это также можно сделать на ночь при температуре 4 °C с легким встряхиванием.
  5. Первичные антитела разбавляют до рекомендуемой или определенной концентрации в блокирующем буфере.
  6. Замените блокирующий раствор первичным разведением антител. Убедитесь, что iBBB полностью погружены в раствор антител для равномерной инкубации; 100-150 мкл достаточно, чтобы покрыть 50 мкл iBBB в 48-луночной чашке со стеклянным дном. Выдерживают в течение ночи при температуре 4 °C при легком встряхивании.
  7. Удалите первичные антитела. Промывайте iBBB в течение 3 x 10-20 минут в 0,3% PBS.
  8. Разбавляют вторичное антитело до рекомендуемой или определенной концентрации в блокирующем буфере. Кроме того, добавьте ядерный краситель, например, Hoechst, в раствор вторичных антител в рекомендуемой или определенной концентрации.
  9. Замените последнюю промывку PBS вторичным разведением антител. Убедитесь, что iBBB полностью погружены в раствор антител для равномерной инкубации; 100-150 мкл достаточно, чтобы покрыть 50 мкл iBBB в 48-луночной чашке со стеклянным дном. Выдерживают при комнатной температуре 2 ч при легком встряхивании.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Это также можно сделать на ночь при температуре 4 °C с легким встряхиванием.
  10. Стирайте iBBB 4-5 раз в течение не менее 1 часа за одну стирку в PBS. Хранить в PBS или невыцветающем монтажном материале при температуре 4 °C до получения изображения образцов.
  11. Для получения изображения на инвертированном микроскопе храните iBBB в чашках или посудах со стеклянным дном. Поместите стеклянную защитную пленку на стеклянное отверстие, чтобы iBBB оставались на месте (Рисунок 1D).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

Правильно сформированный iBBB затвердевает в один полупрозрачный диск (рис. 3A). Это нормально, когда iBBB отделяется от поверхности, на которую он был впервые запипетирован, через несколько дней. Этого нельзя избежать, но это не является серьезной проблемой для правильного формирования iBBB, если при смене среды соблюдать осторожность, чтобы случайно не аспирировать iBBB. Через 24 ч можно идентифицировать равномерно распределенные единичные клетки под светлопольным микроскопом (

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

Дисфункция ГЭБ является сопутствующим заболеванием и, возможно, причиной или усугубляющим фактором при многочисленных неврологических заболеваниях 7,40,41. Тем не менее, практически невозможно изучить молекулярную и клеточную биологию, лежащую в основе дисфункции и распада ГЭБ у людей с нейрососудистыми заболеваниями. Индуцированный ГЭБ (iBBB), представленный в этом протоколе, обеспечивает систему in vitro, которая повт...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

Авторы сообщают об отсутствии конфликта интересов.

Благодарности

Эта работа поддержана NIH 3-UG3-NS115064-01, R01NS14239, Фондом лечения болезни Альцгеймера, NASA 80ARCO22CA004, Инициативой Чана-Цукерберга, Фондом MJFF/ASAP и Американской ассоциацией травм головного мозга. C.G. поддерживается NIH F31NS130909. Рисунок 1A был создан с помощью BioRender.com.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
6e10 амилоид-&бета; антителоBiolegendSIG-39320используется в 1:1000
accutaseinnovative cell technologiesAT104
Activin APeprotech20-14E
Alexa Fluor 488, 555, 647 вторичные антителаInvitrogenVariousИспользуется в 1:1000
Амилоид-бета 40 фибрилAnaSpecAS-24235
Амилоид-бета 42 фибрилAnaSpecAS-20276
Аквапорин-4 антителоInvitrogenPA5-53234Использовано в 1:300
Астроцитарные базальные среды и добавкиScienCell1801
B-27 бессывороточная добавкаGibco17504044
BMP4Peprotech120-05ET
CHIR99021Cyamn Chemical13112
DMEM/F12 со средой GlutaMAXGibco10565018
доксициклиномMillipore-SigmaD3072-1ML
FGF-basicPeprotech100-18B
Fluoromount-G скользящая монтажная средаVWR100502-406
ForskolinR& D Systems1099/10
GeltrexTM LDEV-Free hESC-сертифицированный пониженный фактор роста GibcoA1413302
Стеклянное дно 48-луночные посуды для культурыMattek CorporationP48G-1.5-6-F
GlutaMAX добавкаGibco35050061
Hoechst 33342 InvitrogenH3570
Среда без эндотелиальной сывороткиGibco11111044
LDN193189Tocris6053
Минимальная незаменимая среда Раствор заменимых аминокислот (MEM-NEAA) Gibco11140050
добавка N-2Gibco17502048
Нейробазальная средаGibco21103049
Нормальная ослиная сывороткаMillipore-SigmaS30-100mLИспользуйте сыворотку для соответствия вторичному антителу хозяина
Параформальдегид (PFA) ThermoFisher28908
PDGF-BBPeprotech100-14B
PDGFRB (рецептор бета-тромбоцитарного фактора роста)антитела R& D SystemsAF385используется при соотношении 1:500
фосфатно-солевого буфера (PBS), pH 7,4Gibco10010031
антител Pecam1 (молекула адгезии эндотелиальных клеток тромбоцитов 1)R& D SystemsAF806использовал в соотношении 1:500
пенициллин-стрептомицинGibco15140122
плазмиду PiggyBac (PB_iETV2_P2A_GFP_Puro)AddGene  Каталог #168805
S100B антителоSigma-AldrichS2532-100uLиспользовано в 1:500
SB43152Reprocell04-0010
Тиофлавин TChem Impex22870использовано в 25uM
Triton X-100 Sigma-AldrichT8787-250mL
VE-кадгерин (CD144) антителаR& D системыAF938Используется в масштабе 1:500
VEGF-APeprotech100-20
Y27632R& D Systems1254/10
ZO-1InvitrogenMA3-39100-A488Разведение = 1:500

