Методическая статья

Измерение изменений целостности эндотелиального барьера головного мозга с помощью двух биосенсоров на основе импеданса в ответ на раковые клетки и цитокины

DOI:

10.3791/65959

⸱

22 сентября 2023 г.

 ,  ,  , 
1Department of Molecular Medicine and Pathology, School of Medical Sciences, University of Auckland, 2Centre for Brain Research, University of Auckland, 3School of Biological Sciences, University of Auckland

В этой статье

Краткое содержание

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

В данной работе мы демонстрируем методику использования биосенсоров на основе импеданса: ECIS и cellZscope для измерения прочности эндотелиального барьера головного мозга. Мы подробно описываем подготовку и технику добавления различных стимулов в модель эндотелия головного мозга in vitro . Мы измеряем, записываем и проводим репрезентативный анализ полученных результатов.

Аннотация

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Гематоэнцефалический барьер (ГЭБ) защищает паренхиму мозга от вредных патогенов в крови. ГЭБ состоит из нервно-сосудистой единицы, состоящей из перицитов, астроцитарных отростков стопы и плотно прилегающих эндотелиальных клеток. Здесь эндотелиальные клетки мозга образуют первую линию барьера против патогенов, передающихся через кровь. При таких состояниях, как рак и нейровоспаление, циркулирующие факторы в крови могут нарушить этот барьер. Прогрессирование заболевания значительно ухудшается после разрушения барьера, которое обеспечивает доступ к областям мозга или их нарушение. Это значительно ухудшает прогнозы, особенно из-за ограниченных вариантов лечения, доступных на уровне мозга. Следовательно, новые исследования направлены на изучение потенциальных терапевтических средств, которые могут предотвратить взаимодействие этих вредных факторов в крови с эндотелиальными клетками мозга.

Коммерчески доступные приборы Electric Cell-Substrate Impedance Sensing (ECIS) и cellZscope измеряют импеданс на клеточных монослоях, таких как эндотелий BBB, чтобы определить их барьерную прочность. В данной статье мы подробно описываем использование обоих биосенсоров для оценки целостности эндотелиального барьера мозга при добавлении различных стимулов. Важно отметить, что мы подчеркиваем важность их высокой пропускной способности для параллельного исследования нескольких переменных и биологических методов лечения.

Введение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

В данной статье рассматриваются современные тенденции в оценке микрососудистых клеток. В частности, подробно описывается использование двух коммерчески доступных платформ для измерения барьерных свойств клеток микрососудистого эндотелия головного мозга. Эндотелиальные клетки – это клетки, обращенные к крови, которые выстилают стенку сосуда. Тем не менее, микрососуды головного мозга уникальны, поскольку они помогают формировать защитный гематоэнцефалический барьер (ГЭБ)1,2,3. ГЭБ функционирует для регулирования транспортировки молекул из крови в мозг. Периферические заболевания, поражающие центральную нервную систему (ЦНС), обычно связаны с функциональным отказом ГЭБ 4,5. Анатомические структуры, образующие ГЭБ, отсутствуют на границе между кровью и тканью в других частях тела6. Эти анатомические структуры состоят из перицитов, которые расположены близко к эндотелиальным клеткам мозга и регулируют их пролиферацию и проницаемость; астроцитарные отростки стопы, которые участвуют в перетасовке питательных веществ и анатомической поддержке 7,8; микроглии, которые являются резидентными макрофагами в головном мозге, часто участвующими в нейровоспалении и ишемии 9,10,11,12, и эндотелий мозга, который образует монослой плотно прилегающих клеток без фенестраций13,14. Эндотелий головного мозга обычно известен как «эндотелиальный барьер мозга» и образует структурный и функциональный барьер пятью различными способами. Во-первых, парацеллюлярный барьерный компонент формируется путем адгезии в латеральных межклеточных соединениях. Во-вторых, трансцеллюлярный барьерный компонент поддерживается за счет регуляции эндоцитоза. В-третьих, специализированная базальная мембрана закрепляет и поддерживает эндотелий через богатый внеклеточный матрикс, состоящий в основном из коллагена15,16. Последние два механизма осуществляются через ферменты и транспортеры, которые помогают регулировать метаболизм лекарств и поглощение крупных молекул, соответственно17.

Парацеллюлярные взаимодействия образуют основной компонент эндотелиального барьера мозга, чему способствуют плотные соединения (TJ), состоящие из мембранных белков клаудинов, окклюдина и соединительных молекул адгезии (JAM)18. Сильное гомотипическое связывание мембранных белков образует первый структурный барьер, хотя JAMs также связываются с добавочными белками zonula occludens, связывая таким образом TJ с актиновым цитоскелетом19,20. Актиновые звенья размещают TJ в апикальной области эндотелия21, которая функционально поляризует эндотелиальные клетки, образуя структурный барьер на этой апикальной или «обращенной к крови» стороне. В базолатеральной области эндотелия узкоспециализированные адгезивные соединения (AJ) играют регуляторную роль в поддержании морфологии клетки. AJ содержат кальций-зависимые кадгерины, которые связывают цитоскелет соседних эндотелиальных клеток через комплекс семейства катенинов 20,22. Сосудистый эндотелиальный кадгерин (VE-кадгерин) является одним из таких кадгеринов, который регулирует экспрессию белков TJ и общую функцию эндотелиального барьера для поддержания целостности эндотелиального монослоя 23,24,25,26,27. Модуляторы воспаления, такие как фактор некроза опухоли-альфа (TNFα), сигнализируют об интернализации VE-кадгерина от клеточных соединений, что приводит к дестабилизации эндотелиального барьера 28,29,30. Молекула адгезии эндотелиальных клеток тромбоцитов (PECAM)31 является еще одним кадгерином AJ, который стабилизирует и ремоделирует эндотелиальные соединения32,33. Плотность этих соединительных белков ограничивает поток электронов через парацеллюлярное пространство между эндотелиальными клетками. Этот атрибут используется для измерения прочности эндотелиального барьера или трансэндотелиального электрического сопротивления (TER) на монослоях сливающихся клеток, таких как эндотелий мозга.

