Регистрация ажиотажа ядра ооцита мыши на основе цитоскелета в пространственных масштабах

Краткое содержание

Этот протокол обеспечивает экспериментальную основу для документирования физического воздействия цитоскелета на ядерную форму и внутренние безмембранные органеллы в системе ооцитов мыши. Фреймворк может быть адаптирован для использования в других типах ячеек и контекстах.

Аннотация

Основной проблемой в понимании причин женского бесплодия является выяснение механизмов, регулирующих развитие женских половых клеток, называемых ооцитами. Их развитие отмечено ростом клеток и последующим делением, двумя критическими фазами, которые подготавливают ооцит к слиянию со сперматозоидом для инициирования эмбриогенеза. Во время роста ооциты реорганизуют свою цитоплазму, чтобы расположить ядро в клеточном центре, что предсказывает успешное развитие ооцитов у мышей и людей и, таким образом, их эмбриогенный потенциал. Показано, что в мышиных ооцитах эта цитоплазматическая перестройка управляется цитоскелетом, деятельность которого порождает механические силы, возбуждающие, перемещающие и проникающие в ядро. Следовательно, эта передача цитоплазматической силы в нуклеоплазматическую настраивает динамику органелл, процессирующих ядерную РНК, известных как биомолекулярные конденсаты. Этот протокол обеспечивает экспериментальную основу для документирования с высоким временным разрешением влияния цитоскелета на ядро в пространственных масштабах в ооцитах мышей. В ней подробно описаны этапы и инструменты визуализации и анализа изображений, необходимые для оценки i) активности цитоскелета в цитоплазме ооцита, ii) возбуждения ядра ооцита на основе цитоскелета и iii) его влияния на динамику биомолекулярного конденсата в нуклеоплазме ооцита. Помимо биологии ооцитов, методы, разработанные здесь, могут быть адаптированы для использования в соматических клетках для аналогичной настройки ядерной динамики на основе цитоскелета в разных масштабах.

Введение

Ядерное позиционирование имеет важное значение для многих клеточных функций и функций развития 1,2,3,4,5. Женские половые клетки млекопитающих, называемые ооцитами, ремоделируют свою цитоплазму, чтобы расположить ядро в клеточном центре, несмотря на асимметричное деление по размеру, которое зависит от последующего смещения хромосомы⁶ (рис. 1). Такое центрирование ядра предсказывает успешное развитие ооцитов у мышей и человека ^7,8 и, следовательно, их эмбриогенный потенциал (рис. 1).

Цитоплазматическое ремоделирование в ооцитах мышей обусловлено, прежде всего, цитоскелетом актомиозина⁹ (рис. 2). Его активность порождает механические силы, которые возбуждают, перемещают и проникают в ядро¹⁰ (рис. 2). Следовательно, эта передача цитоплазматической силы в нуклеоплазматическую настраивает динамику органелл, обрабатывающих ядерную матричную РНК, называемых ядерными спеклами¹¹, одной из нескольких безмембранных органелл в ядре, известных как биомолекулярные конденсаты^{12, 13, 14, 15, 16} (рис. 2).

Визуализация в реальном времени сыграла решающую роль в расшифровке функциональных последствий ядерного возбуждения. Фильмы о миграции ядер в течение нескольких часов, а также фильмы с высоким временным разрешением актиновой сетки и объемной цитоплазмы в значительной степени способствовали разработке теоретической модели ядерного позиционирования, связывающей различные^{временные} масштабы9. Кроме того, видеозаписи цитоплазмы, контура ядра и ядерных компонентов с высоким временным разрешением, таких как хроматин и ядерные конденсаты, подчеркнули роль возбуждения ядра на основе цитоскелета на процессинг РНК и экспрессию генов в ооцитах мышей, соединяя различные пространственно-временные масштабы внутри клетки^10,11. В целом, такой подход, основанный на визуализации в реальном времени, обеспечил первое обоснование, связывающее цитоскелетное возбуждение ядра с успехом развития ооцитов.

Протокол обеспечивает конвейер визуализации и анализа изображений, используемый для изучения передачи цитоплазматических сил (генерируемых в основном F-актином и частично микротрубочками) ядру и его внутренним компонентам в ооцитах мышей. Результатом этих экспериментов является захват континуума сил в пространственных масштабах, от цитоскелета в цитоплазме до ядерных недр, с помощью фильмов с высоким временным разрешением, как показано в двух недавних исследованиях^10,11, которые установили связь между активными движениями цитоплазмы, флуктуациями контура ядра, а также движением и поверхностными флуктуациями одного типа ядерных биомолекулярных конденсатов: ядерные пятнышки. Тот же подход может быть применен и к другим модельным системам, в которых ожидается изменение цитоплазматических сил, например, в контексте злокачественных^{раковых клеток.}

Протокол

Все эксперименты на животных проводились в соответствии с руководящими принципами Европейского сообщества и были одобрены Министерством сельского хозяйства Франции (разрешение No 75-1170) и Генеральным управлением исследований и инноваций (DGRI; Номер соглашения о ГМО DUO-5291). Мыши содержались в помещении для животных по 12-часовому циклу свет/темнота при температуре окружающей среды 22-24 °C и влажности 40%-50%. Здесь используются мыши женского пола OF1 (Oncins France 1, возраст от 8 до 12 недель) и самки C57BL/6 (возраст от 10 до 14 недель).

