Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.

Методическая статья

Оптическая очистка и маркировка для световой флуоресцентной микроскопии при крупномасштабной визуализации головного мозга человека

3.2K просмотров

⸱

DOI:

10.3791/65960

⸱

26 января 2024 г.

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1European Laboratory for Non-linear Spectroscopy (LENS), University of Florence, 2Division of Physiology, Department of Experimental and Clinical Medicine, University of Florence, 3Department of Physics, University of Pisa, 4National Research Council - National Institute of Optics (CNR-INO), 5Department of Physics and Astronomy, University of Florence, 6Department of Biology, University of Florence

* These authors contributed equally

В этой статье

Краткое содержание

Настоящий протокол обеспечивает пошаговую процедуру быстрой и одновременной оптической очистки, многократного мечения и объемной 3D-реконструкции десятков посмертных срезов мозга человека путем комбинирования (SWITCH - H2O2 - Antigen Retrieval - 2,2'-тиодиэтанол [TDE]) короткого метода трансформации тканей с визуализацией флуоресцентной микроскопии со световым листом в стандартном протоколе с высокой пропускной способностью.

Аннотация

Несмотря на многочисленные методы очистки, появившиеся в последнее десятилетие, обработка посмертного человеческого мозга остается сложной задачей из-за его размеров и сложности, которые делают визуализацию с микрометровым разрешением особенно сложной. В данной работе представлен протокол реконструкции объемных участков головного мозга человека путем одновременной обработки десятков срезов протоколом тканевой трансформации SHORT (SWITCH - H2O2 - Antigen Retrieval - 2,2'-thiodiethanol [TDE]), который позволяет очищать, маркировать и последовательно визуализировать образцы с помощью световой флуоресцентной микроскопии (LSFM). SHORT обеспечивает быстрое очищение тканей и однородное множественное мечение толстых срезов несколькими нейрональными маркерами, что позволяет идентифицировать различные субпопуляции нейронов как в белом, так и в сером веществе. После очистки срезы визуализируются с помощью LSFM с микрометровым разрешением и по нескольким каналам одновременно для быстрой 3D-реконструкции. Комбинируя SHORT с LSFM-анализом в рамках протокола с высокой пропускной способностью, можно получить 3D-реконструкцию цитоархитектуры больших объемных областей с высоким разрешением за короткое время, что позволяет получить всестороннюю структурную характеристику мозга человека.

Введение

Анализ 3D-молекулярной организации и цитоархитектоники больших объемов человеческого мозга требует оптической прозрачности образцов, достигаемой с помощью протоколов с длительным временем обработки. Методы оптической очистки были разработаны для минимизации гетерогенности показателя преломления (RI) в тканях, тем самым уменьшая рассеяние света и увеличивая глубину проникновения света для визуализации с высоким разрешением 1,2,3,4,5. Современные достижения в области методов очистки и мечения глубоких тканей позволяют проводить объемную визуализацию неповрежденных органов и эмбрионов грызунов с использованием передовых методов микроскопии 6,7,8,9,10,11,12.

Тем не менее, объемная 3D-реконструкция больших участков посмертного человеческого мозга по-прежнему представляет собой сложную задачу по сравнению с модельными организмами. Сложный биологический состав и различные условия посмертной фиксации и хранения могут поставить под угрозу эффективность очистки тканей, глубину проникновения антител и распознавание эпитопов 13,14,15,16,17,18,19. Кроме того, механическое сечение тканей и последующая очистка и маркировка каждого среза по-прежнему требуется для достижения эффективной очистки и равномерного мечения больших областей человеческого мозга, что приводит к длительному времени обработки и необходимости сложного специального оборудования по сравнению с модельными организмами 15,20,21,22.