Терапевтические исследования сосредоточены на эндотелии головного мозга из-за его жизненно важной роли на границе между кровью и мозгом. Некоторые заболевания негативно влияют на эндотелий головного мозга, в том числе нейровоспалительные состояния, такие как рассеянный склероз, инсульт, нейродегенеративные заболевания и рак 34,35,36,37. Как только эндотелиальный барьер мозга нарушается, прогрессирование заболевания значительно ухудшается, поскольку мозг эффективно подвергается воздействию вредных раздражителейв крови. Ранее мы показали, что медиаторы воспаления и клетки метастатической меланомы разрушают эндотелиальный барьер мозга с помощью двух технологий, которые измеряют прочность эндотелиального барьера 39,40,41.

Измерение импеданса между электрической клеткой и субстратом (ECIS) — это биосенсор на основе импеданса, который позволяет в режиме реального времени и без меток оценивать целостность эндотелиального клеточного барьера. При этом пробирные скважины облицовываются позолоченными электродами, которые подают переменный ток (AC) в пробирную систему. Эндотелиальные клетки мозга засеиваются в эти лунки, что означает, что АК может быть введен через клетки. (Рисунок 1А - колодец; вид сбоку). При этом устанавливается электрическая цепь, которая используется для расчета импеданса (Рисунок 1А - принципиальная схема). Импеданс увеличивается, когда эндотелиальные клетки мозга прилипают к пластине и начинают формировать свои парацеллюлярные соединения. Импеданс стабилизируется, когда эндотелиальные клетки сливаются, образуя монослой и ограничивая поток тока. Применение переменного тока на разных частотах влияет на маршрут протекания тока через эндотелиальные клетки. Ток протекает через тело эндотелиальной клетки при подаче с более высокой частотой (>10,4 Гц). Это дает информацию о емкости монослоя ячейки, используемую для оценки прикрепления и распространения ячейки. На низких частотах (102-10 4 Гц) импеданс мембраны высокий, что ограничивает протекание тока через клетки. В этом случае большая часть тока перемещается между ячейками. При частоте около 4000 Гц сопротивление протеканию тока объясняется в основном эндотелиальными межклеточными соединениями через межклеточное пространство. Таким образом, любое изменение сопротивления на этой частоте дает информацию о целостности эндотелиального барьера.

В то время как измерения необработанного импеданса могут дать представление о свойствах барьера, программное обеспечение ECIS может затем математически смоделировать общее сопротивление, измеренное на нескольких частотах переменного тока, и более точно разделить его на два ключевых параметра целостности барьера. Этими параметрами являются парацеллюлярная резистентность между боковыми мембранами соседних клеток (резистентность бета-Rb; парацеллюлярный барьер; Рисунок 1А - зеленые стрелки) и базолатеральное сопротивление между базальным клеточным слоем и электродом (сопротивление альфа-альфа; базолатеральный барьер; Рисунок 1А - синие стрелки). Третий моделируемый параметр также измеряется как емкость клеточной мембраны (Cm; Рисунок 1А - красные стрелки). Cm отображает емкостное течение тока через ячейки, указывающее на состав клеточной мембраны. В данном случае изменения в Rb или парацеллюлярном барьере указывают на изменения в TJ и AJs, имеющие решающее значение для поддержания целостности эндотелиального барьера. Для надежной интерпретации Rb были сделаны четыре ключевых предположения, разработанных Джайевером и Кисом42 и критически рассмотренных Столвейком и др.43. Хотя эти предположения важны для обеспечения достоверности моделирования ECIS, они легко удовлетворяются сливающимся эндотелиальным монослоем.

Как и ECIS, cellZscope позволяет измерять изменения сопротивления эндотелиального барьера; Тем не менее, клетки культивируются на пористой мембранной вставке. В этой системе электрическая цепь находится между двумя электродами по обе стороны от мембранной вставки. Эндотелиальный монослой культивируется поверх этой мембранной вставки, что позволяет измерять трансэндотелиальное электрическое сопротивление (TER) (рисунок 1B-лунка; вид сбоку). Как и в случае с ECIS, в этой системе суммарный импеданс может быть отнесен к нескольким барьерным компонентам, зависящим от частоты приложенноготока 44. На низких частотах емкость электродов (CEl) доминирует над общим импедансом системы. В качестве альтернативы, на высоких частотах сопротивление среды (R-среды) доминирует над общим импедансом. Следовательно, наиболее полезные измерения находятся в диапазоне средних частот (10 2-10 4 Гц), который дает информацию о двух ключевых компонентах эндотелиального барьера (Рисунок 1B - Принципиальная схема). Во-первых, при частоте 103-10 4 Гц емкость клеточного слоя (CCl) доминирует над общим импедансом, поскольку сопротивление мембраны (R-мембрана) достаточно велико, чтобы им можно было пренебречь, и ток протекает преимущественно через конденсатор. Следовательно, CCl указывает на изменения резистентности через клеточную мембрану. В качестве альтернативы, TER преимущественно передает общий импеданс на частоте 102-10 3 Гц, где поток тока направляется через соединительные пространства между соседними клетками, удерживаемые вместе соединительными белками. Следовательно, это дает информацию о парацеллюлярном компоненте эндотелиального барьера, как это было ранее с Rb на ECIS.

