Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.

Методическая статья

Создание модели перфузии легких ex vivo на крысах для трансляционного анализа трансплантации легких

1.6K просмотров

⸱

DOI:

10.3791/65981

⸱

29 сентября 2023 г.

 ,  ,  , 
1Toronto General Hospital Research Institute, University Health Network, 2Department of Surgery, University of Toronto, 3Departamento de Cardiopneumologia, Instituto do Coração, Faculdade de Medicina HCFMUSP, Universidade de Sao Paulo

* These authors contributed equally

В этой статье

Краткое содержание

В этой статье мы описываем необходимые шаги для создания модели ЭВЛП крысы и показываем воспалительный профиль, связанный с перфузией легких. Цель состоит в том, чтобы распространить знания и опыт о модели EVLP крысы, что позволит получить целостное представление о биологических реакциях, связанных с этой революционной техникой.

Аннотация

С тех пор, как трансплантация легких стала терапевтической стратегией при прогрессирующих заболеваниях легких, научное сообщество столкнулось с проблемой низкого количества легких, считающихся пригодными для процесса донорства. Однако в последние десятилетия этот сценарий был положительно изменен, учитывая развитие перфузии легких ex vivo (EVLP) в качестве стратегии оценки и восстановления маргинальных легких. Внедрение ЭВЛП в крупных центрах трансплантации способствовало увеличению числа трансплантаций легких, как за счет повышения диагностической точности функции легких, так и за счет создания эффективной платформы для восстановления легочных трансплантатов. В этом контексте, столкнувшись с этическими и логистическими проблемами, а также при изучении иммунологических факторов, связанных с трансплантацией легких, разработка моделей EVLP грызунов приобрела важное значение, учитывая их надежность, возможность генетических манипуляций и более низкие затраты. В данной статье описан протокол создания модели ЭВЛП крысы и показан воспалительный профиль, связанный с перфузией легких. Это поможет распространить знания о модели ЭВЛП у крыс, способствуя нашему пониманию биологических реакций, связанных с этой революционной техникой.

Введение

Трансплантация легких была признана терапевтической стратегией при терминальных стадиях заболеваний с улучшением хирургических методов и иммуносупрессии в течение последних десятилетий. Несмотря на высокий спрос, количество приемлемых умерших доноров легких ниже, чем для других солидных органов, сходясь к меньшему количеству выполненных трансплантаций легких 1,2,3. Чтобы решить проблему нехватки донорского пула, медицинское сообщество расширило критерии донорства легких, превратив органы, которые ранее считались нежизнеспособными, в потенциальные органы для трансплантации. Тем не менее, расширенные критерии требуют различных усилий для лучшего понимания и вмешательства с учетом возможных системных последствий, связанных с донорским органом. Перфузия легких ex vivo (ЭВЛП) возникла как метод, обеспечивающий нормотермическое сохранение легких, оценку функций легких и восстановление легких, которые ранее считались нецелесообразными для процесса донорства 4,5,6.

Учитывая растущее число трансплантаций легких с момента создания ЭВЛП в крупных центрах трансплантации, стратегии сохранения и восстановления легких все чаще исследуются. В этом смысле, столкнувшись с этическими и логистическими проблемами, а также при изучении иммунологических факторов, связанных с трансплантацией легких, разработка моделей EVLP грызунов стала важной, учитывая их надежность, возможность генетических манипуляций и болеенизкие затраты. Здесь мы описываем необходимые шаги для создания модели EVLP крысы и показываем воспалительный профиль, связанный с перфузией легких.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

Эксперименты на животных проводились в соответствии с Протоколом использования животных, утвержденным Комитетом по уходу за животными в Университетской сети здравоохранения. Самцы крыс породы Льюис (255-330 г) получали доступ к пище и воде ad libitum . Затем их поддерживали в контролируемой среде (18-22 °C) с 12-часовым циклом день-ночь. Подробные сведения обо всех материалах, решениях и инструментах, используемых в этом протоколе, см. в Таблице материалов .