Методика тканевой трансформации SWITCH - H2O2 - антигена Retrieval -TDE (SHORT) была разработана специально для анализа больших объемов головного мозга человека18,23. Этот метод использует сохранение структуры тканей по протоколу SWITCH11 и высокие концентрации перекиси водорода для уменьшения автофлуоресценции тканей в сочетании с восстановлением эпитопов. SHORT позволяет равномерно окрашивать срезы головного мозга человека маркерами для различных подтипов нейронов, глиальных клеток, сосудов и миелинизированных волокон18,24. Его результаты совместимы с анализом белков как низкой, так и высокой плотности. Полученные высокие уровни прозрачности и равномерная маркировка позволяют проводить объемную реконструкцию толстых срезов с помощью флуоресцентной микроскопии, в частности, для быстрого получения светового листа могут быть использованы приборы 18,24,25,26,27.

В данной работе мы описываем, как техника тканевой трансформации SHORT может быть использована для одновременной очистки и многораундового мечения десятков фиксированных формалином участков человеческого мозга. Четыре различных флуоресцентных маркера могут использоваться вместе, что приводит к идентификации различных клеточных субпопуляций. После очистки можно выполнить объемную визуализацию высокого разрешения с помощью флуоресцентной микроскопии. Здесь мы использовали изготовленную на заказ инвертированную LSFM 18,24,25,26,27, которая обеспечивает быстрое оптическое секционирование образца и быстрый параллельный захват нескольких каналов. С помощью этого протокола с высокой пропускной способностью можно получить всестороннюю клеточную и структурную характеристику с субклеточным разрешением больших областей человеческого мозга, как это уже было продемонстрировано при картировании всей области Брока23.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

Образцы тканей человека, зафиксированные формалином, были предоставлены отделением невропатологии Службы аутопсии Массачусетской больницы общего профиля (MGH) (Бостон, США). Письменное согласие было получено от здоровых участников перед смертью в соответствии с одобренными IRB протоколами сбора тканей от Комитета по биобезопасности Партнеров (PIBC, протокол 2003P001937). Разрешительные документы хранятся в Службе аутопсии MGH в Бостоне, штат Массачусетс, США, и предоставляются по запросу.

1. Заделка агарозы и резка образца

  1. Приготовьте 4%-ный раствор агарозы в 1x фосфатно-солевом буфере (PBS, pH 7,4) в стакане и заложите внутрь тканевый блок. Подождите, пока он не нагреется до комнатной температуры (RT), а затем храните при температуре 4 °C в течение 24 часов.
  2. Для получения высокоточных срезов приклейте образец к диску образца вибратома и заполните лоток холодным 1x PBS (pH 7,4). Отрегулируйте параметры вибратомы, такие как частота, амплитуда и скорость, в соответствии с типом ткани, которую нужно разрезать (используемые значения: частота = 5 (50 Гц); амплитуда = 0,4; скорость = 3 (0,15 мм/с).
    ПРИМЕЧАНИЕ: В зависимости от объема образца следует использовать разные вибратомы. Для образцов с максимальным объемом 70 x 40 x 15 мм можно использовать вибратом (например, Leica VT1000 S); для больших образцов можно использовать компрессионный аппарат (например, VF-900-0Z Microtome18) или изготовленный по индивидуальному заказу аппарат21. Здесь мы представляем ломтики, нарезанные толщиной 400 мкм или 500 мкм.
  3. После нарезки поместите все ломтики в консервирующий раствор, состоящий из 1x PBS (pH 7,4) с 0,01% w/v азида натрия (NaN3), и храните при температуре 4 °C.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Перед заделкой подождите, пока раствор агарозы не нагреется до 37 °C. Более высокая температура может повредить образец. Рекомендуется не оставлять образцы в PFA более чем на 48 ч, так как длительная фиксация может помешать процедуре мечения, повреждая антигены и увеличивая аутофлуоресценцию тканей. Для длительного хранения тканей человека используется ПБС с NaN3 для предотвращения микробного загрязнения. Из-за токсичности NaN3 приготовьте консервирующий раствор под химическим колпаком.