1. Сбор и подготовка ооцитов

1. Соберите ооциты у мышей в возрасте от 8 до 14 недель, как описано в^{пунктах 18} и¹⁹.
   1. Вкратце, сначала извлекают яичники у мышей, как в¹⁸ , в предварительно подогретую (37 °C) среду M2+бычий сывороточный альбумин (BSA) с добавлением 1 мкМ милринона¹⁹, который предотвращает возобновление мейоза в ооцитах.
   2. Пункция фолликулов яичников хирургическими иглами для высвобождения растущих ооцитов из антральных фолликулов (окончание роста ооцитов²⁰).
   3. Соберите ооциты необходимого для экспериментов размера (растущие и/или полностью выращенные ооциты) с помощью микропипетки, специализированной для сбора ооцитов, перед промыванием и перемещением в посуду со свежей средой под минеральным маслом.
2. Механически диссоциируют ооциты от антральных фолликулярных клеток путем пипетирования вверх-вниз и оставляют стабилизироваться в течение 1 ч в инкубаторе при 37 °C, прежде чем приступить к последующим экспериментальным этапам.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Ооциты хранятся при температуре 37 °C на всех этапах эксперимента. Для этого протокола были собраны самые крупные ооциты, которые являются полностью взрослыми.

2. Микроинъекция ооцитов

ПРИМЕЧАНИЕ: Для регистрации активности цитоскелета в цитоплазме используется визуализация в светлом поле в реальном времени. Таким образом, микроинъекция флуоресцентных маркеров не требуется, и протокол может быть возобновлен на шаге 3. Для получения изображения контура ядерного реактора был использован зонд Rango, отображающий метку YFP на N-конце и метку CFP на C-конце^21,22. При визуализации в ооцитах с длиной волны 488 нм он мечет все ядро, за исключением ядрышка²³, и демонстрирует очень четкие ядерные очертания. Для визуализации ядерных спеклов использовали SRSF2-GFP (NM_011358), маркер ядерных спеклов¹¹. Эта же среда используется для сбора ооцитов, микроинъекций, комплементарной трансляции РНК и визуализации живых клеток.

1. Линеаризуйте плазмиду Ранго с помощью плазмиды SfiI или SRSF2-GFP с ферментами рестрикции AgeI.
2. Синтезируют кэпированные комплементарные РНК (кРНК) с помощью соответствующего набора для транскрипции in vitro в соответствии с промотором (T3 для Rango и T7 для SRSF2-GFP) и очищают их с помощью набора для очистки колонки, как описано ранее²⁴.
   ПРИМЕЧАНИЕ: РНК полиаденилата SRSF2-GFP с использованием набора для полиаденилирования для повышения стабильности кРНК. Из-за различий в плазмидном каркасе используются два разных промотора.
3. Измеряйте концентрацию кРНК с помощью микрообъемного спектрофотометра.
4. Разбавляют кРНК Rango до 1000 нг/мкл и кРНК SRSF2-GFP до 600 нг/мкл в dH₂O.
5. Центрифугу кРНК аликвотируют при 4 °C в течение не менее 60 мин при 25 000 x g перед микроинъекцией.
6. Вводят кРНК, кодирующие YFP-Rango или SRSF2-GFP, как описано в^11,25, в цитоплазму ооцитов в среде M2+BSA+Milrinone с температурой 37 °C с помощью микроинъектора.
7. Инкубируйте ооциты не менее 2 ч в питательной среде при 37 °C для трансляции кРНК.
8. Поместить ооциты в мелкие (5 мкл) капли питательной среды на 35-миллиметровую чашку для культивирования тканей с крышкой и стеклянным дном, покрытым минеральным маслом. Помещайте по одному ооциту на каплю, чтобы избежать фотообесцвечивания соседних ооцитов.

3. Визуализация живых клеток

ПРИМЕЧАНИЕ: Ооциты живых мышей исследовали с помощью инвертированного конфокального микроскопа, оснащенного масляным иммерсионным объективом Plan-APO 40x/1,25 NA, моторизованной сканирующей декой, инкубационной камерой (37 °C), ПЗС-камерой, соединенной с колесом фильтра, и вращающимся диском. Изображения с высоким временным разрешением получаются с помощью программы Metamorph (далее — программное обеспечение для обработки изображений) в режиме потокового захвата.

