Методическая статья

Общечеловеческая система культивирования печени для разработки лекарств

2.3K просмотров

⸱

DOI:

10.3791/65992

⸱

20 октября 2023 г.

 ,  ,  ,  ,  , 
1Institute of Regenerative Medicine, LifeNet Health, 2Biologics Division, LifeNet Health, 3LifeSciences Division, LifeNet Health, 4Research and Development, LifeSciences, LifeNet Health

В этой статье

Краткое содержание

Недавние технические достижения позволили масштабировать производство платформы in vitro для применения в метаболизме и токсичности лекарств. Полностью человеческая 2D+ печеночная система (TV2D+) обеспечивает физиологически значимые результаты с использованием традиционных двумерных методов культивирования. Этот протокол поможет конечным пользователям в установке, обслуживании и применении системы.

Аннотация

Поиск долгосрочной, релевантной для человека модели культивирования первичных гепатоцитов человека (ПГХ) для фармакологических и токсикологических исследований остается сложной задачей. Современные платформы моделей in vitro часто неудобны и сложны, им не хватает фенотипической стабильности с течением времени, и они не поддерживают несколько партий PHH, не обладая экспериментальной воспроизводимостью и гибкостью. Здесь мы приводим подробный протокол размораживания, гальванизации и обслуживания полностью человеческой 2D+ печеночной системы (TV2D+), которая использует преимущества стандартных двухмерных (2D) методов и оборудования для культивирования, сохраняя при этом долговечность и фенотипическую стабильность с течением времени, которые обычно сопровождают более сложные трехмерные (3D) системы. Результаты показывают прикрепление и процентную пластинчатость у TV2D+ в зависимости от плотности посева PHH, а также стабильную функциональность в течение не менее 2 недель в культуре. Для получения успешной культуры в течение длительного времени оценивается диапазон плотности посева PHH. При правильном установлении PHH в TV2D+ организуются в колонии гепатоцитов, экспрессируют печенкоспецифический маркер и поддерживают жизнеспособность, архитектурную целостность и физиологически значимые уровни альбумина и мочевины. Это уникальное сочетание свойств делает систему TV2D+ подходящей моделью печени для различных фармакологических и токсикологических применений.

Введение

Прогнозирование терапевтической безопасности и эффективности является важной частью доклинической разработки лекарственных средств. Тем не менее, традиционные доклинические модели печени in vitro ограничены в своей способности точно имитировать клеточное микроокружение печени in vivo и поддерживать функциональность и морфологию гепатоцитов с течением времени. Существует потребность в моделях, обеспечивающих стабильную метаболическую компетентность в течение более 1 недели, для оценки соединений с медленным оборотом или исследования исходов, связанных с подострым или хроническим воздействием. Тесты in vivo на животных часто не позволяют предсказать эффективность и риск лекарства из-за трансляционных видовых различий в механизмах клиренса печени человека1. Существующие in vitro 2-мерные (2D) модели печени, такие как традиционная монокультура первичных гепатоцитов человека (ПГГ) или сэндвич-культуры, не обладают фенотипической стабильностью и долговечностью в культуре, что приводит к потере ключевой гепатоцеллюлярной функции и архитектурной целостности с течением времени2. Альтернативный метод включает в себя формирование трехмерных (3D) сфероидов гепатоцитов, предлагая более релевантное микроокружение по сравнению с 2D-культурой. Однако этот метод ограничен доступностью сырья, выбором донорной партии ПГХ, воспроизводимостью и потерей жизнеспособности при увеличении размера сфероида 3,4,5,6. Были введены многоклеточные платформы, с помощью которых PHH засеваются с фидерными клетками на пластины фиксированного размера с микроузорами. Несмотря на то, что эти модели могут обеспечить более длительное время культивирования, нечеловеческие питательные клетки, используемые в этих платформах, могут изменить результаты экспериментов и ограничить их применение из-за врожденного фонового вклада в клиренс лекарств и метаболические профили 1,7. Полностью человеческая печеночная система 2D+ (TV2D+) TruVivo, недавно описанная в работе Weaver, et al8, была разработана для устранения некоторых ограничений традиционных, кокультурных и 3D-методов культивирования ПГХ. Непеченочные питающие клетки уменьшают межвидовые различия в метаболизме и продукции паракринов и обеспечивают поддержку, необходимую для первичных гепатоцитов, воспроизводимым и надежным образом, который не может быть обеспечен соответствующими непаренхиматозными клетками печени из одной донорской партии из-за ограничений в экспансии, фенотипе и производительности. Выбранные фидерные клетки могли быть последовательно расширены перед использованием и не нуждались в трансформации или дифференцировке. Как описано Glicklis et al.4 и Khetani et al.5, 3D-модели культивирования, такие как сфероиды гепатоцитов, имеют проблемы с воспроизводимостью из-за вариабельности доноров и поддержания постоянства размера сфероида, что влияет на диффузию питательных веществ в сфероидах размером более 200 мкм, что приводит к снижению жизнеспособности и функциональности. Как и формирование 3D-сфероида, система TV2D+ основана на самосборке PHH; однако образующиеся колонии PHH рассредоточены по поверхности скважины на глубине одной ячейки, а не уплотнены в единый агрегат. Этот метод культивирования может быть полезен для решения проблемы вариабельности доноров, позволяя распределять PHH, культивировать и сохранять основные функциональные возможности при различной плотности посева. Система TV2D+ также может повысить надежность работы с пользователем из-за потерь во время манипуляций или специализированного оборудования, необходимого для выполнения расширенного культивирования в 3D-сфероидах.