2. Фиксация тканей

ПРИМЕЧАНИЕ: Все растворы, используемые в следующем протоколе, готовятся в больших объемах, достаточных для обработки всех срезов одного и того же тканевого блока и минимизации технической вариативности и сокращения времени на отдельные этапы.

  1. Приготовьте раствор для отключения с 50% v/v 1x PBS pH 3, 25% v/v 0,1 M соляной кислоты (HCl), 25% v/v 0,1 M гидрофталата калия (KHP) и свежего 4% v/v глутарового альдегида. Поместите все образцы в чашки с завинчивающимися крышками (70 x 23 мм) и инкубируйте их в растворе Switch-off при легком встряхивании при 4 °C в течение 1 суток, защищая их от света алюминиевой фольгой.
  2. Приготовьте раствор для включения с 1x PBS (pH 7,4) и свежим 1% v/v глутаровым альдегидом. Поместите все образцы в новую посуду и инкубируйте их с раствором Switch-on при легком встряхивании при 4 °C в течение 1 суток, защищая их от света алюминиевой фольгой.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Из-за высокой токсичности и светочувствительности глутарового альдегида растворы для выключения и включения всегда должны быть приготовлены свежими и храниться под химическим колпаком на льду. Всегда наполняйте посуду 20 мл каждого раствора и закрывайте ее парапленкой.

3. Деактивация и очистка

ПРИМЕЧАНИЕ: Реакционноспособный глутаровый альдегид в образцах должен быть инактивирован инкубацией с инактивационным раствором, состоящим из 1x PBS pH 7,4, 4% w/v ацетамида, 4% w/v глицина, pH 9,0. Раствор можно хранить при температуре 4 °C до 3 месяцев. Для удаления липидов и придания ткани прозрачности используем очищающий раствор, состоящий из 200 мМ додецилсульфата натрия (SDS), 20 мМ сульфита натрия (Na2SO3) и 20 мМ борной кислоты (H3BO3), рН 9,0. Раствор должен храниться в RT, так как SDS выпадает в осадок при 4 °C. Все последующие действия будут выполняться в пробирках, наполненных раствором.

  1. Переместите образцы из посуды в пробирки и промойте в течение 3 x 2 ч с 1x PBS pH 7,4 при RT при легком встряхивании.
    ПРИМЕЧАНИЕ: На этапе 3.1 необходимо работать под химическим колпаком из-за токсичности глутарового альдегида. Ацетамид, SDS и борная кислота также являются токсичными реагентами, и с ними необходимо обращаться под химическим колпаком. Всегда наполняйте пробирку 50 мл каждого раствора.
  2. Инкубируют образцы в инактивационном растворе при 37 °C на водяной бане в течение ночи (но/к).
  3. Стирайте в течение 3 x 2 ч в 1x PBS pH 7,4 при RT при легком встряхивании.
  4. Образцы выдерживают в очищающем растворе при температуре 55 °С на водяной бане в течение 3-7 дней. Меняйте раствор каждые 2 дня (табл. 1).

4. Иммуномаркировка

ПРИМЕЧАНИЕ: Перед этапом маркировки необходимо удалить остаточный SDS, уменьшить автофлуоресценцию и демаскировать эпитопы с помощью раствора для извлечения антигена, состоящего из 10 мМ основания Tris, 1 мМ ЭДТА и 0,05% v/v Tween 20, pH 9. рН раствора 9 оптимизирован для эффективного процесса извлечения; Трис-основание действует как буферный агент для поддержания стабильной рН-среды; ЭДТА, которая является хелатирующим агентом, повышает доступность антигена. Неионогенный моющий крем Tween 20 способствует улучшению проницаемости тканей. Этот раствор можно хранить при температуре 4 °C. Важно отметить, что перекись водорода в сочетании со стадией извлечения антигена оказывает синергетический эффект в снижении аутофлюоресцентного сигнала, разрушая и/или модифицируя эндогенные флуорофоры, ответственные за неспецифический фоновый сигнал (например, липофусцин).