На рисунке 1C подробно описано, как определенные области эндотелия мозга разрушаются при лечении клетками меланомы. Это нарушение обнаруживается биосенсорами по изменению потока тока через парацеллюлярное пространство (измеряется как Rb или TER); базолатеральное пространство (измеряется как Альфа); и клеточная мембрана (измеряется как Cm или CCl). Мы использовали оба биосенсора, подробно описанные в этом введении, для измерения изменения эндотелиального барьера мозга после лечения различными стимулами, такими как цитокины или инвазивные клетки меланомы. Измеренное сопротивление уменьшается, если данный стимул разрушает эндотелиальный барьер, создавая путь наименьшего сопротивления для пропускания тока. Следовательно, снижение «барьерного сопротивления» предполагает потерю целостности барьера или нарушение эндотелиального барьера мозга. В этих анализах мы изучили это нарушение, интерпретируя резистентность и смоделированные параметры в режиме реального времени. Применение ECIS и cellZscope для решения таких исследовательских вопросов подробно описано в других разделах 39,41,45,46.

Исследования in vitro позволяют обнаружить важнейшие механизмы заболевания за счет выявления молекул и функциональных путей, которые прогрессируют заболевание. Однако для этого требуется надежная репликация заболевания in vitro, которое существенно отличается от функционирующего организма. В идеальном сценарии исследования in vitro должны быть воспроизводимыми, неинвазивными, не имеющими меток, количественными и имитирующими структурные воздействия, обнаруженные in vivo. В этой статье мы подробно описываем методологию использования этих двух конкурирующих технологий для измерения индуцированных лечением изменений целостности эндотелиального барьера головного мозга. Мы обсуждаем преимущества объединения их результатов для получения более полной картины разрушения барьеров и делимся ограничениями, которые еще предстоит преодолеть.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Использование ECIS для мониторинга изменений целостности эндотелиального барьера головного мозга в ответ на различные методы лечения