1. Откройте окно Acquisition (Получение ) программного обеспечения для работы с изображениями.
2. Установите время экспозиции 500 мс, область камеры на Full Chip и биннинг на 1.
3. На вкладке Получение задайте подсветку для нужного канала. Чтобы визуализировать цитоплазматическую активность, ооциты освещают проходящим светом. Чтобы визуализировать ядро, помеченное YFP-Rango или SRSF2-GFP, осветите ооциты с длиной волны возбуждения 491 нм.
4. Для экспериментов с цитоплазматическим перемешиванием или YFP-Rango сосредоточьтесь на ядрышке ооцита, которое можно легко наблюдать в проходящем свете (рис. 3A). Будет приобретен один единственный самолет. Для экспериментов с ядерными спеклами сосредоточьтесь на каплях SRSF2-GFP (рис. 3C).
5. На вкладке « Специальные » задайте параметры для оптимизации скорости сбора данных, как показано ниже.
   Затвор фотокамеры: открыт для экспонирования
   Режим очистки: CLEAR PRESEQUENCE
6. Откройте окно Stream Acquisition (Захват потока) программного обеспечения для работы с изображениями. Задайте параметры потоковой передачи в соответствии с экспериментом. Для обоих исследований^10,11 используйте параметры, описанные ниже.
   1. На вкладке Получение задайте следующие параметры.
      Режим сбора: Потоковая передача в ОЗУ
      Количество кадров: 480 (можно уменьшить до 240 кадров для уменьшения времени визуализации)
      Параметры камеры: получение изображений с частотой кадров
      Количество пропущенных кадров (Nb): 0
   2. На вкладке Digital Camera Controller Parameters (Параметры контроллера цифровой камеры ) задайте следующие параметры.
      Состояние камеры: HALT
      Режим затвора: НИКОГДА не открывать
      Режим очистки: CLEAR PRESEQUENCE
      Кол-во кадров в среднем: 1
      ПРИМЕЧАНИЕ 1: В потоковом режиме после установки времени экспозиции продолжительность видеосъемки определяется количеством кадров. Например, время экспозиции 500 мс и 480 кадров создают видеоролик продолжительностью 4 минуты. Предварительный просмотр может отображаться во время получения изображения.
7. Настройте область интереса (ROI) вокруг объекта. Минимизация площади ROI сокращает время приобретения.
8. Нажмите « Получить » в окне «Получение потока », чтобы запустить фильм.
9. Сохранение фильма в виде файла .tif в конце съемки.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Для наблюдения за ядерными структурами во время видеосъемки с высоким временным разрешением ядерные зонды (YFP-Rango и SRSF2-GFP) должны иметь высокое отношение сигнал/шум, чтобы облегчить сегментацию объектов на дальнейших этапах анализа изображений. Профили экспрессии экзогенных SRSF2-GFP должны быть сопоставимы с эндогенными ядерными спекл-иммуноокрашиваниями (рис. 3C-D). Изменения в профилях экспрессии SRSF2-GFP по сравнению с эндогенным окрашиванием могут отражать высокие дозы инъекции и трансляции кРНК²⁶ (рис. 3C-D).

4. Анализ изображений: цитоплазматическое перемешивание

ПРИМЕЧАНИЕ: Цитоплазматическое перемешивание, отражающее интенсивность актин-скелетной активности в ооцитах, определяется с помощью корреляционного анализа изображений с использованием программного обеспечения из предыдущей публикации лаборатории⁹ и доступной на²⁷. Программное обеспечение измеряет, насколько сохраняется интенсивность пикселей между последовательными изображениями. Результатом является потеря корреляции между изображениями во времени, начиная с 1 и экспоненциально уменьшаясь со временем, как в⁹.

1. Выровняйте необработанные интервальные изображения (Δt=0,5 с) с помощью плагина Fiji StackReg (Plugins>StackReg). Для установки плагина StackReg²⁸ включите обновление BIG-EPFL site²⁹ для получения доступа к плагину.
2. Рассчитайте корреляции яркопольных изображений в 3-4 цитоплазматических областях размером ~300^мкм2 , выполнив следующие действия.
   1. Обрезайте регионы и сохраняйте их как отдельные видеофайлы. Откройте окно Терминал.
   2. Введите oocyte, нажмите клавишу пробела , а затем нажмите клавишу Enter. Появится окно под названием Signal and Slot (Сигнал и слот). Выберите обрезанные видеофайлы, которые будут анализироваться.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Одновременно можно выбрать несколько фильмов.
3. Приложение возвращает файлы в той же папке, что и фильмы. Генерируются три разных файла с расширениями .csv, .eps и .xls. Файл .xls содержит данные для построения графиков корреляции для одного региона. Средние значения корреляции из разных областей в ячейке.
4. Для наглядности преобразуйте конечные значения корреляции, вычитая значение каждой временной точки из 1, чтобы получить инвертированную экспоненциальную кривую, как показано на ^{рисунке 11}.