  1. Приготовьте 1x PBS с 0,1% v/v Triton X-100 (PBST), предварительно прогрейте его до 37 °C и промойте образцы 3 x 3 ч в течение дня при легком встряхивании при 37 °C в инкубаторе. Оставьте последнюю стирку о/н.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Храните исходный раствор PBST при температуре 4 °C. Очень важно удалить SDS из ткани, так как при низких температурах он может образовывать нерастворимые осадки, которые могут помешать последующим процессам поглощения.
  2. На следующий день добавьте 10 мл 30% v/v перекиси водорода (H2O2) к каждому образцу и оставьте его при легком встряхивании при RT на 45 мин.
  3. Стирайте 3 x 10 мин с 1x PBS (pH 7,4) с легким встряхиванием при RT.
  4. Раствор для извлечения антигена разогреть до 95 °C на водяной бане; Переложите образцы в нагретый раствор и оставьте их при температуре 95 °C на 10 мин.
  5. Дайте образцам остыть до температуры RT в течение 40 минут при легком встряхивании.
  6. Промывайте 3 x 5 минут деионизированной водой при легком встряхивании.
  7. Уравновешивают образцы в ПБС при 4 °C в течение 15 мин.
  8. Приготовьте свежий раствор антител на основе PBST с 0,01% массы NaN3 (см. ПРИМЕЧАНИЕ для шага 1.3) и добавьте первичные антитела. Инкубируют образцы с раствором в чашках с завинчивающимися крышками при 37 °С в течение n суток (1-7) в инкубаторе при осторожном встряхивании и защите от света (табл. 2).
    ПРИМЕЧАНИЕ: Время инкубации зависит от размера и толщины (Таблица 1 и Таблица 2).
  9. Через n дней образцы перемещают в пробирки и промывают 3 х 2 ч предварительно подогретым ПБСТ при 37 °С с легким встряхиванием в инкубаторе.
  10. Добавляют вторичные антитела в ПБСТ с 0,01% мас./оNaN3 и инкубируют образцы в новых чашках с завинчивающимися крышками при 37 °С в течение n дней (1-6) в инкубаторе с легким встряхиванием и в защищенном от света месте (табл. 1 и табл. 2).
  11. Через n дней переложить образцы в пробирки и промыть 3 х 3 ч в течение суток предварительно подогретым ПБСТ при 37 °С в инкубаторе с щадящим встряхиванием. Оставьте последнюю стирку о/н.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Поскольку Triton X-100 и Tween 20 вязкие, медленно пипетку, чтобы наконечник заполнился. Всегда наполняйте пробирку 50 мл каждого раствора. Используйте 10 мл растворов антител для каждого образца и закройте чашку парапленкой, чтобы предотвратить испарение раствора. Поскольку растворы антител содержат NaN3, их можно хранить при температуре 4 °C и повторно использовать для маркировки новых образцов в течение 2 недель.

5. Согласование показателя преломления

ПРИМЕЧАНИЕ: Для достижения высокого уровня прозрачности необходимо гомогенизировать показатель преломления тканей. Здесь мы используем 2,2'-тиодиэтанол (TDE), разбавленный в 1x PBS. Решения TDE должны храниться в RT.

  1. Переложите образцы в новую посуду, добавьте 30% v/v TDE и оставьте на 4 ч при легком встряхивании при RT.
  2. Удалите 30%-ный раствор v/v TDE, добавьте 68% v/v TDE к образцам и оставьте их при легком встряхивании при RT.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Поскольку TDE вязкий, медленно продавайте пипетку, чтобы наконечник заполнился. Вдыхание паров или тумана TDE может вызвать раздражение дыхательной системы. Поэтому желательно работать в хорошо проветриваемом помещении или использовать вытяжные шкафы, чтобы свести к минимуму воздействие. Растворы TDE должны храниться в RT. Используйте 10 мл растворов TDE для каждого образца.