  1. Настройка программного обеспечения, массивной станции и машины
    1. Подключите к машине 96-луночную матрицу. Поместите матрицу в полиэтиленовый пакет и поместите ее в инкубатор не менее чем за 1 час до анализа, чтобы она прогрелась. Снимите полиэтиленовый пакет непосредственно перед экспериментом.
    2. Когда все будет готово, включите автомат и откройте соответствующее программное обеспечение на компьютере. Нажмите кнопку «Настройка » на вкладке «Сбор данных ». Программное обеспечение выполнит проверку соединения, в ходе которой будет определен тип подключенного адаптера (например, станция с 96-луночным массивом) и отобразится красный цвет на изображенной карте пластин. Это означает, что программное обеспечение обнаруживает адаптер, но не может обнаружить прикрепленную пластину. Теперь система готова к работе с 96-луночным планшетом.
  2. Подготовка 96-луночной биосенсорной пластины
    ПРИМЕЧАНИЕ: Используется 96-луночная схема с планшетами. Основание каждой лунки украшено вставными пальцами позолоченных электродов. Пластины поставляются в стерильных упаковках, которые следует открывать только в стерильном колпаке/шкафу биологической безопасности. Золотые электроды сначала должны быть химически стабилизированы путем добавления 10 мМ цистеина для поддержания емкости электрода.
    1. Приготовьте 10 мМ цистеина в стерильном корыте и с помощью многоканального дозатора тщательно внесите пипеткой по 100 мкл в каждую лунку. Инкубируйте цистеин в течение 15 минут при комнатной температуре, а затем осторожно отсасывайте, пипетируя только по краям лунки, чтобы не поцарапать электрод. Смойте цистеин не менее 2 раз стерильной деионизированной водой (не PBS) с использованием той же техники пипетирования.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Пластинчатые электроды также могут быть стабилизированы электрически с использованием теплой среды на аппарате ECIS, вместо использования цистеинового покрытия, как указано в протоколе производителя.
    2. Подготовьте подложку ECM, которая будет действовать как базальная мембрана на дне колодца.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Субстраты ВКМ, такие как коллаген или ламинин, могут быть выбраны в зависимости от требований линии эндотелиальных клеток мозга. Здесь мы используем коллаген для линии микрососудистых эндотелиальных клеток головного мозга человека (hCMVEC).
    3. Приготовьте 1 мкг/см2 коллагена крысиного хвоста, растворенного в 0,02 М уксусной кислоты в свежем стерильном корыте (100 мкл на лунку). Оставьте коллаген на 1 час при слабом освещении в стерильной вытяжке, затем тщательно промойте 2 раза деионизированной водой и тщательно пипетируйте.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Убедитесь, что после последней мойки как можно тщательнее удалено как можно больше деионизированной воды, и дайте пластине высохнуть в вытяжке. Рекомендуется использовать пластину вскоре после нанесения покрытия; однако его можно временно хранить в воде при температуре 4 °C (менее недели). Теперь пластина готова к использованию.
  3. Подготовка эндотелиальных клеток головного мозга к посеву на 96-луночный биосенсорный планшет
    ПРИМЕЧАНИЕ: Рекомендуется сначала оптимизировать фазу роста и плотность посева используемой эндотелиальной клеточной линии. В этом протоколе использовалась линия hCMVEC, которой требуется 48 часов для достижения слияния после засеивания 20 000 клеток на лунку в 96-луночном планшете.
    1. Соберите эндотелиальные клетки мозга в стерильном колпаке с помощью щадящего диссоциативного реагента и проведите точный подсчет клеток. Используйте 20 000 hCMVEC в 100 μл среды на лунку для устойчивой фазы роста в течение 48 часов. Подготовьте избыточные эндотелиальные клетки головного мозга, чтобы обеспечить оптимальное пипетирование всех 96 лунок.
      Примечание: Следовательно, для 96-луночного планшета требуется приблизительно 2 000 000 клеток в 10 мл предварительно подогретой среды.
    2. Перенесите эндотелиальные клетки мозга в свежую стерильную кормушку и с помощью многоканальной пипетки осторожно добавьте 100 мкл (20 000 клеток) клеточной суспензии в лунку. Регулярно аккуратно суспендируйте клетки в желобке, чтобы избежать оседания эндотелиальных клеток с течением времени. Убедитесь, что в 1 лунке есть только среда и нет ячеек для математического моделирования (лунка без ячеек) и что вся пластина засеяна в течение 30 секунд.
  4. Начало эксперимента
    1. Осторожно прикрепите пластину к адаптеру в инкубаторе, переместив красные зажимы с обеих сторон адаптера пластины наружу. Совместите лунку A1 пластины с областью A1 адаптера. Аккуратно удерживайте тарелку на месте, одной рукой сверху, а другой рукой верните красные зажимы на место.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Убедитесь, что пластина устойчива в адаптере.
    2. Закройте инкубатор и снова нажмите «Настройка ». Ищите на карте пластин зеленые скважины, указывающие на правильно обнаруженные скважины. Все лунки, показанные красным цветом, имеют ошибку подключения. Чтобы это исправить, быстро прикрепите пластину обратно,
      ПРИМЕЧАНИЕ: Чрезмерное время, затрачиваемое на попытки починить колодцы с плохим соединением, может поставить под угрозу здоровье клеток.
    3. Нажмите кнопку Check (Контроль ), чтобы повторно проверить вложения в качестве показаний абсолютного импеданса. На это уйдет несколько минут.
    4. Нажмите стрелку под картой номеров, чтобы убедиться, что выбран правильный каталог номеров. В данном случае это 96w20idf.
    5. Нажмите многочастотную кнопку, чтобы убедиться, что импеданс измеряется на нескольких частотах переменного тока для будущего математического моделирования.
    6. Нажмите кнопку «Старт», чтобы начать эксперимент. Позвольте ячейкам размножаться в течение ~48 ч и образуйте их типичный монослой с высоким сопротивлением, измеряемым увеличением омов.
  5. Лечение эндотелиальных клеток головного мозга раковыми клетками или цитокинами на 96-луночном планшете
    ПРИМЕЧАНИЕ: Поскольку 96-луночный планшет позволяет проводить одновременное тестирование нескольких стимулов, подготовьте четкую карту планшета с желаемыми вариантами лечения (Дополнительный рисунок S1-низ). Каждое лечение можно и нужно проводить по крайней мере в трех (три повторяющиеся скважины) для обеспечения статистического анализа; Тем не менее, четыре реплики показаны в Дополнительный рисунок S1.
    1. В 48 ч проверьте рост эндотелиальных клеток головного мозга. Убедитесь, что достигнуто плато, прежде чем готовить лечебные растворы.
      Примечание: Различным линиям эндотелиальных клеток может потребоваться разное время, чтобы достичь плато. Следовательно, их фаза роста и плотность посева должны быть оптимизированы до проведения этого эксперимента. Скважины обычно должны выйти на плато в течение того же часа. В противном случае они могут быть скомпрометированы или неправильно дозированы и не должны быть включены.
    2. Для обработки цитокинами готовят соответствующие концентрации цитокинов в предварительно подогретых полноценных средах вместе с соответствующими средствами их транспортировки и контролем среды.
      1. Приготовьте цитокины в концентрации, в 2 раза превышающей конечную желаемую концентрацию, так как они будут разбавлены в соотношении 1:1 при добавлении в каждую лунку, содержащую эндотелиальные клетки мозга.
      2. Чтобы каждую обработку можно было проводить в трех экземплярах, подготовьте все цитокины в объеме более 300 мкл общего объема (т.е. не менее 350 мкл в целом) для добавления 100 мкл на лунку.
    3. Для лечения клетками соберите клетки (три различные клеточные линии меланомы, полученные от пациента, используемые в этом протоколе) с помощью мягкого реагента для диссоциации и проведите точный подсчет клеток. Проводите клеточное лечение с максимальным соотношением эффектор:мишень (соотношение E:T) 1:1, где клетки лечения являются эффекторными клетками (например, клетки меланомы), а эндотелиальные клетки мозга являются клетками-мишенями, т.е. добавьте 20 000 клеток меланомы к 20 000 эндотелиальных клеток мозга на лунку.
      1. При необходимости последовательно разбавляйте для меньших соотношений E:T 1:10 или 1:100. Чтобы обеспечить обработку в тройных лунках, подсчитайте ячейки и подготовьте их в более чем 300 мкл от общего объема (т.е. не менее 350 мкл всего) для добавления 100 мкл на лунку.
    4. Этикетируйте полипропиленовые кластерные пробирки объемом 1,1 мл, которые поставляются в формате 8-луповой полоски (т.е. полосковые пробирки объемом 1 мл), в соответствии с картой 96-луночных планшетов (дополнительный рисунок S1-Top). Вставьте полосковые трубки в пластины для полосковых трубок и автоклавируйте их перед началом эксперимента. Добавьте общий объем лечебных цитокинов или клеток (т.е. полные 350 мкл лечения) в стерильные полосковые пробирки и оставьте их в инкубаторе для сохранения тепла.
    5. В программном обеспечении нажмите кнопку Пауза , чтобы приостановить эксперимент. Это может занять несколько секунд. Сделав паузу, откройте инкубатор и осторожно отсоедините оба красных зажима одной рукой, одновременно стабилизируя пластину другой рукой. Поставьте эксперимент на паузу и поднесите пластину к стерильному капюшону.
    6. Извлеките пробирки с лечебной полоской из инкубатора. С помощью многоканальной пипетки осторожно ресуспендируйте содержимое полосковых пробирок для лечения, а затем добавьте 100 μл лечебных пробирок из полосковых пробирок в правильные лунки на 96-луночной пластине, не касаясь дна лунки. Осторожно добавляйте обработку во все лунки и среды только в лунку без клеток и завершите этот этап менее чем за 5 минут для полного 96-луночного планшета, так как чрезмерное охлаждение повлияет на сопротивление эндотелиального монослоя.
    7. Верните обработанную пластину в машину, прикрепите ее, как было сделано ранее, а затем снова проверьте соединения электродов с адаптером, нажав Setup | Есть.
    8. Убедитесь, что выбраны правильные настройки каталога пластин и многочастотного сбора данных, и нажмите кнопку Возобновить , чтобы продолжить эксперимент. Дождитесь продолжения эксперимента и выполняйте его до нужной конечной точки.
    9. Нажмите Finish для завершения эксперимента, который автоматически сохранит записанный файл abp. Перейти к Файл | Экспортируйте данные, чтобы получить этот файл в формате xls. или CSV. файл для дальнейшего анализа.