Система TV2D+ сочетает в себе стандартную 2D-культуру с долговечностью и фенотипической стабильностью, которые обычно сопровождают 3D-системы. Протокол, описанный в настоящем документе, содержит пошаговые инструкции для пользователей, обладающих базовыми навыками культивирования тканей в лабораториях, оснащенных стандартным оборудованием, таким как шкафы биобезопасности, центрифуги и инкубаторыCO2 . Подробно описан каждый этап процесса, включая подготовку среды, размораживание, нанесение покрытия и обслуживание полученной системы культивирования. Протокол также содержит метод определения основных выходов функциональности гепатоцитов, альбумина и мочевины, а также иммунофлуоресцентный анализ изображений для определения прикрепления PHH для нормализации. При правильном установлении PHH в TV2D+ организуются в колонии гепатоцитов, имитируя нативную морфологию печени, и поддерживают расширенную жизнеспособность, архитектурную целостность и физиологически значимые уровни альбумина и мочевины в течение не менее 2 недель8. Поскольку система может допускать диапазон плотности посева PHH, она может быть полезна для увеличения доступности менее пригодных для пластин партий PHH, которые имеют желаемые характеристики донора. Такое сочетание доступности и функциональности делает TV2D+ подходящей моделью печени для различных фармакологических и токсикологических применений.

Протокол

Этот протокол соответствует рекомендациям комитета по этике Lifenet Health. Рукопись не содержит каких-либо исследований с участием людей или исследований на животных, выполненных кем-либо из авторов. Все клетки были выделены из донорской ткани с полного согласия Lifenet Health для исследовательских целей.

1. Подготовка среды

  1. Разморозьте по одной бутылке в каждой питательной ячейке, добавке A, добавке B и добавке C (см. таблицу материалов) на водяной бане с температурой 37 °C или в течение 16-24 ч при температуре 4 °C.
  2. Весь флакон (10 мл) среды для размораживания питательной ячейки перелейте в коническую пробирку объемом 15 мл или 50 мл.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Размер гранулы ячейки будет легче увидеть, используя коническую пробирку объемом 15 мл.
  3. Добавьте 4,5 мл добавки B и 11 мл добавки A в один флакон гальванического средства (75 мл) (см. Таблицу материалов), чтобы получить полноценную гальваническую среду.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Полная среда для нанесения покрытия имеет концентрацию FBS <5% по объему.
  4. В отдельный флакон добавьте 100 мл питательной среды (см. таблицу материалов), 1 мл добавки С и 14 мл добавки А, чтобы получить полноценную питательную среду.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Полная питательная среда имеет концентрацию FBS <1% v/v
  5. Храните оставшуюся добавку С и добавку А при температуре -20 °C до 2-й недели средней подготовки.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Повторяющиеся циклы замораживания-оттаивания сокращают срок годности добавок. Рекомендуется замораживать-размораживать только один раз.
  6. Перед использованием нагрейте 10 мл питательной среды для размораживания клеток, среды для размораживания гепатоцитов, полной гальванической среды и полной питательной среды в течение 20-30 минут на водяной бане с температурой 37 °C.