5. Анализ изображений: цитоплазматические векторные карты

ПРИМЕЧАНИЕ: Векторные карты цитоплазматических ооцитов мыши были сгенерированы с помощью плагина³⁰ Spatiotemporal Image Correlation Spectroscopy (STICS), ранее реализованного для обнаружения цитоплазматических потоков в ооцитах мышей³¹ на Фиджи ³² и доступного на ³³. Карты показывают величину и направление скорости цитоплазматического потока, как на^{рисунках 9} и¹¹.

1. Преобразование светлых интервальных изображений (Δt=0,5 с) в 32-битный формат.
2. Выровняйте изображения с помощью плагина Fiji StackReg в разделе «Плагины» > StackReg и выберите трансформацию «Твердое тело ».
3. С помощью стека плагинов вычитание скользящей средней jru v2 (в инструментах Detrend пакета плагинов STICS) избавьтесь от неподвижных структур в мувике, вычитая усредненное по времени изображение мувика. Установите флажки « Вычесть статическое среднее » и «Вывести вложенный стек», выберите «Поддерживать пространственное среднее » и установите период на 5.
4. Нарисуйте ROI вокруг ооцита, исключив кору головного мозга, чтобы избежать пограничных эффектов плагина.
5. Запустите плагин STICS map jru V2 (в инструментах ICS) с размером подобласти 32 пикселя, размером шага 16 пикселей, временным сдвигом STICS 3, смещениями X и Y 0, множителем скорости 8, порогом величины 0 и флажками Normalize Vector Length, Center Vectors, Output Velocities и Use Movie Mask.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Плагин генерирует карту ооцита в формате .tif, отображая цитоплазматические потоки в виде векторов с цветами, обозначающими амплитуды потока, как в⁹ и¹¹, и файл excel с измеренными скоростями потока.

6. Анализ изображений: флуктуации контуров ядра

ПРИМЕЧАНИЕ: Флуктуации контура ядра, отражающие перемешивание ядерной мембраны, могут быть определены по видеозаписям ядер, помеченных YFP-Rango (рис. 4A, C). Для анализа изображений на предмет флуктуаций контуров ядерных реакторов требуется Fiji и установка плагинов StackReg (включить сайт обновления BIG-EPFL²⁹ для получения доступа к плагину StackReg), PureDenoise³⁴ и Ovocyte_nucleus. Плагин StackReg выполняет регистрацию изображений для коррекции возможного глобального движения. Плагин PureDenoise удаляет шум многомерных изображений, искаженных смешанным шумом Пуассона-Гаусса, и сглаживает контур ядра. Плагин Ovocyte_nucleus порогирует сигнал и заполняет отверстие, соответствующее ядрышку, чтобы создать бинарную маску ядра, выровнять ее с помощью StackRreg и вычислить расстояние r от центроида маски ядра до окружности маски для всех углов θ (θ° от 0° до 360° с шагом 1°), как показано на рисунке 4. Все коды для этих плагинов можно найти по адресу ³⁵.

1. На Фиджи в меню Plugins > CIRB > Verlhac выберите Ovocyte Nucleus Shape.
2. В диалоговом окне выполните следующий выбор.
   1. Выберите папку, содержащую фильмы для анализа.
   2. Выберите угол θ (можно выбрать значение от 1° до 360° и значение 1° было использовано для оптимального разрешения контура), поля для обрезки (рекомендуется 5 мкм, чтобы сохранить все ядро).
   3. Выберите калибровку XY и интервал времени. Нажмите кнопку ОК.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Результаты предоставляются в виде .xls файлов в папке «Исходящие» в папке, содержащей исходные фильмы. В этом файле отображаются все измеренные радиусы r для каждого времени времени t и каждого угла θ. Пример выходного файла приведен в Дополнительной таблице 1. Папка out также содержит видеоролик с маской ядра.
3. Используя электронную таблицу, вычислите средний радиус R по всем временным точкам t для каждого заданного угла θ. Это позволяет построить график средней формы во времени (рис. 4B). Пример см. в Дополнительной таблице 2.
4. Для каждого t и θ вычтите средний радиус R во времени из радиуса r. Дисперсия (r-R)² является мерой флуктуаций ядерной оболочки.
5. Вычислить среднее значение флуктуаций для всех точек времени t и всех углов θ для каждого ядра и, в конечном итоге, для всех ядер из одного условия.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Когда форма ядер значительно изменяется, например, в случае разрушения цитоскелета, ядра, помеченные YFP-Ранго, поворачивают на Фиджи, чтобы сориентировать гладкую часть вверх и инвагинацию вниз, прежде чем приступить к анализу флуктуаций ядерных контуров, как показано на^{рисунке 10}.