2. Использование cellZscope для мониторинга изменений целостности эндотелиального барьера головного мозга в ответ на различные методы лечения

  1. Подготовка металлических компонентов аппарата, адаптера и пористой мембранной вставки
    1. Последовательно очистите металлические компоненты деионизированной водой, затем 70% этанолом, а затем снова деионизированной водой.
    2. Автоклавируйте нижний электрод или «горшки» и верхние электроды погружения и стерилизуйте все остальные компоненты модуля ячейки с помощью 70% этанола.
    3. В стерильном колпаке установите все 24 нижних электрода/«горшка», вкрутив их в модуль ячейки, заботясь о сохранении стерильности на всем протяжении.
    4. Добавьте в лунки 900 μл основного материала.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Базовая среда добавляется в нижнее отверстие, которое действует как базальный компартмент эндотелия. Рекомендуется не использовать сыворотку в этом компартменте, чтобы более достоверно воспроизводить базальную среду эндотелия головного мозга.
    5. Подсоедините погружные электроды с помощью магнита к крышке модуля ячейки и закройте крышку над лунками так, чтобы погружные электроды вошли в нижние электродные горшки.
    6. Прикрепите клеточный модуль к адаптеру в инкубаторе и оставьте его минимум на 1 час для балансировки. На этом этапе откройте программное обеспечение для загрузки карты экспериментальной пластины на вкладке «Макет », тем самым встраивая карту экспериментальной пластины в файлы, которые в конечном итоге будут содержать данные.
    7. Если требуется нанесение покрытия, нанесите покрытие на мембранные вставки в стерильный колпак, используя стерильную 24-луночную культуральную пластину для удержания вставок и добавив субстрат ECM (например, коллаген) во внутреннюю часть лунки, как описано в разделе 1.2.3. Используйте одноканальную пипетку для осторожной загрузки субстрата ECM в каждую лунку.
  2. Подготовка эндотелиальных клеток мозга к посеву на мембранную вставку и начало эксперимента
    1. Соберите и подсчитайте эндотелиальные клетки головного мозга в соответствии с разделом 1.3, но приготовьте окончательное необходимое титрование клеток в центрифужной пробирке объемом 50 мл. Убедитесь, что собранные клетки находятся в теплой полноценной среде, включая все необходимые факторы роста и сыворотку.
    2. С помощью одноканальной пипетки осторожно засейте эндотелиальные клетки мозга (80 000 в этом протоколе) в апикальную камеру луночной вставки в 350 мкл готовой среды.
    3. Включите лунку без клеток, пипетируя всю среду только в одну из вставок.
    4. Извлеките клеточный модуль из инкубатора и поместите его в стерильный колпак. Переложите подготовленные вставки в нижние электродные горшки с помощью пинцета, чтобы обработать только верхние опоры вставки. Избегайте образования пузырьков под мембраной.
    5. Поместите клеточный модуль обратно в инкубатор поверх адаптера.
    6. В программном обеспечении на вкладке эксперимента в разделе Спектр выберите Начать на 1 Гц и Остановить на 100 кГц для сбора данных по всему частотному диапазону; Выберите тонкие шаги.
    7. В разделе Время ожидания выберите 15 минут , чтобы разрешить непрерывные измерения с максимальной скоростью, проводимые программным обеспечением.
    8. Нажмите кнопку «Старт », чтобы начать эксперимент и позволить эндотелиальным клеткам мозга разрастись и сформировать монослой с высоким сопротивлением. Этот шаг занимает примерно 48 часов.
  3. Лечение эндотелиальных клеток головного мозга раковыми клетками и цитокинами на мембранных вставках
    1. Через 48 ч готовят лечебные цитокины или клетки (например, клетки меланомы) в соответствии с разделом 1.5, включая проведение подсчета клеток, где это применимо, и собирают в полосковые пробирки объемом 1 мл или эквивалент.
    2. Приготовьте обработку в правильных концентрациях для добавления 70 мкл в каждую лунку (вкладыш). Поместите обработки в инкубатор, чтобы сохранить тепло.
    3. Поскольку прибор в данном описании выполняет измерения каждые 15 минут, выберите время обработки, которое начинается сразу после завершения измерения. В это время извлеките модуль Cell Module из инкубатора и аккуратно протрите его 70% этанолом с помощью безворсовых салфеток.
    4. В стерильном колпаке откройте клеточный модуль и осторожно нанесите пипетку объемом 70 мкл препарата в апикальную камеру соответствующего вкладыша. Делайте это с помощью одноканальной пипетки и добавляйте круговыми движениями, избегая образования пузырьков. Выполните этот шаг менее чем за 10 минут, чтобы вернуть модуль ячейки в адаптер до начала следующего измерения.
    5. Нажмите Стоп, чтобы завершить эксперимент. Экспортируйте данные непосредственно в файл xls. файл в папке Файл | Вкладка «Экспорт». Имя и сохраните этот файл соответствующим образом после его открытия.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Интерпретация данных импеданса ECIS