1. Инициализация системы перфузии легких ex vivo

  1. Убедитесь, что все датчики подключены к оборудованию для изолированного перфузионного органа и системе сбора данных (рис. 1). Затем откройте программное обеспечение для сбора данных.
  2. Перед перфузией заполните контур ЭВЛП 150 мл раствора Стина с добавлением 1000 единиц USP гепарина натрия, 50 мг цефазолина и 50 мг метилпреднизолона.
  3. Установите теплую водяную баню на 20 °C. Запустите циркуляцию теплой воды, чтобы прогреть всю систему EVLP.

2. Процедура заготовки донорского легкого

  1. Обезболивают крысу внутрибрюшинной инъекцией кетамина (50 мг/кг) и ксилазина (5 мг/кг) или в соответствии с местной практикой. Подтвердите надлежащую глубину анестезии, проверив рефлекс защемления пальца ноги.
  2. Провести оротрахеальную интубацию (внутривенный катетер 14 G). После интубации подключите трахеальную трубку к системе вентиляции для мелких животных. Проветрите крысу с дыхательным объемом 10 мл/кг, скоростью 60 вдохов/мин, фракцией кислорода на вдыхаемом воздухе (FiO2) 0,5 и положительным давлением на конечном выдохе (PEEP) 2 смЧ2О.
  3. Поместите крысу в положение лежа на спине.
  4. С помощью соответствующих ножниц и щипцов ввести в брюшную полость и провести разрез краниально, выполнив срединную лапаротомию и введя в воротную вену гепарин натрия (400 единиц USP).
  5. Впоследствии попадают в грудную полость через ксифоидный отросток. Проводят стернотомию с черепной резекцией грудины и осторожным радиальным вскрытием диафрагмы, чтобы не повредить легкое.
  6. Чтобы извлечь блокаду сердца и легких, сделайте разрез в нижней полой вене (НПВ) и вдоль верхушки левого отдела сердца.
  7. С помощью микроножниц выполните передний разрез в выходном тракте правого желудочка. Затем введите внутривенный катетер 18 г в легочный ствол и промойте легкие 20 мл раствора декстрана калия (LPD), содержащего 10 мкг/мл простагландина E1.
  8. Сразу после промывания зажмите нижнюю треть трахеи в конце вдоха, чтобы сохранить легкие в надутом состоянии.
  9. Соберите блок сердца и легких и поместите его в раствор LPD для хранения.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Легочный трансплантат может храниться при различных температурах и различных интервалах времени в зависимости от цели исследования. Здесь мы показываем репрезентативные результаты исследований легких, которые подвергались различной продолжительности времени холодной ишемии (CIT) на льду.

3. Процедура перфузии легких ex vivo

  1. Поместите шелковую лигатуру 0 под главную легочную артерию (ПА) и вокруг желудочков и предварительно заложите для облегчения канюляции.
  2. Подключите канюлю PA к входной линии системы EVLP и запустите перистальтический насос с потоком 10% от потока технического обслуживания, что позволит удалить воздух из канюли PA.
  3. Поместите и закрепите входную канюлю в главном ПА (внешний диаметр: 2,0 мм / диаметр головки: 2,5 мм), а затем дренажную канюлю из верхушки сердца в левое предсердие (диаметр головки LA: 4,0 мм) через митральный клапан для последующей перфузии. Используйте щипцы для расширения митрального клапана, облегчая канюляцию.
  4. Сделайте небольшое отверстие в трахее и вставьте канюлю трахеи (внешний диаметр: 2,0 мм/л: 14 мм). Затем подключите его к вентиляционной линии системы.
  5. Подключите канюлю LA к выходной линии системы.
  6. ПРИМЕЧАНИЕ: Мы устанавливаем 10% поддерживающего потока в качестве начала перфузии. Чтобы избежать попадания пузырьков воздуха в легкие, убедитесь, что ловушка для пузырьков заполнена.
  7. Постепенно увеличивайте скорость кровотока перфузией до достижения 20% от сердечного выброса (CO).
    ПРИМЕЧАНИЕ: Для перфузии обоих легких мы использовали расчетный CO 75 мл/мин для крыс с массой 250 г10,11. Скорость перфузии постепенно увеличивалась до 1 ч для достижения целевой скорости потока в соответствии с нашим клиническим протоколом EVLP12. Параметры перфузии сведены в таблицу 113.
  8. Через 20 мин после начала перфузии снимите трахеальный зажим и начните вентиляцию легких, а затем запустите поток газа EVLP (8% CO2, 6% O2, 86% N2) для поддержания притока перфузата PCO2 в диапазоне от 35 до 45 мм рт.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Параметры вентиляции сведены в таблицу 113.

