Культивирование органоидов глиомы ex vivo, полученных от пациентов, с помощью измельчителя тканей

Низкодифференцированные глиомы (LGG) представляют собой группу относительно редких опухолей головного мозга, которые, как правило, проявляются как медленно растущие и менее агрессивные по сравнению с глиомами высокой степени злокачественности, такими как глиобластома. Они могут возникать как у взрослых, так и у детей, с несколько большей распространенностью у взрослых. Точная распространенность варьируется в зависимости от региона и популяции, но на долю LGG приходится примерно 15–20% всех первичных опухолей головного мозга1. Стратегии лечения LGG часто включают комбинацию хирургического вмешательства, лучевой терапии и химиотерапии, направленные на максимизацию резекции опухоли при сохранении неврологической функции. Лечение ЛГГ может быть сложным, и выбор терапии может зависеть от таких факторов, как локализация опухоли и молекулярные характеристики². Прогресс в понимании генетических и молекулярных основ LGG привел к более целенаправленной терапии, и текущие исследования продолжают совершенствовать подходы к лечению.

С другой стороны, глиобластома, ИДГ-дикий тип, ЦНС 4-й степени (ГБМ) является наиболее распространенной первичной опухолью головного мозга, встречающейся у взрослых, с частотой заболеваемости 3,19-4,17 случая на 100 000 человеко-лет^. GBM вызывает такие симптомы, как головные боли, судороги, очаговый неврологический дефицит, изменения личности и повышение внутричерепного давления. Стандартное лечение ГБМ включает уменьшение объема опухоли, если это возможно, с последующей лучевой терапией в сочетании с темозоломидом⁴. Кроме того, комбинация темозоломида и ломустина может повысить медиану общей выживаемости у пациентов с метилированием промотора O 6-метилгуанин-метилтрансферазы (MGMT)⁵. Однако, несмотря на эти недавние терапевтические подходы, ГБМ остается неизлечимым заболеванием с плохим прогнозом, характеризующимся средней общей выживаемостью пациентов от 16 до 20,9 месяцев при добавлении полей для лечения опухолей (TTFields) ^3,6. Несколько иммунотерапевтических подходов были исследованы в GBM, но продемонстрировали ограниченную эффективность in vivo. Кроме того, клинические и доклинические ограничения препятствуют терапевтическим прорывам⁷. Создание подходящей и реалистичной модели ex vivo было сложной задачей из-за ^интер-8 и внутриопухолевой гетерогенности 9 GBM.

Обычные 2-мерные (2D) клеточные линии пациента представляют собой однородные клеточные популяции и подходят для высокопроизводительного скрининга лекарственных препаратов. Тем не менее, полученные от пациентов и иммортализированные клеточные линии не могут адекватно имитировать GBM из-за различий в условиях роста и отклонений в генотипических и фенотипических признаках после многократных пассажей 10,11,12.

С другой стороны, в последнее время в качестве перспективных систем появились 3D-модели органоидов, воспроизводящие фенотипическую и молекулярную гетерогенность органов и различных типов рака 13,14,15,16,17,18. В контексте ГБМ церебральные органоиды были генетически модифицированы для имитации опухолеподобных характеристик^16,17 или культивированы совместно с ГСК или сфероидами для индуцирования инфильтрации опухолевых клеток^18,19. В то время как полученные от пациентов органоиды GBM, культивируемые с помощью Matrigel и EGF/bFGF, демонстрируют такие признаки GBM, как гетерогенность стволовых клеток и гипоксия²⁰, остается неясным, в какой степени эта модель может представлять ключевые молекулярные свойства новообразований пациентов.