6. Монтаж образца

ПРИМЕЧАНИЕ: Для облегчения монтажа образца и получения изображений LSFM мы используем изготовленный по индивидуальному заказу герметичный держатель образца (называемый «сэндвич»), который состоит из трех частей: предметного стекла микроскопа, спейсера и покровного стекла.

  1. Наденьте стальную прокладку (56 x 56 x 0,5мм3) на предметное стекло микроскопа (60 x 60 x 1мм3) и положите образец на предметное стекло для микроскопии.
  2. Аккуратно положите кварцевый покровный листок (60 х 60 х 0,5мм3), скрепите все вместе и приготовьте двухкомпонентный силиконовый клей в пропорции 1:1. Используйте кварцевое покрывало, чтобы соответствовать показателю преломления и уменьшить оптическую аберрацию в процессе съемки.
  3. С помощью шприца объемом 1 мл заполните пространство между прокладкой и покровным стеклом двухкомпонентным силиконовым клеем и дайте высохнуть в течение 10 минут.
  4. Снимите зажимы и с помощью маленькой иглы медленно заполните весь сэндвич 68% v/v TDE.
  5. Сделайте свежий клей и запечатайте бутерброд.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Если TDE случайно достигнет прокладки на шаге 6.1, клей не затвердеет. Убедитесь, что на шаге 6.2 не образуются пузырьки воздуха.

7. Зачистка

ПРИМЕЧАНИЕ: Структурная сохранность и улучшенная доступность эпитопов SHORT позволяют многократно маркировать срезы путем удаления антител и повторного окрашивания образцов другими маркерами.

  1. Откройте бутерброд лезвием, положите образцы в новую посуду с завинчивающимися крышками, наполненную 30% v/v TDE, и оставьте их на 3 часа.
  2. Переложите образцы в пробирки, промойте в течение 3 x 2 ч в 1x PBS (pH 7,4) при RT с легким встряхиванием и оставьте последнюю промывку o/n.
  3. Поместите образцы в очищающий раствор на водяную баню при температуре 80 °C на 4 ч.
  4. Стирать в течение 3 x 2 ч в 1x PBST (pH 7,4) при 37 °C при легком встряхивании и оставить последнюю стирку o/n. Теперь образец готов к повторной маркировке, начиная с шага 4.8.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Всегда наполняйте пробирку 50 мл каждого раствора. Используйте 10 мл раствора TDE для каждого образца.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

Протокол, описанный здесь, позволяет одновременно обрабатывать несколько срезов толщиной от 100 мкм до 500 мкм с помощью метода SHORT. Такой подход значительно сокращает общее время обработки всей процедуры. В данной работе мы даем исчерпывающее описание всего конвейера (рис. 1) для одновременной обработки нескольких посмертных толстых срезов человеческого мозга и демонстрируем протокол сразу на 24 срезах (рис. 2А). Продолжительность очистки и совместного мечени...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

Визуализация с высоким разрешением и 3D-реконструкция больших областей человеческого мозга требуют механического среза тканей с последующим оптическим очищением и иммунометированием отдельных срезов. Протокол, представленный здесь, описывает, как метод трансформации тканей SHORT может быть использован для быстрой и одновременной обработки нескольких толстых срезов человеческого мозга для 3D-реконструкции мозга с субклеточным разрешением с помощью LSFM.

В отличие от других подходов, при использ...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

Авторы заявляют, что исследование проводилось в отсутствие каких-либо коммерческих или финансовых отношений, которые могли бы быть истолкованы как потенциальный конфликт интересов.