4. Управление параметрами и образцами

  1. Каждый час во время ЭВЛП записывайте в режиме реального времени динамическую податливость легких и легочное сосудистое сопротивление (ПВР).
    ПРИМЕЧАНИЕ: За 5 минут до физиологической оценки легкие должны быть расширены до давления надувания.
  2. Отбирайте пробы перфузата из порта для отбора проб каждый час и замораживайте в жидком азоте для дальнейших анализов.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Кроме того, за 5 минут до оценки мы выполняем маневр набора персонала (до 20 смЧ2О), после чего берем перфузаты для анализа газов крови для измерения pH, PCO2, PO2, электролитов, глюкозы и лактата.
  3. Остановите перфузию и зажмите трахею, чтобы поддерживать легкие в надутом состоянии. Впоследствии изолируют образцы легких и мгновенно замораживают их в жидком азоте или помещают в фиксирующие растворы для дальнейших исследований.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Здесь легкие были перфузированы в течение 4 часов.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

Все легкие с ЦИТ в период от 20 мин до 18 ч могут быть перфузированы в течение 4 ч (Рисунок 2)13. Комплаентность была стабильной в большинстве групп, за исключением 18-часовой CIT, которая постепенно снижалась в течение 4-часового периода перфузии (Рисунок 2A). Несмотря на это, в группах не наблюдалось существенных различий в сосудистом сопротивлении, оксигенации легочного трансплантата и уровне глюкозы (...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

В этом исследовании описаны необходимые шаги для создания протокола ЭВЛП крыс. Здесь мы показываем, что донорские легкие могут быть перфузированы в течение 4 ч после сохранения холодного статического электричества до 18 ч при 4 °C. Это было продемонстрировано путем оценки податливости легких, легочного сосудистого сопротивления, концентрации перфузата глюкозы/лактата и соотношения P/F.

Развитие платформы EVLP в качестве важного инструмента для оценки функции ...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

MC является акционером Traferox Technologies Inc и консультантом Lung Bioengineering Inc. MC получает исследовательскую поддержку от Beyond Air Inc. и Synklino. Авторы заявляют, что не было никаких конкурирующих интересов, которые могли бы повлиять на результат, описанный в этой статье.

Благодарности

Рисунок 1 был создан с BioRender.com (подтверждение прав на публикацию и лицензирование [Соглашение: BT25KGSKWF]).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
  14 G внутривенный катетерBD381167  Интубация Оротрахела
16 G внутривенный катетерBD381157Катетер для промывки лёгких
2-0 Suchure SofsilkКовидьенS-305  Фиксация трахеальной трубки
3-0 Suchure SofsilkКовидьенS303  Фиксация артериальных и предсердных канюль
IPL-2 Core Изолированная Перфузированая Легкая Система для КрысАппаратура Гарварда734276Система экс-виво перфузии лёгких (EVLP)
Кетамин (Наркетан)Ветокинол440894Седация/анестезия
Канюля большой легочной артерии Аппаратура Гарварда73-0711
Левая предсердная канюля;Аппаратура Гарварда73-0712
Раствор глюкозы с низким содержанием калия декстран (Перфадекс)XVIVO19811Решение по сохранению
Метилпреднизолон сукцинат натрия (SOLU-MEDROL)Pfizer14705Противовоспалительное средство
Простагландин E1 (Prostin VR)PfizerRX297945
Вентилятор для мелких животных (модель 683)Аппаратура Гарварда55-0000
Гепарин натрияЛео Фарма453811
Решение СтинаXVIVO19004Буферный внеклеточный раствор для перфузии лёгких во время EVLP
Sugita Aneur clip curvМидзухо07-940-86Трахеальный зажим
Трахеальная канюля Аппаратура Гарварда73-3384
Ксилазин (ромпун)Bayer Healthcare 2169592Седация/анестезия