Органоиды GBM, полученные от пациентов (PDO), являются многообещающими моделями, которые могут сохранять преобладающие черты своих аналогичных родительских опухолей, включая гистологические характеристики, клеточное разнообразие, экспрессию генов и мутационные профили. Кроме того, они быстро внедряются при имплантации в мозг взрослых грызунов, обеспечивая реалистичную модель для тестирования лекарств и^{персонализированной терапии}. Тем не менее, ручное препарирование опухолевой ткани для создания PDO является трудоемким и дорогостоящим процессом. Таким образом, существует острая потребность в быстром методе, который может производить большое количество ЗОП, что позволяет проводить всестороннюю оценку различных терапевтических подходов, перспективных для индивидуализированного тестирования лекарственных средств. В этом исследовании описывается новый метод изготовления ЗОП непосредственно из свежерассеченной опухолевой ткани с использованием автоматического измельчителя тканей. Кроме того, PDO, полученные с помощью этого метода, сравнивали с препарированными вручную PDO у тех же пациентов с точки зрения количества PDO, морфологических особенностей, апоптоза и пролиферации опухолевых клеток.

Все пациенты проходили лечение в отделении нейрохирургии университетской клиники Вюрцбурга, Германия, после предоставления письменного информированного согласия в соответствии с Хельсинкской декларацией и одобренным Институциональным наблюдательным советом Вюрцбургского университета (#22/20-me). Опухолевый тканевой материал от четырех пациентов с ГБМ и одного пациента с астроцитомой, IDH-мутантной, ЦНС 2 степени (глиома низкой степени злокачественности, LGG) (табл. 1) был получен в результате операции и обработан по следующему протоколу. Автоматизированный процесс генерации PDO с использованием измельчителя тканей называется измельчителем (C), а процесс ручного разрезания ткани двумя скальпелями под микроскопическим контролем — ручным (M). Из образца опухоли были выделены шесть одинаковых по размеру (1-2^см3), затем каждый из них был разрезан пополам и обработан однородно с использованием двух методов. Из-за вышеупомянутой внутриопухолевой гетерогенности от каждого пациента была сгенерирована одна 6-луночная пластина для каждого подхода, при этом каждая лунка представляла ЗОП из разных участков в исходной опухоли. Обе процедуры проходили под ламинарным шкафом с воздушным потоком, и все используемые инструменты были стерилизованы перед использованием. Обзор подхода проиллюстрирован на рисунке 1.

1. Подготовка агарозных блоков (только для С-подхода, опционально)

1. Налейте 50 мл фосфатно-солевого буфера (PBS) в стакан, добавьте одну таблетку агарозы (см. Таблицу материалов) и хорошо перемешайте до получения суспензии.
2. Нагревайте смесь в микроволновке в течение 30-40 с, избегая при этом кипения. Затем охладите смесь до 47 °C.
3. Вылейте агарозную смесь в герметичную форму для литья в форме цилиндра и не допускайте образования пузырьков. Немедленно охладите гипс, используя замороженный (-20 °C) зажим или поместив его на сухой лед на 30 минут.

2. Обработка опухолевого материала

1. Подготовьте коробку со льдом, чтобы охладить опухолевый материал по пути из операционной в лабораторию.
2. Перенесите опухолевую ткань (4-5 см³) в стерильную пробирку объемом 50 мл, содержащую 25 мл Hibernate A (см. Таблицу материалов), покрывающую опухоль, и поместите пробирку в ледяной ящик.
3. Под ламинарным шкафом с воздушным потоком переместите опухолевый материал вместе с Hibernate A в стерилизованную стеклянную чашку Петри.
4. Удалите некротизированную ткань и осторожно рассеките кровеносные сосуды с помощью скальпеля и тканевых щипцов под микроскопическим контролем. Определите некротизированную ткань по геморрагическим участкам, демонстрирующим коричневатый оттенок в результате кровотечения, или ткани, демонстрирующей более бледный или белый вид по сравнению с соседней жизнеспособной тканью. Следите за тем, чтобы ткани не сдавливались и не нарушались.
5. Разрежьте опухолевый материал на шесть частей размером примерно 1-2^см3. Распределите кусочки по пластиковым чашкам Петри (n = 6), предварительно заполненным 3 мл среды H-GPSA (таблица 2), по²² мл каждая. Поставьте чашки Петри на лед.

3. Настройка измельчителя тканей

1. Расположите лезвие, как описано в руководстве производителя²³.
2. Отрегулируйте толщину ломтика до 0,45-0,50 мм. Установите усилие лезвия на среднее. Зафиксируйте ручку разблокировки стола в режиме «пуск».