7. Анализ изображений: Движения ядерных спеклов (диффузионная динамика)

ПРИМЕЧАНИЕ: Анализ движения ядерных спеклов позволяет определить тип динамики (управляемая, диффузионная или ограниченная) этих органелл по их трекам.

1. Выберите изображения ооцитов, экспрессирующих капли SRSF2-GFP, которые в основном движутся по оси X-Y.
2. Коррекция для обесцвечивания покадровых изображений ооцитов, экспрессирующих SRSF2-GFP, с использованием метода сопоставления гистограмм на Фиджи (Image > Adjust > Bleach Correction).
3. Выровняйте изображения с помощью плагина Fiji StackReg.
4. Отслеживайте центры капель SRSF2-GFP с помощью плагина Fiji Manual Tracking (Плагины > отслеживания > ручного отслеживания). Нажмите «Добавить дорожку », чтобы начать отслеживание, и нажмите «Завершить трек », когда закончите. Не активируйте коррекцию центрирования.
5. Скопируйте треки в файл электронной таблицы, чтобы продолжить расчет среднеквадратичных смещений (MSD), как показано на ^{рисунке 11}, и вычислите временные значения MSD из каждых 20 секунд траекторий капель.
6. Аппроксимация кривых (msd(t) = beta x t^α) с помощью метода Нелдера-Мида с использованием программного обеспечения R для оценки показателя диффузии альфа (α).
7. Измерьте эффективный коэффициент диффузии, чтобы иметь возможность сравнивать различные условия, поскольку ожидается, что диффузия будет аномальной (α< 1).
8. Вычислите эффективный коэффициент диффузии D_eff по линейной аппроксимации (альфа=1) на 40 первых точках (20 с) временной кривой MSD и нормализуйте по размеру капель (D_eff в мкм²/с x 3/2 πr в мкм).

8. Анализ изображений: флуктуации поверхности ядерных спеклов

ПРИМЕЧАНИЕ: Эволюция контура ядерного спекла во времени, считывание передачи активной силы на эти органеллы, было измерено с помощью специально разработанного плагина Radioak³⁶ для использования на Фиджи и доступно на³⁷. Плагин извлекает значения радиусов заданной выделения для всех углов вокруг центра выделения. Изменение формы во времени измерялось путем сравнения значения радиуса относительно его среднего значения для каждого угла. Плагин позволяет количественно оценить колебания формы и предлагает возможность визуализировать эту динамику. Чтобы установить его, скачайте Radioak_.jar файл и поместите его в папку plugins Fiji. Перезапустите Фиджи. Этот плагин представляет собой обновленную версию плагина, используемого для анализа флуктуаций контуров ядерных реакторов, описанных выше, и реализации сопоставимого трубопровода.

1. В потоковых видеороликах с каплями SRSF2-GFP выбирайте более крупные капли сопоставимых размеров (радиус ~2,5 мкм).
   ПРИМЕЧАНИЕ: Если капли слишком малы, недостаточное разрешение приведет к измерениям аберрантных флуктуаций поверхности.
2. Обрежьте интервальные изображения капель продолжительностью 15 с (Δt = 0,5 с), нарисовав прямоугольник вокруг капли, и выберите Изображение > Обрезать (рис. 5).
3. Выровняйте изображения с помощью плагина Fiji StackReg в разделе «Плагины» > StackReg и выберите трансформацию «Твердое тело ».
4. Сглаживание изображения для удаления шума вокруг капли с помощью параметра «Сглаживание Фиджи» в разделе «Обработать».
5. Создайте двоичную маску дроплета, используя опцию «Преобразовать в маску» на Фиджи в разделе «Обработать > двоичный файл». Используйте метод Default и Dark для фона (рисунок 5).
6. Проанализируйте сгенерированную двоичную маску капель с помощью опции «Анализировать частицы » на Фиджи в разделе «Анализ», выберите «Очистить результаты » и «Добавить в менеджер » и сохраните область интереса (ROI) в RoiManager (More > Save) в формате zip для чтения Radioak. Окупаемость инвестиций должна быть сохранена в папке под названием contours в той же папке фильмов, в файлах с именем imagename_UnetCortex.zip чтобы каждый фильм был найден Radioak.
7. В меню Fiji Plugins > CIRB > Radioak выберите Get Radii для обработки только одного фильма или Do One Folder для анализа всех фильмов из одной папки.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Появится окно для выбора номера угла и масштаба. Радиоак был запущен с шагом угла 1° от 0° до 360° (ввод 360) и извлечены значения радиусов.
8. Выберите фильм или папку, содержащую фильмы для анализа. Результаты предоставляются в виде .xls файлов (по одному для каждого фильма) в каталоге radioakres в папке, содержащей исходные фильмы. В каждом файле отображаются все измеренные радиусы r (в мкм, если параметр масштаба был заполнен) для каждого времени t (в срезе) и каждого угла (в радианах; Рисунок 5; см. пример .xls выходных данных в Дополнительной таблице 3).
9. В электронной таблице вычислите средний радиус R по всем временным точкам t для каждого заданного угла (см. пример в дополнительной таблице 4). Это позволяет построить график средней формы во времени.
10. Постройте график дисперсии (r-R)² в^мкм2 , которая соответствует мере флуктуаций поверхности капель.