Понимание оптимальных условий эксперимента
В этом случае данные могут быть непосредственно просмотрены с помощью программного обеспечения (Рисунок 2A) или экспортированы для анализа и построения графиков (Рисунок 2B). На рисунке 2A показан пример данных, отображаемых в реальном интерфейсе программного обеспечения. На левом гра...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Терапевтические исследования заболеваний, влияющих на ГЭБ, должны учитывать важность целостности и регуляции эндотелиального барьера мозга. Например, нарушение эндотелиального барьера мозга критически исследуется при метастазировании рака в мозг из других анатомических участков. Это связано с тем, что эндотелий мозга образует первый барьер против циркулирующих опухолевых клеток. Как упоминалось ранее во введении, исследования in vitro по целостности эндотелиального барьера должны быть воспроизводимыми, неинвазив...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

У авторов нет конфликта интересов, о котором можно было бы заявить.

Благодарности

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Акшата Анчан была профинансирована Неврологическим фондом Новой Зеландии для получения стипендии Гиллеспи (ссылка на грант: 1628-GS) и первой стипендии (ссылка на грант: 2021 FFE). Стоимость исследования также была частично профинансирована Неврологическим фондом Fellowship-2021 FFE и Фондом развития исследований факультета Университета Окленда. Джеймс Хаклсби был профинансирован стипендией Оклендского фонда медицинских исследований. Спасибо команде Багули и Исследовательскому центру Оклендского онкологического общества за клеточные линии новозеландской меланомы NZM, полученные от пациентов.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
aMEMGibco12561072Меланома клеточная основа среда
cellZscope arraynanoAnalyticscellZscope2; программное обеспечение v4.3.1TER измерительная биосенсорная матрица
Collagen I— крысиный хвостGibcoA1048301ECM подложка для покрытия
дибутирил-цАМФSigma-AldrichD0627Эндотелиальная среда мозга
добавка ECIS array  Прикладная биофизикаECIS ZΘ; программное обеспечение v1.2.163.0Rb/Alpha измерительная биосенсорная матрица
ECIS plate  Прикладная биофизика96W20idf 96-луночная биосенсорная пластина
FBSSigma-Aldrich12203C-500ML
GlutaMAXGibco305050-061Добавка эндотелиальной среды мозга
hCMVECПрикладные биологические материалыT0259Линия эндотелиальных клеток мозга
hEGFPeproTechPTAF10015100Добавка эндотелиальной среды головного мозга
HeparinSigma-AldrichH-3393Brain эндотелиальная медиа-добавка
hFGFPeproTechPTAF10018B50Эндотелиальная медиа-добавка головного мозга
HydrocortisonSigma-AldrichH0888Эндотелиальная медиа-добавка головного мозга
IL-1βPeproTech200-01BЦитокин
Инсулин-Трансферрин-Селенит натрияСигма-Олдрич11074547001Клеточная медиадобавка Меланомы
M199Gibco11150-067Базовая среда эндотелиальных клеток головного мозга
Вода MilliQДеионизированная
PBS 1xGibco10010-023
TNF&альфа;PeproTech300-01AЦитокин
Трансвелл ВставкаCorningCLS3464Пористая мембранная вставка
TrypLE Express EnzymeGibco12604021Диссоциационный реагент
вода