4. Обработка кусочков опухолевой ткани

1. Обработка опухолевой ткани измельчителем (метод С)
   1. Разрежьте блоки агарозы на цилиндры длиной 2 см и приклейте один из этих цилиндров к круглой пластиковой посуде измельчителя с помощью гистоакрилового клея (см. Таблицу материалов).
   2. Создайте углубление в агарозном цилиндре с помощью скальпеля, а затем поместите опухолевую ткань из первой лунки (шаг 2.5) в эту ямку.
      ПРИМЕЧАНИЕ: С опухолевым материалом следует обращаться осторожно, не сдавливая и не проталкивая его в щель. Зазор должен быть достаточно большим, чтобы легко поместиться в опухоль, но достаточно маленьким, чтобы опухолевый материал оставался стабильным в процессе разрезания. Шаги 4.1.1. и 4.1.2. не являются обязательными.
   3. Установите пластиковый диск на монтажный диск режущего стола (см. Таблицу материалов).
   4. Включите измельчитель и нажмите кнопку сброса. Теперь измельчитель начинает резку (первый раунд). Машина автоматически останавливается после того, как стол доходит до конца и агароза и опухолевая ткань нарезаются до нужного диаметра.
   5. Поверните монтажный диск на 90°, а затем установите ручку разблокировки стола в начальный режим.
   6. Нажмите кнопку сброса и позвольте машине снова разрезать ткань, создав ткань прямоугольной формы (второй раунд).
   7. Извлеките пластиковый диск с обработанным материалом и осторожно поверните только опухолевую ткань на 90° с помощью тканевого шпателя.
   8. Поместите пластиковый диск на стол для резки, затем установите ручку разблокировки стола в начальный режим и нажмите кнопку сброса для окончательного раунда резки (третьего раунда).
   9. Выключите измельчитель и извлеките пластиковый диск. Очистите измельчитель и лезвия.
   10. С помощью одноканальной пипетки объемом 5 мл аспирируйте обработанный материал вместе со средой в пипетку и смывайте суспензию обратно в чашку.
   11. Повторите предыдущий шаг 2-3 раза, чтобы правильно отделить ткань.
   12. Поместите чашку Петри обратно на лед и повторите шаги (4.1.1-4.1.12.) с другими 5 чашками каждой опухоли.
2. Обработка опухолевой ткани вручную (метод М)
   1. Перенесите опухолевую ткань из первой пластиковой чашки Петри (шаг 2,5) вместе с 3 мл среды H-GPSA (табл. 2) в стеклянную чашку Петри. Рассеките отрезок вручную под микроскопом на срезы по 0,5 мм с помощью двух скальпелей.
   2. Перенесите рассеченную ткань обратно в пластиковую чашку Петри с помощью пипетки объемом 2 мл.
   3. Повторите шаги (4.2.1.-4.2.3.) для срезов опухоли в остальных пяти чашках Петри (шаг 2.5).

5. Промывание опухолевой ткани

1. Наклоните каждую чашку Петри вверх до 45° и подождите 30 с, пока кусочки опухоли не опустятся на дно чашки.
2. Осторожно отсасывайте 2,5 мл среды H-GPSA (Таблица 2) с помощью пипетки объемом 1 мл и следите за тем, чтобы не попасть в опухолевую ткань.
3. Добавьте 2 мл буфера для лизиса эритроцитов (см. таблицу материалов) к каждому образцу. Обработанные кусочки опухоли должны быть полностью покрыты лизисным буфером.
4. Поместите 6 тарелок на лабораторную орбитальную встряхивающую машину на низкой скорости на 10 минут.
5. Осторожно аспирируйте 2 мл лизисного буфера, чтобы не попасть в опухолевую ткань.
6. Повторите предыдущие этапы промывки (шаг 5.1-5.5) дважды, каждый раз используя 2 мл среды H-GPSA (Таблица 2) вместо буфера лизиса.