Ссылки

  1. Chambers, D. C., et al. The International Thoracic Organ Transplant Registry of the International Society for Heart and Lung Transplantation: Thirty-eighth adult lung transplantation report — 2021; Focus on recipient characteristics. The Journal of Heart and Lung Transplantation. 40 (10), 1060-1072 (2021).
  2. Meyer, K. C. Recent advances in lung transplantation. F1000Research. 7, 1684(2018).
  3. Valapour, M., et al. OPTN/SRTR 2018 Annual Data Report: Lung. American Journal of Transplantation. 20, 427-508 (2020).
  4. Chaney, J., Suzuki, Y., Cantu, E., van Berkel, V. Lung donor selection criteria. Journal of thoracic disease. 6 (8), 1032-1038 (2014).
  5. Watanabe, T., Cypel, M., Keshavjee, S. Ex vivo lung perfusion. Journal of Thoracic Disease. 13 (11), 6602-6617 (2021).
  6. Saddoughi, S. A., Cypel, M. Expanding the lung donor pool. Clinics in Chest Medicine. 44 (1), 77-83 (2023).
  7. Wang, A., Ali, A., Keshavjee, S., Liu, M., Cypel, M. Ex vivo lung perfusion for donor lung assessment and repair: a review of translational interspecies models. American Journal of Physiology-Lung Cellular and Molecular Physiology. 319 (6), L932-L940 (2020).
  8. Noda, K., Philips, B. J., Atale, N., Sanchez, P. G. Endothelial protection in lung grafts through heparanase inhibition during ex vivo lung perfusion in rats. The Journal of Heart and Lung Transplantation. 42 (6), 697-706 (2023).
  9. Nelson, K., et al. Method of isolated ex vivo lung perfusion in a rat model: lessons learned from developing a rat EVLP program. Journal of Visualized Experiments. (96), (2015).
  10. Malik, A. B., Kaplan, J. E., Saba, T. M. Reference sample method for cardiac output and regional blood flow determinations in the rat. Journal of Applied Physiology. 40 (3), 472-475 (1976).
  11. Noda, K., et al. Successful prolonged ex vivo lung perfusion for graft preservation in rats. European Journal of Cardio-Thoracic Surgery. 45 (3), e54-e60 (2014).
  12. Cypel, M., et al. Technique for prolonged normothermic ex vivo lung perfusion. The Journal of Heart and Lung Transplantation. 27 (12), 1319-1325 (2008).
  13. Ohsumi, A., et al. A method for translational rat ex vivo lung perfusion experimentation. American Journal of Physiology-Lung Cellular and Molecular Physiology. 319 (1), L61-L70 (2020).
  14. Soares, P. R. O., et al. Comparison between perfadex and locally manufactured low-potassium dextran solution for pulmonary preservation in an ex vivo isolated lung perfusion model. Transplantation Proceedings. 43 (1), 84-88 (2011).
  15. Pêgo-Fernandes, P. M., et al. Experimental model of isolated lung perfusion in rats: first Brazilian experience using the IL-2 isolated perfused rat or guinea pig lung system. Transplantation Proceedings. 42 (2), 444-447 (2010).
  16. Yamanashi, K., et al. Reduction of donor mononuclear phagocytes with clodronate-liposome during ex lung perfusion attenuates ischemia-reperfusion injury. The Journal of Thoracic and Cardiovascular Surgery. 165 (4), e181-e203 (2023).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Теги

EVLP
Создание модели перфузии легких ex vivo на крысах для трансляционного анализа трансплантации легких
Связаться с нами
Порекомендовать библиотеке

Конфиденциальность

Условия использования

Политики

© 2026 MyJoVE Corporation. Все права защищены.