Ссылки

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Fidler, I. J., Schackert, G., Zhang, R. D., Radinsky, R., Fujimaki, T. The biology of melanoma brain metastasis. Cancer Metastasis Reviews. 18 (3), 387-400 (1999).
  2. Tomlinson, E. Theory and practice of site-specific drug delivery. Advanced Drug Delivery Reviews. 1 (2), 87-198 (1987).
  3. Abbott, N. J., Patabendige, A. K., Dolman, D. E. M., Yusof, S. R., Begley, D. J. Structure and function of the blood-brain barrier. Neurobiology of Disease. 37 (1), 13-25 (2010).
  4. Neuwelt, E., et al. Strategies to advance translational research into brain barriers. The Lancet. Neurology. 7 (1), 84-96 (2008).
  5. Stolp, H. B., Dziegielewska, K. M. Review: Role of developmental inflammation and blood-brain barrier dysfunction in neurodevelopmental and neurodegenerative diseases. Neuropathology and Applied Neurobiology. 35 (2), 132-146 (2009).
  6. Gastfriend, B. D., Palecek, S. P., Shusta, E. V. Modeling the blood-brain barrier: Beyond the endothelial cells. Current Opinion in Biomedical Engineering. 5, 6-12 (2018).
  7. Kacem, K., Lacombe, P., Seylaz, J., Bonvento, G. Structural organization of the perivascular astrocyte endfeet and their relationship with the endothelial glucose transporter: A confocal microscopy study. Glia. 23 (1), 1-10 (1998).
  8. Abbott, N. J., Ronnback, L., Hansson, E. Astrocyte-endothelial interactions at the blood-brain barrier. Nature Reviews. Neuroscience. 7 (1), 41-53 (2006).
  9. Hickey, W. F., Kimura, H. Perivascular microglial cells of the cns are bone marrow-derived and present antigen in vivo. Science. 239 (4837), 290-292 (1988).
  10. Smith, J. A., Das, A., Ray, S. K., Banik, N. L. Role of pro-inflammatory cytokines released from microglia in neurodegenerative diseases. Brain Research Bulletin. 87 (1), 10-20 (2012).
  11. Denes, A., et al. Proliferating resident microglia after focal cerebral ischaemia in mice. Journal of Cerebral Blood Flow and Metabolism. 27 (12), 1941-1953 (2007).
  12. Nishioku, T., et al. Detachment of brain pericytes from the basal lamina is involved in disruption of the blood-brain barrier caused by lipopolysaccharide-induced sepsis in mice. Celular andl Molecular Neurobiology. 29 (3), 309-316 (2009).
  13. Felgenhauer, K. The blood-brain barrier redefined. Journal of Neurology. 233 (4), 193-194 (1986).
  14. Scheinberg, L. C., Edelman, F. L., Levy, W. A. Is the brain "an immunologically privileged site"?I. Studies based on intracerebral tumor homotransplantation and isotransplantation to sensitized hosts. Archives of Neurology. 11, 248-264 (1964).
  15. Carbonell, W. S., Ansorge, O., Sibson, N., Muschel, R. The vascular basement membrane as "soil" in brain metastasis. PLoS One. 4 (6), e5857(2009).
  16. Nag, S. Morphology and molecular properties of cellular components of normal cerebral vessels. Methods in Molecular Medicine. 89, 3-36 (2003).
  17. Wilhelm, I., Fazakas, C., Krizbai, I. A. In vitro models of the blood-brain barrier. Acta Neurobiologiae Experimentalis. 71 (1), 113-128 (2011).
  18. Bauer, H. C., et al. New aspects of the molecular constituents of tissue barriers. Journal of Neural Transmission (Vienna). 118 (1), 7-21 (2011).
  19. Balda, M. S., Matter, K. Tight junctions as regulators of tissue remodelling. Current Opinion in Cell Biology. 42, 94-101 (2016).
  20. Ballabh, P., Braun, A., Nedergaard, M. The blood-brain barrier: An overview: Structure, regulation, and clinical implications. Neurobiology of Disease. 16 (1), 1-13 (2004).
  21. Van Itallie, C. M., Tietgens, A. J., Anderson, J. M. Visualizing the dynamic coupling of claudin strands to the actin cytoskeleton through zo-1. Molecular Biology of the Cell. 28 (4), 524-534 (2017).
  22. Takeichi, M. Historical review of the discovery of cadherin, in memory of tokindo okada. Development, Growth & Differentiation. 60 (1), 3-13 (2018).
  23. Vincent, P. A., Xiao, K., Buckley, K. M., Kowalczyk, A. P. Ve-cadherin: Adhesion at arm's length. American Journal of Physiology. Cell Physiology. 286 (5), C987-C997 (2004).
  24. Brasch, J., et al. Structure and binding mechanism of vascular endothelial cadherin: A divergent classical cadherin. Journal of Molecular Biology. 408 (1), 57-73 (2011).
  25. Gavard, J., Patel, V., Gutkind, J. S. Angiopoietin-1 prevents vegf-induced endothelial permeability by sequestering src through mdia. Developmental Cell. 14 (1), 25-36 (2008).
  26. Romero, I. A., et al. Changes in cytoskeletal and tight junctional proteins correlate with decreased permeability induced by dexamethasone in cultured rat brain endothelial cells. Neuroscience Letters. 344 (2), 112-116 (2003).
  27. Aragon-Sanabria, V., et al. Ve-cadherin disassembly and cell contractility in the endothelium are necessary for barrier disruption induced by tumor cells. Scientific Reports. 7, 45835(2017).
  28. Angelini, D. J., et al. Tnf-alpha increases tyrosine phosphorylation of vascular endothelial cadherin and opens the paracellular pathway through fyn activation in human lung endothelia. American Journal of Physiology. Lung Cellular and Molecular Physiology. 291 (6), L1232-L1245 (2006).
  29. Nwariaku, F. E., et al. Tyrosine phosphorylation of vascular endothelial cadherin and the regulation of microvascular permeability. Surgery. 132 (2), 180-185 (2002).
  30. Orsenigo, F., et al. Phosphorylation of ve-cadherin is modulated by haemodynamic forces and contributes to the regulation of vascular permeability in vivo. Nature Communications. 3, 1208(2012).