6. Культивирование опухолевой ткани

1. Аспирируйте среду H-GPSA (Таблица 2) из каждой чашки и замените ее 4 мл среды PDO (Таблица 2).
2. Переложите кусочки ткани каждой чашки в одну соответствующую лунку 6-луночной пластины со сверхнизкой насадкой (см. Таблицу материалов).
3. Поместите планшет на орбитальный шейкер внутри инкубатора и инкубируйте при 37 °C, 5%_CO2 и 150 об/мин в течение 2-4 недель.
4. Каждые два дня выполняйте замену половины среды, отсасывая 2 мл среды из каждой лунки и заменяя ее 2 мл свежей среды PDO (таблица 2), предварительно подогретой до 37 °C.
5. Осмотрите ткань под микроскопом (морфология, рост, средняя окраска) и вырежьте растущие PDO (>0,7 мм) или адгезивную ткань для предотвращения гипоксии тканей.
   1. Для этого перенесите PDO из лунки со сверхнизким креплением в стерилизованную стеклянную чашку Петри и используйте скальпель для резки. Кроме того, адгезивные PDO можно устранить, аспирировав их с помощью пипетки объемом 1 мл. Будьте осторожны, не сжимайте PDO и обращайтесь с ними осторожно.
6. Оцените образование PDO, подсчитывая PDO каждые два дня, и тщательно проверьте желаемую круглую морфологию (рис. 2).

7. Фиксация и встраивание PDO

1. Зафиксируйте два ЗОП из каждой лунки каждого пациента 4% формалином в течение 24 ч после 6 недель посева.
2. Погрузите фиксированные PDO в нейтрально буферизованный (фосфат натрия) формалин до внедрения.
3. Поместите каждый PDO в кассету (см. Таблицу материалов) для дальнейшей обработки.
4. Запустите процесс обезвоживания, погрузив кассету в следующие растворы, как указано в ПРИМЕЧАНИИ ниже:
   ПРИМЕЧАНИЕ: 50% этанол в течение 20 мин, 70% этанол в течение 20 мин, 80% этанол в течение 20 мин, 96% этанол в течение 20 мин, 100% этанол в течение 20 мин, 100% этанол в течение 30 мин, 100% этанол + хлороформ (соотношение 1:1) в течение 30 мин, 100% этанол + хлороформ (соотношение 1:1) в течение 30 минут, Абсолютный хлороформ в течение 30 мин, Абсолютный хлороформ в течение 30 мин, Парафин в течение 30 мин, парафин в течение 30 мин с использованием STP 120.
5. Обезвоженные PDO помещают в парафин при температуре 58-60 °C.
6. Нарежьте встроенные PDO толщиной 2,5 мкм и закрепите их на предметных стеклах для окрашивания.

8. Иммунофлуоресцентное окрашивание

1. Устанавливают PDO через 6 недель культивирования.
2. Затем проводят двойное окрашивание глиального фибриллярного кислого белка (GFAP, разведение: 1:100) и маркера пролиферации Ki67 (разведение: 1:1000) (см. таблицу материалов), как сообщалось ранее²².
3. Аналогичным образом, оценивают апоптоз путем двойного окрашивания PDO против GFAP и антикаспазы-3 (CC3, разведение: 1:400) (см. таблицу материалов).
4. Получение изображений PDO с помощью флуоресцентного микроскопа с 40-кратным увеличением.
5. Проанализируйте изображения на наличие GFAP-, Ki67- и CC3-положительных клеток, а также GFAP/Ki67 и GFAP/CC3-положительных клеток.
6. Используйте программу с открытым исходным кодом Fiji (ImageJ-win 32) для анализа изображений.

9. Оценка и анализ данных

1. Делайте ежедневные микроскопические снимки яркого поля в течение первой недели культивирования при стандартных настройках и 5-кратном увеличении.
2. Наблюдайте за морфологическими изменениями и отслеживайте процесс созревания как при ручной, так и при автоматизированной обработке.
3. Проводите морфологический анализ с помощью микроскопа в стандартных настройках режима светлого поля.
4. Оцените количество и морфологию ЗОП в течение первых 4 недель бактериологического исследования у всех пяти пациентов.
5. Получите три показания каждого количества PDO от каждого пациента, чтобы рассчитать среднее значение и стандартную ошибку среднего значения (SEM).
6. Исследуйте пролиферацию и апоптоз при ЗОП у трех пациентов.
7. Проанализируйте данные с помощью коммерчески доступного статистического программного пакета (см. Таблицу материалов).
8. Примените U-тесты Students-T и Mann-Whitney U, чтобы определить различия между ручной и автоматической генерацией PDO с точки зрения количества PDO, пролиферации и апоптоза.