Благодарности

Мы благодарим Брюса Фишля (Bruce Fischl), Массачусетская больница общего профиля, Центр биомедицинской визуализации им. А.А. Мартиноса, отделение радиологии, за предоставление образцов человеческого мозга, проанализированных в этом исследовании. Этот проект получил финансирование от Рамочной программы исследований и инноваций Европейского Союза «Горизонт 2020» в рамках грантового соглашения No 654148 (Laserlab-Europe), от Рамочной программы Европейского Союза по исследованиям и инновациям «Горизонт 2020» в рамках Специального грантового соглашения No 785907 (Проект «Мозг человека» SGA2) и No 945539 (Проект «Мозг человека» SGA3), от Центра корпорации больниц общего профиля Национальных институтов здравоохранения под номером U01 MH117023, и от Министерства образования Италии в рамках Итальянского узла Euro-Bioimaging (исследовательская инфраструктура ESFRI). Наконец, это исследование было проведено при участии «Fondazione CR Firenze». Содержание этой работы является исключительной ответственностью авторов и не обязательно отражает официальную точку зрения Национальных институтов здравоохранения. Рисунок 1 был создан с помощью BioRender.com.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
2,2'-тиодиетанолMerck Life Science S.R.L.
Ацетамид >= 99,0% (GC)Merck Life Science S.R.L.160
Агароза с высоким ЭЭОМерк Лайф Сайенс С.Р.Л.A9793
Борная кислотаMerck Life Science S.R.L.B7901
Compressome VF-900-0Z Микротомпрецизионный/
покровные стеклаLaserOptex/индивидуальный
этилендиаминтетрауксусная кислота дигидрат солинатрия Merck Life Science S.R.L.E5134
ГлутаральдегидMerck Life Science S.R.L.G7651
ГлицинSanta Cruz БиотехнологияSC_29096
перекисью водорода 30%Merck Life Science S.R.L.
Инкубатор ISS-4075Лабораторный компаньон /
Флуоресцентная микроскопия на световом листе (LSFM)//изготовленный на заказ
Loctite AttakHenkel Italia srl/
Микроскопические слайдыLaborchimica/специализированная
фоспатная буферная солевая таблеткаMerck Life Science S.R.L.P4417
Пикодент ТвинсилПикодент13005002снято с производства
Флорат калия и водородаMerck Life Science S.R.L.P1088
Азид натрияMerck Life Science S.R.L.S2002
Додецилсульфат натрияMerck Life Science S.R.L.L3771
Сульфит натрияMerck Life Science S.R.L.S0505
SpacersMicrolaser srlиндивидуальные
контейнеры для мокроты (посуды с завинчивающимися крышками)Paul Boettger GmbH & Co. KG07.061.2000
Tris BasePanReac AppliChem (реагенты ITW)A4577,0500
Triton X-100Merck Life Science S.r.L.T8787
ТрубкиSarstedt62 547254
Tween 20Merck Life Science S.R.L.P9416
Вибратомная VT1000SLeica Biosystem/
Водяная баня MemmertWNB 7-45
Антитела и красители
Alexa Fluor 488 AffiniPure Alpaca Anti-Rabbit IgG (H+L)Jackson Immuno Reasearch611-545-215Используемое разведение, 1:200
Alexa Fluor 488 AffiniPure Bovine Anti-Goat IgG (H+L)Jackson Immuno Reasearch805-545-180Используемое разведение, 1:200
Alexa Fluor 647 AffiniPure Alpaca Anti-Rabbit IgG (H+L)Jackson Immuno Reasearch611-605-215Используемое разведение, 1:200
Anti-NeuN антителоMerck Life Science S.R.L.ABN91Используемое разведение, 1:100
Антитело против парвальбумина (PV)Abcamab32895Используемое разведение, 1:200
Антитело против виментина [V9] - Маркер цитоскелета (VIM)Abcamab8069Используемое разведение, 1:200
Калретинин Поликлональное антителоProteinTech12278_1_APИспользуемое разведение, 1:200
DAPIThermoFisherD3571Разведение б/у, 1:100
Donkey Anti-Mouse IgG H& L (Alexa Fluor 568)Abcamab175700Разбавление б/у, 1:200
Donkey Anti-Mouse IgG H& L (Alexa Fluor 647)Abcamab150107Разбавление б/у, 1:200
Donkey Anti-Rabbit IgG H& L (Alexa Fluor 568)Abcamab175470Разбавление использованное, 1:200
Donkey Anti-Rat IgG H& L (Alexa Fluor 568) предадсорбированныйAbcamab175475Используемое разведение, 1:200
Goat Anti-Chicken IgY H& L (Alexa Fluor 488)Abcamab150169Используемое разбавление, 1:500
Goat Anti-Chicken IgY H& L (Alexa Fluor 568)Abcamab175711Разбавление использованное, 1:500
Goat Anti-Chicken IgY H& L (Alexa Fluor 647)Abcamab150171Разведение использовано, 1:500
Goat Anti-Rabbit IgG H& L (Alexa Fluor 488)Abcamab150077Используемое разведение, 1:200
Рекомбинантное Alexa Fluor 488 Антитело против GFAPAbcamab194324Используемое разведение, 1:200
Антитело к соматостатину YC7Santa Cruz Biotechnologysc-47706Используемое разведение, 1:200
Вазоактивный кишечный пептид (VIP)ProteinTech16233-1-APИспользуемое разведение, 1:200
166782