Ссылки

  1. Daneman, R., Prat, A. The blood-brain barrier. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 7 (1), a020412(2015).
  2. Segarra, M., Aburto, M. R., Acker-Palmer, A. Blood-brain barrier dynamics to maintain brain homeostasis. Trends in Neurosciences. 44 (5), 393-405 (2021).
  3. Campos-Bedolla, P., Walter, F. R., Veszelka, S., Deli, M. A. Role of the blood-brain barrier in the nutrition of the central nervous system. Archives of Medical Research. 45 (8), 610-638 (2014).
  4. Hladky, S. B., Barrand, M. A. Fluid and ion transfer across the blood-brain and blood-cerebrospinal fluid barriers; a comparative account of mechanisms and roles. Fluids and Barriers of the CNS. 13 (1), 19(2016).
  5. Kaur, J., et al. Waste clearance in the brain. Frontiers in Neuroanatomy. 15, 665803(2021).
  6. Verheggen, I. C. M., Van Boxtel, M. P. J., Verhey, F. R. J., Jansen, J. F. A., Backes, W. H. Interaction between blood-brain barrier and glymphatic system in solute clearance. Neuroscience and Biobehavioral Reviews. 90, 26-33 (2018).
  7. Weiss, N., Miller, F., Cazaubon, S., Couraud, P. O. The blood-brain barrier in brain homeostasis and neurological diseases. Biochimica et Biophysica Acta. 1788 (4), 842-857 (2009).
  8. Prinz, M., Priller, J. The role of peripheral immune cells in the cns in steady state and disease. Nature Neuroscience. 20 (2), 136-144 (2017).
  9. Weksler, B. B., et al. Blood-brain barrier-specific properties of a human adult brain endothelial cell line. FASEB Journal. 19 (13), 1872-1874 (2005).
  10. Liu, W. Y., Wang, Z. B., Zhang, L. C., Wei, X., Li, L. Tight junction in blood-brain barrier: An overview of structure, regulation, and regulator substances. CNS Neuroscience & Therapeutics. 18 (8), 609-615 (2012).
  11. Siegenthaler, J. A., Sohet, F., Daneman, R. Sealing off the cns': Cellular and molecular regulation of blood-brain barriergenesis. Current Opinion in Neurobiology. 23 (6), 1057-1064 (2013).
  12. Brightman, M. W., Reese, T. S. Junctions between intimately apposed cell membranes in the vertebrate brain. Journal of Cell Biology. 40 (3), 648-677 (1969).
  13. Reese, T. S., Karnovsky, M. J. Fine structural localization of a blood-brain barrier to exogenous peroxidase. Journal of Cell Biology. 34 (1), 207-217 (1967).
  14. Mahringer, A., Fricker, G. Abc transporters at the blood-brain barrier. Expert Opinion on Drug Metabolism & Toxicology. 12 (5), 499-508 (2016).
  15. Armulik, A., Genove, G., Betsholtz, C. Pericytes: Developmental, physiological, and pathological perspectives, problems, and promises. Developmental Cell. 21 (2), 193-215 (2011).
  16. Armulik, A., et al. Pericytes regulate the blood-brain barrier. Nature. 468 (7323), 557-561 (2010).
  17. Daneman, R., Zhou, L., Kebede, A. A., Barres, B. A. Pericytes are required for blood-brain barrier integrity during embryogenesis. Nature. 468 (7323), 562-566 (2010).
  18. Abbott, N. J., Ronnback, L., Hansson, E. Astrocyte-endothelial interactions at the blood-brain barrier. Nature Reviews. Neuroscience. 7 (1), 41-53 (2006).
  19. Heithoff, B. P., et al. Astrocytes are necessary for blood-brain barrier maintenance in the adult mouse brain. Glia. 69 (2), 436-472 (2021).
  20. Verkman, A. S. Aquaporin water channels and endothelial cell function. Journal of Anatomy. 200 (6), 617-627 (2002).
  21. Wolburg, H., Lippoldt, A. Tight junctions of the blood-brain barrier: Development, composition and regulation. Vascular Pharmacology. 38 (6), 323-337 (2002).
  22. Sagare, A. P., Bell, R. D., Zlokovic, B. V. Neurovascular dysfunction and faulty amyloid beta-peptide clearance in alzheimer disease. Cold Spring Harbor Perspectives in Medicine. 2 (10), a011452(2012).
  23. Kapasi, A., Schneider, J. A. Vascular contributions to cognitive impairment, clinical alzheimer's disease, and dementia in older persons. Biochimica et Biophysica Acta. 1862 (5), 878-886 (2016).
  24. Blanchard, J. W., et al. Reconstruction of the human blood-brain barrier in vitro reveals a pathogenic mechanism of apoe4 in pericytes. Nature Medicine. 26 (6), 952-963 (2020).