Четыре пациента с ГБМ и один с ЛГГ были включены в исследование после патологического подтверждения опытным невропатологом (ШМ). У большинства пациентов был выявлен неметилированный промотор MGMT, и все пациенты с ГБМ относились к дикому типу IDH1 и IDH2 (табл. 1). В среднем производственный процесс длился 88,8 мин (+/- 6,3 мин) при подходе С и 322 мин (+/- 17,2 мин) при подходе М. Общий показатель успеха составил 87% при ручном и 93% при измельчителе после 4 недель культивирования (n = 5). Более того, PDO, полученные из группы C, достигали желаемой округлой формы в течение 1 недели и были достаточно зрелыми, чтобы их можно было использовать в экспериментах in vitro , в то время как PDO группы M в основном оставались резко очерченными и неопределенными (рис. 2). Опухолевая ткань, обработанная с помощью С-подхода, привела к возникновению 281 ЗОП (в среднем на пациента = 56 +/- 43) после первой недели культивирования, в то время как 250 ЗОП (в среднем на пациента = 50 +/- 41) развились при М-подходе. В течение второй недели культивирования ткани всех пяти пациентов давали более высокие показатели PDO, когда они были получены с помощью С-подхода (801; Среднее значение на пациента = 130 +/- 38) по сравнению с М-подходом (601; Среднее значение на пациента = 76 +/- 44; Р = 0,018). В течение третьей недели культивирования в рамках С-подхода было накоплено в общей сложности 1105 ЗОП от всех пациентов (среднее значение на пациента = 221 +/- 32) по сравнению с 771 ЗОП (среднее на пациента = 155 +/- 34) при М-подходе (P = 0,032). Кроме того, в общей сложности 1195 PDO (среднее значение на пациента = 239 +/- 50) сформировалось после четырех недель культивирования при использовании подхода C по сравнению с 784 (среднее значение на пациента = 157 +/- 36) с использованием подхода M (P < 0,01). Таким образом, метод С показал значительно более высокое количество PDO, начиная со второй недели (рис. 3). Кроме того, относительные колебания количества PDO были оценены для изучения динамических тенденций между последовательными неделями. Анализ выявил впечатляющий всплеск количества PDO во время первоначального перехода от первой к второй неделе подхода C (265%), что свидетельствует о быстром прогрессе. Впоследствии в течение третьей недели наблюдался более низкий рост числа (75%), что отражает временную корректировку. В отличие от этого, М-подход продемонстрировал последовательное и устойчивое увеличение количества ЗОП (92% на второй неделе, соответственно 67% на третьей неделе), что способствовало заметной стабильности подсчетов в течение четвертой недели. Эта устойчивая тенденция к увеличению количества PDO подчеркивает надежность и устойчивость подхода C на протяжении всего периода наблюдения.

Два пациента с ГБМ и один пациент с ЛГГ были включены для анализа числа астроцитов (GFAP) в PDO, пролиферации клеток PDO (Ki67) и апоптоза (CC3). Определенное количество астроцитов не выявило существенных различий между двумя методами обработки, в среднем 43% при подходе С и 45% при подходе М (Рисунок 4 и Рисунок 5, Дополнительный рисунок 1 и Дополнительный рисунок 2). Аналогичным образом, темпы распространения в ЗОП были сопоставимы между подходами С (3%) и М (1%). Только PDO, полученные с помощью С-подхода от пациента 5, показали скорость пролиферации 26% по сравнению с 1% при М-подходе (P = 0,001; Рисунок 4В). В целом низкие показатели апоптоза были выявлены в ЗОП, обработанных с помощью подхода С (3%) по сравнению с 2% при подходе М для всех пациентов, которые существенно не отличались (рис. 5С). Кроме того, не было существенной разницы между этими двумя методами в отношении количества астроцитов, подвергающихся апоптозу (рис. 5D).