Ссылки

  1. Costantini, I., Cicchi, R., Silvestri, L., Vanzi, F., Pavone, F. S. In-vivo and ex-vivo optical clearing methods for biological tissues: review. Biomedical Optics Express. 10 (10), 5251(2019).
  2. Richardson, D. S., et al. Tissue clearing. Nature Reviews Methods Primers. 1 (1), 84(2021).
  3. Ueda, H. R., et al. Tissue clearing and its applications in neuroscience. Nature Reviews Neuroscience. 21 (2), 61-79 (2020).
  4. Weiss, K. R., Voigt, F. F., Shepherd, D. P., Huisken, J. Tutorial: practical considerations for tissue clearing and imaging. Nature Protocols. 16 (6), 2732-2748 (2021).
  5. Tainaka, K., Kuno, A., Kubota, S. I., Murakami, T., Ueda, H. R. Chemical principles in tissue clearing and staining protocols for whole-body cell profiling. Annual Review of Cell and Developmental Biology. 32 (1), 713-741 (2016).
  6. Renier, N., et al. iDISCO: A simple, rapid method to immunolabel large tissue samples for volume imaging. Cell. 159 (4), 896-910 (2014).
  7. Pan, C., et al. Shrinkage-mediated imaging of entire organs and organisms using uDISCO. Nature Methods. 13 (10), 859-867 (2016).
  8. Lee, E., et al. ACT-PRESTO: Rapid and consistent tissue clearing and labeling method for 3-dimensional (3D) imaging. Scientific Reports. 6 (1), 18631(2016).
  9. Susaki, E. A., Ueda, H. R. Whole-body and whole-organ clearing and imaging techniques with single-cell resolution: toward organism-level systems biology in mammals. Cell Chemical Biology. 23 (1), 137-157 (2016).
  10. Lee, H., Park, J. -H., Seo, I., Park, S. -H., Kim, S. Improved application of the electrophoretic tissue clearing technology, CLARITY, to intact solid organs including brain, pancreas, liver, kidney, lung, and intestine. BMC Developmental Biology. 14 (1), 48(2014).
  11. Murray, E., et al. Simple, Scalable proteomic imaging for high-dimensional profiling of intact systems. Cell. 163 (6), 1500-1514 (2015).
  12. Cai, R., et al. Panoptic imaging of transparent mice reveals whole-body neuronal projections and skull-meninges connections. Nature Neuroscience. 22 (2), 317-327 (2019).
  13. Ueda, H. R., et al. Whole-brain profiling of cells and circuits in mammals by tissue clearing and light-sheet microscopy. Neuron. 106 (3), 369-387 (2020).
  14. Costantini, I., et al. Large-scale, cell-resolution volumetric mapping allows layer-specific investigation of human brain cytoarchitecture. Biomedical Optics Express. 12 (6), 3684(2021).
  15. Lai, H. M., et al. Next generation histology methods for three-dimensional imaging of fresh and archival human brain tissues. Nature Communications. 9 (1), 1066(2018).
  16. Zhao, S., et al. Cellular and molecular probing of intact human organs. Cell. 180 (4), 796-812.e19 (2020).
  17. Costantini, I., et al. Autofluorescence enhancement for label-free imaging of myelinated fibers in mammalian brains. Scientific Reports. 11 (1), 8038(2021).