  25. Huang, Z., et al. Blood-brain barrier integrity in the pathogenesis of alzheimer's disease. Frontiers in Neuroendocrinology. 59, 100857(2020).
  26. Morgan, L., et al. Inflammation and dephosphorylation of the tight junction protein occludin in an experimental model of multiple sclerosis. Neuroscience. 147 (3), 664-673 (2007).
  27. Kirk, J., Plumb, J., Mirakhur, M., Mcquaid, S. Tight junctional abnormality in multiple sclerosis white matter affects all calibres of vessel and is associated with blood-brain barrier leakage and active demyelination. Journal of Pathology. 201 (2), 319-327 (2003).
  28. Balasa, R., Barcutean, L., Mosora, O., Manu, D. Reviewing the significance of blood-brain barrier disruption in multiple sclerosis pathology and treatment. International Journal of Molecular Sciences. 22 (16), 8370(2021).
  29. Marchi, N., Granata, T., Ghosh, C., Janigro, D. Blood-brain barrier dysfunction and epilepsy: Pathophysiologic role and therapeutic approaches. Epilepsia. 53 (11), 1877-1886 (2012).
  30. Kiani, L. Blood-brain barrier disruption following seizures. Nature Reviews. Neurology. 19 (4), 2023(2023).
  31. Knowland, D., et al. Stepwise recruitment of transcellular and paracellular pathways underlies blood-brain barrier breakdown in stroke. Neuron. 82 (3), 603-617 (2014).
  32. Okada, T., Suzuki, H., Travis, Z. D., Zhang, J. H. The stroke-induced blood-brain barrier disruption: Current progress of inspection technique, mechanism, and therapeutic target. Current Neuropharmacology. 18 (12), 1187-1212 (2020).
  33. Gireud-Goss, M., Mack, A. F., Mccullough, L. D., Urayama, A. Cerebral amyloid angiopathy and blood-brain barrier dysfunction. Neuroscientist. 27 (6), 668-684 (2021).
  34. Mesentier-Louro, L. A., Suhy, N., Broekaart, D., Bula, M., Pereira, A. C., Blanchard, J. W. Modeling the blood-brain barrier using human-induced pluripotent stem cells. Methods in Molecular Biology. 2683, 135-151 (2023).
  35. Qian, T., et al. Directed differentiation of human pluripotent stem cells to blood-brain barrier endothelial cells. Science Advances. 3 (11), e1701679(2017).
  36. Wang, K., et al. Robust differentiation of human pluripotent stem cells into endothelial cells via temporal modulation of etv2 with modified mrna. Science Advances. 6 (30), eaba7606(2020).
  37. Patsch, C., et al. Generation of vascular endothelial and smooth muscle cells from human pluripotent stem cells. Nature Cell Biology. 17 (8), 994-1003 (2015).
  38. Chambers, S. M., et al. Highly efficient neural conversion of human es and ips cells by dual inhibition of smad signaling. Nature Biotechnology. 27 (3), 275-280 (2009).
  39. Tcw, J., et al. An efficient platform for astrocyte differentiation from human induced pluripotent stem cells. Stem Cell Reports. 9 (2), 600-614 (2017).
  40. Zlokovic, B. V. The blood-brain barrier in health and chronic neurodegenerative disorders. Neuron. 57 (2), 178-201 (2008).
  41. Daneman, R. The blood-brain barrier in health and disease. Annals of Neurology. 72 (5), 648-672 (2012).
  42. Cecchelli, R., et al. Modelling of the blood-brain barrier in drug discovery and development. Nature Reviews. Drug Discovery. 6 (8), 650-661 (2007).
  43. Helms, H. C., et al. In vitro models of the blood-brain barrier: An overview of commonly used brain endothelial cell culture models and guidelines for their use. Journal of Cerebral Blood Flow & Metabolism. 36 (5), 862-890 (2016).
  44. Erickson, M. A., Wilson, M. L., Banks, W. A. In vitro modeling of blood-brain barrier and interface functions in neuroimmune communication. Fluids Barriers CNS. 17 (1), 26(2020).
  45. Musafargani, S., et al. Blood brain barrier: A tissue engineered microfluidic chip. Journal of Neuroscience Methods. 331, 108525(2020).
  46. Hajal, C., et al. Engineered human blood-brain barrier microfluidic model for vascular permeability analyses. Nature Protocols. 17 (1), 95-128 (2022).
  47. Oddo, A., et al. Advances in microfluidic blood-brain barrier (bbb) models. Trends in Biotechnology. 37 (12), 1295-1314 (2019).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на повторное использование текста или иллюстраций этой статьи JoVE

Запросить разрешение

Теги

in vitro

Похожие статьи