2. Размораживание, подсчет и покрытие клеток питания человека (Рисунок 1А)

  1. Культивируйте питательные клетки примерно за 1 ч до посева PHHs. Разморозьте питательные ячейки (см. Таблицу материалов) на водяной бане с температурой 37 °C в течение 1-2 минут.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Избегайте длительного воздействия (например, >2 минуты), контролируя размораживание и вынимая флакон, когда жидкость становится жидкой в криовиале при переворачивании.
  2. Сразу после размораживания поместите ячейки кормушки на лед.
  3. Используя асептические методы, в шкафу биобезопасности (BSC) добавьте свежеразмороженные клетки в 10 мл питательной среды для размораживания клеток.
  4. Используйте пипетку объемом 1000 мкл, чтобы промыть флакон один раз 1 мл суспензии клеточной/талой среды и собрать.
  5. Отжим при 400 x g в течение 4 минут при комнатной температуре (RT).
  6. Осторожно выбросьте надосадочную жидкость, чтобы не повредить клеточную гранулу при пипетировании или вакуум-аспирации. Ресуспендируйте гранулы клеток в 1 мл полной гальванической среды и подсчитайте ячейки питателя.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Питательные клетки можно подсчитывать с помощью акридина оранжевого и йодида пропидия (AOPI) на автоматическом счетчике клеток или трипанового синего с помощью гемацитометра. Количество ячеек может варьироваться в зависимости от технологии и пользователя. Для достижения наилучших результатов подсчитывайте повторяющиеся выборки и придерживайтесь последовательности выбранной методологии.
  7. Разбавьте клеточную суспензию до 100 000 клеток/мл, используя всю гальваническую среду.
  8. Планшет 500 мкл (50 000 клеток) на лунку разбавленной клеточной суспензии на 24-луночный планшет, покрытый коллагеном (см. таблицу материалов).
  9. Встряхните тарелку в движении Север (С) - Юг (Юг) - Восток (Восток) - Запад (Ж), используя возвратно-поступательное движение в направлении Север-Юг 2 раза, а затем такое же движение В-З. Повторите этот протокол встряхивания еще 2 раза, в общей сложности 3 раунда.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Выполняйте встряхивание с умеренной силой, чтобы избежать попадания брызг на крышку пластины, но при этом помогайте в распределении клеток (см. видео).
  10. Инкубируют при 37 °C/5% CO2 в течение 60 мин.
  11. Осмотрите прикрепление фидерных клеток, прежде чем приступать к размораживанию гепатоцитов.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Допустимое крепление фидерной ячейки визуально примерно на 50% сливается.

3. Размораживание, подсчет и покрытие первичных гепатоцитов человека (рис. 1B)

  1. После 30 минут питательной клеточной культуры отфильтруйте предварительно подогретую среду для размораживания гепатоцитов через фильтрующий блок из полиэфирсульфона (PES) размером 0,2 мкм.
  2. Разморозьте PHH на водяной бане с температурой 37 °C в течение 1-2 минут.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Избегайте длительного воздействия (например, >2 минуты), контролируя размораживание и вынимая флакон, когда жидкость становится жидкой в криовиале при переворачивании.
  3. Сразу после размораживания поместите PHH на лед.
  4. В BSC влейте суспензию PHH в среду для размораживания гепатоцитов.
    ПРИМЕЧАНИЕ: По возможности избегайте пипетирования суспензий клеток PHH. Наиболее важно не выполнять пипетирование при переносе размороженных ПГХ из криовиальной среды в размораживающую.
  5. Используйте пипетку на 1000 мкл, чтобы промыть флакон 3–4 раза, аккуратно пипетируя 1 мл суспензии гепатоцитов/оттаивающей среды обратно во флакон и собирая промывку, выливая ее обратно в талую среду.
  6. Укупорите и аккуратно переверните размороженную суспензию PHH 5 раз.
  7. Отжим при 100 x g в течение 8 минут при RT.
  8. Осторожно выбросьте надосадочную жидкость, чтобы не повредить клеточную гранулу при пипетировании или вакуум-аспирации. К стенке конической пробирки добавьте 3 мл полной гальванической среды.
  9. Раскачивайте коническую трубку из стороны в сторону, чтобы снова взвесить гранулу ячейки.
  10. Добавьте дополнительно 5 мл полной гальванической среды к ресуспендированным гепатоцитам.
  11. Подсчитайте PHHs.
    ПРИМЕЧАНИЕ: PHH можно подсчитать с помощью AOPI на автоматическом счетчике клеток или трипанового синего с помощью гемацитометра. Количество ячеек может варьироваться в зависимости от технологии и пользователя. Для достижения наилучших результатов подсчитывайте повторяющиеся выборки и придерживайтесь последовательности выбранной методологии.
  12. Разбавьте клеточную суспензию до желаемой плотности посева (300 000-600 000 PHHs/мл), используя полную гальваническую среду.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Оптимальная плотность посева гепатоцитов может варьироваться от партии к партии. Рекомендуемая густота посева для данной партии будет указана в сертификате анализа (COA). Используйте приведенное ниже уравнение для определения гепатоцитов/мл для 24-луночного планшета.
    figure-protocol-1
  13. Из ячеек питателя с покрытием удалите среду пипеткой или вакуумной аспирацией.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Для обеспечения жизнеспособности питающих ячеек рекомендуется менять не более 3 лунок за один раз.
  14. Сразу же поместите 500 мкл (150 000-300 000 клеток) на лунку разбавленной суспензии гепатоцитов на предварительно покрытую коллагеновую 24-луночную пластину, содержащую фидерные клетки.
  15. Встряхните пластину движением N-S-E-W, используя возвратно-поступательные движения в направлении N-S 2 раза, а затем такое же движение E-W. Повторите этот протокол встряхивания еще 2 раза, в общей сложности 3 раунда.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Выполняйте встряхивание с умеренной силой, чтобы избежать попадания брызг на крышку пластины, но при этом способствуйте распределению клеток.
  16. Инкубируют при 37 °C/5% CO2 в течение 2-4 ч. В течение первых 60 минут культивирования встряхивайте планшет каждые 15 минут движениями N-S-E-W, как показано на шаге 3.15 выше.
  17. После инкубации извлеките планшет из инкубатора и поместите его в BSC.
  18. Встряхните пластину и удалите всю гальваническую среду с помощью пипетирования или вакуумной аспирации.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Для обеспечения жизнеспособности культуры рекомендуется менять не более 3 лунок за один раз.
  19. Сразу же добавьте в каждую лунку 500 мкл предварительно подогретой питательной среды.