Результаты

На рисунке 3 показаны примеры типичного полностью выращенного ооцита (рис. 3A), нуклеоплазма в полностью взрослом ооците экспрессирует YFP-Rango (рис. 3B), нуклеоплазма в полностью взрослом ооците экспрессирует правильный (левая панель; Рисунок 3В) или избыточный (правая панель; Рисунок 3В) дозы кРНК SRSF2-GFP и иммуноокрашивание ядерных пятен в полностью выращенной яйцеклетке с использованием антитела SC35 (рис. 3D). Правильная доза кРНК SRSF2-GFP для микроинжекции определялась на основе визуального сравнения профилей экспрессии SRSF2-GFP с эндогенными профилями ядерных спеклов.

Силы цитоплазматического перемешивания в ооцитах, как показали предыдущие лабораторные работы с использованием векторных карт STICS и корреляционного анализа изображений (см.⁹ и¹¹), могут быть уменьшены цитоскелетными возмущениями, как генетическими (например, FMN2-мутантная мышь), так и химическими (например, цитохалазин D). Карты контрольных ооцитов STICS отображают множество векторов, при этом цвета указывают на высокие скорости потока, в то время как карты ооцитов с нарушенными цитоскелетными силами отображают меньшее количество векторов, а цвета указывают на низкие скорости потока. Аналогичным образом, корреляция изображений очень быстро теряется в контрольных ооцитах по сравнению с ооцитами с нарушенными цитоскелетными силами. Это наблюдается на корреляционных кривых, при более быстром уменьшении кривой для контрольных ооцитов по сравнению с ооцитами с нарушенными цитоскелетными силами⁹ или более быстрым увеличением при инвертировании кривой¹¹.

Цитоскелетные силы возбуждают ядро и его внутренние органеллы, в частности ядерные конденсаты, такие как ядерные спеклы^10,11. На рисунке 4А ядро контрольных ооцитов подвергается важным периферическим флуктуациям, что видно с помощью ядерного зонда YFP-Ранго. Форма ядра в ооцитах с нарушенными цитоскелетными силами стабильна во времени (рис. 4В). Анализ флуктуаций контуров ядра является ключом к точной количественной оценке перемешивания. Определив дисперсию расстояния от центроида ядра до его периферии, (r-R)² (рис. 4B), можно количественно оценить флуктуации, показывающие, что ядерное возбуждение в контрольных ооцитах в 6 раз выше, чем в ооцитах с нарушенными цитоскелетными силами¹⁰. На рисунке 5A-B показаны ядерные спеклы (капли SRSF2-GFP⁺) в контрольном и нарушенном контекстах цитоплазматических сил с высоким временным разрешением. В контрольной группе поверхность капель колеблется значительно больше, чем поверхность капель в ооцитах с нарушенными цитоплазматическими силами, что можно визуализировать и количественно оценить с помощью плагина Radioak³². Визуально зеленый и красный цвета (вывод Radioak виден на нижних изображениях на рисунке 5A-B) указывают на углы, в которых плагин обнаружил изменения поверхности между последовательными изображениями, а белый указывает на отсутствие изменений поверхности.

Рисунок 1: Иллюстрация позднего оогенеза мышей и раннего эмбриогенеза. Иллюстрация центрирования ядра, которое происходит при позднем росте ооцитов, смещение хромосом, которое происходит во время деления ооцитов, и ранние этапы (1-клеточная и 2-клеточная стадии) эмбриогенеза. Женские геномы (ядро ооцита и женское пронуклеус) выделены розовым цветом, мужской пронуклеус – синим. Ядра эмбриона (после слияния родительских геномов) имеют фиолетовый цвет. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этого рисунка.

Рисунок 2: Иллюстрация цитоплазматического и ядерного ремоделирования в разных масштабах в растущих ооцитах мышей. На этом рисунке обобщены основные выводы ^9,10,11. Иллюстрация ремоделирования цитоплазмы на основе актомиозина, ядерного перемешивания и функционального ремоделирования ядерного биомолекулярного конденсата в пространственно-временных масштабах. Масштабное ремоделирование ядерных спеклов усиливает биомолекулярные реакции, связанные с их функцией (т.е. сплайсинг пре-мРНК). Заметим, что этот протокол позволяет оценивать ядерное возбуждение только в пространственных масштабах, но не во временных, поскольку все изображения выполняются с одинаковым временным разрешением 0,5 с между кадрами изображения. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этого рисунка.