  31. Weksler, B. B., et al. Blood-brain barrier-specific properties of a human adult brain endothelial cell line. FASEB Journal. 19 (13), 1872-1874 (2005).
  32. Chen, Z., Tzima, E. Pecam-1 is necessary for flow-induced vascular remodeling. Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 29 (7), 1067-1073 (2009).
  33. Privratsky, J. R., Newman, P. J. Pecam-1: Regulator of endothelial junctional integrity. Cell and Tissue Research. 355 (3), 607-619 (2014).
  34. Abdullahi, W., Tripathi, D., Ronaldson, P. T. Blood-brain barrier dysfunction in ischemic stroke: Targeting tight junctions and transporters for vascular protection. American Journal of Physiology. Cell Physiology. 315 (3), C343-C356 (2018).
  35. Bernardo-Castro, S., et al. Pathophysiology of blood-brain barrier permeability throughout the different stages of ischemic stroke and its implication on hemorrhagic transformation and recovery. Frontiers in Neurology. 11, 594672(2020).
  36. Wilhelm, I., Molnár, J., Fazakas, C., Haskó, J., Krizbai, I. A. Role of the blood-brain barrier in the formation of brain metastases. International Journal of Molecular Sciences. 14 (1), 1383-1411 (2013).
  37. Yuan, Y., Sun, J., Dong, Q., Cui, M. Blood-brain barrier endothelial cells in neurodegenerative diseases: Signals from the "barrier". Frontiers in Neuroscience. 17, 1047778(2023).
  38. Abate-Daga, D., Ramello, M. C., Smalley, I., Forsyth, P. A., Smalley, K. S. M. The biology and therapeutic management of melanoma brain metastases. Biochemistry & Pharmacology. 153, 35-45 (2018).
  39. Anchan, A., et al. Real-time measurement of melanoma cell-mediated human brain endothelial barrier disruption using electric cell-substrate impedance sensing technology. Biosensors (Basel). 9 (2), (2019).
  40. Anchan, A., et al. Analysis of melanoma secretome for factors that directly disrupt the barrier integrity of brain endothelial cells. International Journal of Molecular Sciences. 21 (21), 8193(2020).
  41. Hucklesby, J. J. W., et al. Comparison of leading biosensor technologies to detect changes in human endothelial barrier properties in response to pro-inflammatory tnfα and il1β in real-time. Biosensors (Basel). 11 (5), 159(2021).
  42. Giaever, I., Keese, C. R. Micromotion of mammalian cells measured electrically. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 88 (17), 7896(1991).
  43. Stolwijk, J. A., Matrougui, K., Renken, C. W., Trebak, M. Impedance analysis of gpcr-mediated changes in endothelial barrier function: Overview and fundamental considerations for stable and reproducible measurements. Pflugers Archive: European Journal of Physiology. 467 (10), 2193-2218 (2015).
  44. Benson, K., Cramer, S., Galla, H. -J. Impedance-based cell monitoring: Barrier properties and beyond. Fluids Barriers CNS. 10 (1), 5(2013).
  45. Anchan, A., Finlay, G., Angel, C. E., Hucklesby, J. J. W., Graham, S. E. Melanoma mediated disruption of brain endothelial barrier integrity is not prevented by the inhibition of matrix metalloproteinases and proteases. Biosensors (Basel). 12 (8), 660(2022).
  46. Robilliard, L. D., et al. The importance of multifrequency impedance sensing of endothelial barrier formation using ecis technology for the generation of a strong and durable paracellular barrier. Biosensors. 8 (3), 64(2018).
  47. Giavazzi, R., Foppolo, M., Dossi, R., Remuzzi, A. Rolling and adhesion of human tumor cells on vascular endothelium under physiological flow conditions. The Journal of Clinical Investigation. 92 (6), 3038-3044 (1993).
  48. Qi, J., Chen, N., Wang, J., Siu, C. H. Transendothelial migration of melanoma cells involves n-cadherin-mediated adhesion and activation of the beta-catenin signaling pathway. Molecular Biology of the Cell. 16 (9), 4386-4397 (2005).
  49. Brayton, J., Qing, Z., Hart, M. N., Vangilder, J. C., Fabry, Z. Influence of adhesion molecule expression by human brain microvessel endothelium on cancer cell adhesion. Journal of Neuroimmunology. 89 (1-2), 104-112 (1998).
  50. Soto, M. S., Serres, S., Anthony, D. C., Sibson, N. R. Functional role of endothelial adhesion molecules in the early stages of brain metastasis. Neuro-oncology. 16 (4), 540-551 (2014).
  51. García-Martín, A. B., et al. Vla-4 mediated adhesion of melanoma cells on the blood-brain barrier is the critical cue for melanoma cell intercalation and barrier disruption. Journal of Cerebral Blood Flow & Metabolism. 39 (10), 1995-2010 (2018).
  52. Worzfeld, T., Schwaninger, M. Apicobasal polarity of brain endothelial cells. Journal of Cerebral Blood Flow & Metabolism. 36 (2), 340-362 (2016).
  53. Stone, N. L., England, T. J., O'sulli, S. E. A novel transwell blood brain barrier model using primary human cells. Frontiers in Cellular Neuroscience. 13, 230(2019).
  54. Abstracts from the international symposium "signal transduction at the blood-brain barriers" 2022. Fluids and Barriers of the CNS. 20 (1), 26(2023).
  55. Srinivasan, B., et al. Teer measurement techniques for in vitro barrier model systems. SLAS Technology. 20 (2), 107-126 (2015).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на повторное использование текста или иллюстраций этой статьи JoVE

Запросить разрешение

Теги

Blood Brain BarrierBrain Endothelial CellsImpedance Based BiosensorsBarrier IntegrityCancer Cell InteractionCytokine TreatmentElectric Cell Substrate ImpedanceCellZscope InstrumentTransendothelial Electrical ResistanceEndothelial Monolayer

Похожие статьи