  18. Pesce, L., et al. 3D molecular phenotyping of cleared human brain tissues with light-sheet fluorescence microscopy. Communications Biology. 5 (1), 447(2022).
  19. Schueth, A., et al. Efficient 3D light-sheet imaging of very large-scale optically cleared human brain and prostate tissue samples. Communications Biology. 6 (1), 170(2023).
  20. Morawski, M., et al. Developing 3D microscopy with CLARITY on human brain tissue: Towards a tool for informing and validating MRI-based histology. NeuroImage. 182, 417-428 (2018).
  21. Park, J., et al. Integrated platform for multi-scale molecular imaging and phenotyping of the human brain. bioRxiv. , (2022).
  22. Chung, K., et al. Structural and molecular interrogation of intact biological systems. Nature. 497 (7449), 332-337 (2013).
  23. Costantini, I., et al. A cellular resolution atlas of Broca's area. Science Advances. (9), eadg3844(2023).
  24. Scardigli, M., et al. Comparison of different tissue clearing methods for three-dimensional reconstruction of human brain cellular anatomy using advanced imaging techniques. Frontiers in Neuroanatomy. 15, 752234(2021).
  25. Pesce, L., et al. Exploring the human cerebral cortex using confocal microscopy. Progress in Biophysics and Molecular Biology. 168, 3-9 (2022).
  26. Keller, P. J., Dodt, H. -U. Light sheet microscopy of living or cleared specimens. Current Opinion in Neurobiology. 22 (1), 138-143 (2012).
  27. Power, R. M., Huisken, J. A guide to light-sheet fluorescence microscopy for multiscale imaging. Nature Methods. 14 (4), 360-373 (2017).
  28. Belle, M., et al. Tridimensional visualization and analysis of early human development. Cell. 169 (1), 161-173.e12 (2017).
  29. Sorelli, M., et al. Fiber enhancement and 3D orientation analysis in label-free two-photon fluorescence microscopy. Scientific Reports. 13 (1), 4160(2023).
  30. Helmchen, F., Denk, W. Deep tissue two-photon microscopy. Nature Methods. 2 (12), 932-940 (2005).
  31. Vieites-Prado, A., Renier, N. Tissue clearing and 3D imaging in developmental biology. Development. 148 (18), dev199369(2021).
  32. Costantini, I., et al. Editorial: The human brain multiscale imaging challenge. Frontiers in Neuroanatomy. (16), 1060405(2022).
  33. Costantini, I., et al. A versatile clearing agent for multi-modal brain imaging. Scientific Reports. 5 (1), 9808(2015).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Больше статей

Лист-сканирующая микроскопияпросветление тканейобъемная реконструкциядемаскировка антигеновнейрональные маркерыиммуноокрашиваниесогласование показателей преломлениясекционирование на вибратоме
Оптическая очистка и маркировка для световой флуоресцентной микроскопии при крупномасштабной визуализации головного мозга человека
Связаться с нами
Порекомендовать библиотеке

Конфиденциальность

Условия использования

Политики

© 2026 MyJoVE Corporation. Все права защищены.