Рисунок 3: Примеры изображений полностью взрослого ооцита и нуклеоплазмы. (A) Яркопольное изображение полностью взрослого ооцита, показывающее хроматин (голубой), который окружает ядрышко. Пунктирным белым кругом очерчено ядро. (B) живое ядро ооцита, экспрессирующее YFP-Ранго; Обратите внимание на отсутствие флуоресценции в ядрышке. (C) Пример живого ядра ооцита, экспрессирующего SRSF2-GFP после микроинъекции правильных доз кРНК (левая панель) или высоких доз кРНК (правая панель); Обратите внимание на конденсированную (капельную) и растворенную фазы слева и их отсутствие в условии справа. (D) Ядерное спекл-иммуноокрашивание в фиксированном ооците; обратите внимание на профиль эндогенной экспрессии, который сопоставим с профилем в C (левая панель). Масштабные линейки = 5 мкм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Рисунок 4: Подключаемые выходы контрольных и нарушенных флуктуаций контура ядра. (A) Интервальная съемка ядра контрольного ооцита, экспрессирующего YFP-Rango (вверху) и соответствующей ему бинарной маски, сгенерированной плагином Ovocyte_nucleus (внизу). (Б) Принцип измерения флуктуаций контура ядра во времени и в заданном направлении. Направления определяются углом поворота θ с шагом 1° от 0° до 360°. Представлены две репрезентативные фигуры при t=0 с (желтый) и t=135 с (фиолетовый). Синяя форма соответствует средней форме с течением времени. (C) Флуктуации ядра в яйцеклетке с уменьшением цитоскелетных сил из-за разрушения как F-актина (FMN2-мутантная мышь), так и микротрубочек (лечение нокодазолом; как в¹⁰). Масштабные линейки = 5 мкм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Рисунок 5: Выходы плагинов управления и нарушенных флуктуаций поверхности капель. (A) Кадрирование контрольной ядерной капли SRSF2-GFP, полученное с частотой 500 мс на кадр и показанное в таблице Ice Look Up Table (LUT) (вверху); бинарная маска одной и той же капли, сгенерированная Фиджи (в центре); и плагин Radioak выводит данные после анализа поверхностных флуктуаций капли (внизу), где зеленый и красный обозначают углы, где плагин обнаружил изменения поверхности между последовательными изображениями, а белый указывает на отсутствие изменений поверхности. (B) Поверхностные флуктуации ядерной капли в ооцитах с уменьшением цитоскелетных сил из-за разрушения как F-актина, так и микротрубочек (как в¹¹). Масштабные линейки = 5 мкм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Дополнительная таблица 1: Пример выходных данных анализа плагина Ovocyte_nucleus. Анализируется то же ядро, что и на рисунке 4А. Тета (θ) — угол в градусах, а от t1 до t600 соответствует номеру кадра, который может быть преобразован во времени. Радиусы указаны в мкм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить этот файл.

Дополнительная таблица 2: Образец электронной таблицы, используемой для расчета флуктуаций контура ядра. Анализируется то же ядро, что и на рисунке 4А. Тета (θ) — угол в градусах, а от t1 до t600 соответствует номеру кадра, который может быть преобразован во времени. Вкладка Необработанные и средние: радиусы указаны в мкм. Tab r-R: Расстояния r-R указаны в мкм. Таблица (r-R)²: Значения флуктуаций указаны в^мкм2. Вкладки x и y соответствуют декартовым координатам радиусов из вкладки Raw и average. Они позволяют нарисовать среднюю форму ядра с течением времени на вкладке средней формы. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить этот файл.

Дополнительная таблица 3: Пример вывода анализа плагина Radioak. Анализируется та же капля, что и на рисунке 5A. Показаны измеренные радиусы в различных временных точках и углах. Радиусы указаны в мкм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить этот файл.

Дополнительная таблица 4: Образец электронной таблицы, используемой для расчета флуктуаций поверхности ядерных капель. Анализируется та же капля, что и на рисунке 5A. Тета (θ) — угол в градусах, а от t1 до t600 соответствует номеру кадра, который может быть преобразован во времени. Вкладка Необработанные и средние: радиусы указаны в мкм. Tab r-R: Расстояния r-R указаны в мкм. Таблица (r-R)²: Значения флуктуаций указаны в^мкм2. Вкладки x и y соответствуют декартовым координатам радиусов из вкладки Raw и average. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить этот файл.

Обсуждение

Ключевые шаги в этом протоколе включают правильную микроинъекцию ооцитов, не влияющую на их выживание или нормальную функцию ^9,10,11, а также микроинъекции заранее определенных количеств кРНК, которые позволят правильно визуализировать соответствующие структуры, такие как ядерные спеклы.