Рисунок 1: Графический обзор процесса производства органоидов, полученных от пациента (PDO), с использованием автоматизированного измельчителя в сравнении с ручным подходом. На рисунке показаны различные этапы, включая (A) сбор образцов, (B) вскрытие опухолевого материала, (C) промывку и (D) инкубацию. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этого рисунка.

Рисунок 2: Морфология PDO в течение первой недели культивирования. Сравнение образования ЗОП после вскрытия как автоматическим измельчителем, так и ручным методом. Масштабные линейки = 1000 мкм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Рисунок 3: Количество PDO в течение первых четырех недель культивирования. На оси X отображается время в неделях (W), а на оси Y — количество PDO подхода C (синий) и M (красный) (n = 5). Каждая точка данных представляет среднее значение, а столбцы погрешности указывают стандартную ошибку среднего значения. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этого рисунка.

Рисунок 4: Скорость пролиферации клеток в PDO. (A) Репрезентативные иммунофлуоресцентные изображения (n = 3) GFAP-положительных клеток (зеленый), Ki67-положительных клеток (красный) и DAPI (синий) в PDO у пациентов 3, 4 и 5 (Таблица 1). Все PDO обрабатывались с использованием измельчителя (С) и ручного (М) методов. Масштабные линейки = 100 мкм. (B) Сравнение двух методов относительно относительного числа GFAP-положительных клеток, (C) Ki67-положительных клеток и (D) Ki67/GFAP-двойных положительных клеток. Незначимые результаты обозначаются знаком "ns". Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этого рисунка.

Рисунок 5: Скорость апоптоза в ЗОП. (A) Репрезентативные иммунофлуоресцентные изображения (n = 3) GFAP-положительных клеток (зеленый), CC3-положительных клеток (красный) и DAPI (синий) в ЗОП у пациентов 3, 4 и 5 (Таблица 1). Все PDO обрабатывались с использованием измельчителя (С) и ручного (М) методов. Масштабные линейки = 100 мкм. (B) Сравнение двух методов относительно относительного числа GFAP-положительных клеток, (C) CC3-положительных клеток и (D) CC3/GFAP-двойных положительных клеток. Незначимые результаты обозначаются знаком "ns". Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этого рисунка.

Таблица 1: Характеристика пациентов и клинические показатели. GBM = глиобластома, ИДГ-дикий тип, ЦНС 4 степени по классификации ВОЗ; LGG = глиома низкой степени злокачественности; KPS = оценка производительности Карновского; MGMT = O 6-метилгуанин-ДНК-метилтрансфераза; IDH1 = изоцитратдегидрогеназа 1, IDH2 = изоцитратдегидрогеназа 2, ATRX = α-талассемия/умственная отсталость, Х-сцепленный ген; M = морфология; CC = количество ячеек; p = пролиферация; А = апоптоз. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы скачать эту таблицу.

Таблица 2: Средние составы. H-GPSA = Hibernate A-Glutamax pencillin стрептомицин амфотерицин B. PDO = органоиды, полученные от пациентов DMEM: модифицированная среда Дульбекко. NEAA: заменимые аминокислоты. Стрептококк ручки: Пенициллин / Стрептомицин Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы скачать эту таблицу.

Таблица 3: Обзор используемых методов для создания моделей клеточных культур. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы скачать эту таблицу.

Дополнительный рисунок 1: Отдельные каналы пролиферационного окрашивания PDO. (A) DAPI (синий), (B) GFAP-положительные клетки (зеленый), (C) Ki67-положительные клетки (красный) и (D) оверлейный канал в PDO у пациентов 3, 4 и 5. Масштабные линейки = 100 мкм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить этот файл.

Дополнительный рисунок 2: Отдельные каналы апоптозного окрашивания ЗОП. (A) DAPI (синий), (B) GFAP-положительные клетки (зеленый), (C) CC3-положительные клетки (красный) и (D) оверлейный канал в PDO у пациентов 3, 4 и 5. Масштабные линейки = 100 мкм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить этот файл.

Авторам нечего раскрывать.