Установление связи между цитоплазматической и (внутри)ядерной динамикой имеет важное значение при изучении того, как цитоскелет возбуждает ядро или его внутреннюю часть. Этот протокол, с небольшими изменениями, позволяет это сделать, соотнося интенсивность цитоплазматического перемешивания с динамикой ядерных капель YFP-Rango или SRSF2-GFP (как в¹¹). Для этого ооциты должны быть сначала сняты в течение 120 секунд в режиме светлого поля для захвата цитоплазматического перемешивания, а затем немедленно сняты в течение 120 секунд лазером с длиной волны 491 нм для захвата ядерного контура или динамики капель. В случае ядерных капель SRSF2-GFP корреляцию можно просто оценить, сравнив их эффективные коэффициенты диффузии (см. шаг 7 настоящего протокола) с инвертированными значениями максимальной интенсивности цитоплазматического перемешивания, полученными с помощью корреляционного анализа изображений (см. шаг 4 в этом протоколе). Еще одним важным моментом является размер конденсатов, выбранных для анализа флуктуаций поверхности капель. Для сравнительного анализа следует выбирать капли одинакового диаметра, чтобы избежать смещения, так как размер модулирует интенсивность поверхностных колебаний.

У этого протокола есть некоторые ограничения. Анализ флуктуаций контура ядра основан на полном внутриядерном окрашивании, таком как YFP-Rango или NLS-GFP. Для анализа ядерных спеклов микроинъекция избыточных количеств кРНК SRSF2-GFP может привести к явным изменениям фазоразделительных свойств этого маркера конденсата (рис. 3C), как ранее рассматривалось другими специалистами²⁶. Поэтому крайне важно убедиться в том, что профили экспрессии экзогенных белков сопоставимы с эндогенными профилями. Кроме того, относительно небольшие капли (радиус <2 мкм) должны быть исключены из конвейеров анализа поверхностных флуктуаций из-за ограничений пространственного разрешения с помощью инструментов, определенных здесь. Эта проблема обычно может быть решена с помощью более резонирующих микроскопов, которые, например, могут быть необходимы для исследования поверхностных флуктуаций более мелких конденсатов в ядре ооцита или в значительно меньшем ядре соматических клеток.

В целом, этот протокол позволяет захватывать возбуждение ядра ооцита мыши на основе актина и микротрубочек в цитоскелете через масштабы. В частности, он позволяет документировать мобилизацию цитоплазмы на основе цитоскелета, флуктуации ядерных контуров, а также жидкоподобные ядерные спекл-смещения и поверхностные флуктуации. Несмотря на то, что некоторые исследования в других типах клеток рассматривают некоторые из этих вопросов^{с помощью различных} протоколов различной сложности в отдельных пространственных масштабах, этот простой протокол впервые предоставляет инструменты, необходимые для рассмотрения упомянутой клеточной динамики в нескольких масштабах в одном рабочем процессе. Кроме того, данные, полученные с помощью этого подхода, в сочетании с биофизическим моделированием, как показано в^{10, 11}, позволяют минимально инвазивно оценить: i) изменения в ядерной^{механике10}; ii) передача активных сил цитоскелета в цитоплазме конденсатам в ядре¹¹; и iii) диссипация этой активной энергии по различным клеточным компартментам^10,11. Важно отметить, что этот протокол является универсальным, поскольку он может быть адаптирован не только к другим ядерным конденсатам, таким как ядрышко²³, но и к другим типам клеток, таким как раковые клетки, где ^{были зарегистрированы изменения} как в поведении цитоскелета, так и в поведении ядерного конденсата.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье

Имя	Компания	Каталожный номер	Комментарии
Бычий сывороточный альбумин (BSA)	Sigma	A3311
CSU-X1-M1 Вращающийся диск	Yokogawa
DMI6000B микроскопа	Leica
Femtojet микроинъектор	Eppendorf
Fiji
Фильтрующее колесо	Sutter Instruments Roper Scientific Fluorodish
	World Precision Instruments	FD35-100
Metamorph программное обеспечение	Универсальная визуализация,		версия 7.7.9.0
Минеральное масло	Sigma Aldrich	M8410-1L
NanoDrop 2000	Мыши Thermo Scientific
OF1 и C57BL/6	Charles River Laboratories
Poly(A) Хвостохранилище	Thermo Fisher	AM1350
Retiga 3	Набор QImaging
RNAeasy	Qiagen	74104
SC35 антитело	Abcam	ab11826	Ядерное спекл-антитело; мышиный IgG1 анти-SRSF2/SC35 (1:400)
SRSF2-GFP плазмида	OriGene Technologies	MG202528	NM_011358
Микропипетка для стриппера	Специализированные решения		для сбора ооцитов
T3 mMessage mMachine Thermo	Fisher	AM1384
T7 mMessage mMachine	Thermo Fisher	AM13344
Термостатическая камера	Служба
Windows Excel	Windows