4. Техническое обслуживание

  1. Аликвотную и предварительно прогрейте полную питательную среду на водяной бане с температурой 37 °C в течение 20-30 мин. Для одной 24-луночной планшета требуется примерно 13,5 мл среды.
  2. Ежедневно подкармливайте культуры 500 мкл свежей, предварительно подогретой питательной среды.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Для обеспечения жизнеспособности культуры рекомендуется менять не более 3 лунок за один раз.
  3. Готовят свежую полноценную питательную среду каждые 7 дней.

5. Забор культуральных надосадочных проб для измерения альбумина и мочевины

  1. На 7-й, 10-й и 14-й дни соберите 500 мкл среды из желаемой лунки (лунок) для образцов в микроцентрифужную пробирку (пробирки), как показано на рисунке 1C.
  2. Отжим образец (образцы) при 320 x g в течение 10 мин при 4 °C до образования гранул.
  3. Используйте пипетку для переноса надосадочной жидкости образца в новую микроцентрифужную пробирку (пробирки), избегая разрушения гранулы.
  4. Прогоните образцы на анализ альбумина и/или мочевины (см. разделы 10 и 11 соответственно).
    ПРИМЕЧАНИЕ: Образцы можно хранить при температуре от -20 °C до -80 °C в течение 2 недель.

6. День окрашивания I

ВНИМАНИЕ: Фиксирующий буфер содержит параформальдегид. Параформальдегид может вызвать повреждение глаз, раздражение кожи и отравление органов. Работайте в помещении с хорошей вентиляцией и носите соответствующие средства индивидуальной защиты (СИЗ).

  1. После отбора образцов среды на 14-й день добавьте 300 мкл фиксирующего буфера (см. таблицу материалов) в каждую лунку, подлежащую окрашиванию, как показано на рисунке 1C. Окрасьте минимум 2 лунки.
  2. Выдерживают при 4 °С в течение 20-60 мин.
  3. Приготовьте 1x буфер пермеабилизации (см. Таблицу материалов), добавив 5 мл 10-кратного исходного раствора к 45 мл 1x PBS (см. Таблицу материалов).
    ПРИМЕЧАНИЕ: 1-кратный буфер проницаемости можно хранить при температуре 4 ° C в течение 1 месяца.
  4. Промыть 2 раза с 300 мкл 1x буфера проницаемости на льду.
  5. Добавьте 300 мкл первичного антитела цитокератина 18 (см. таблицу материалов), используя разведение 1:1000 в буфере пермеабилизации 1x на льду.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Как минимум, инкубируйте одну лунку с 1-кратным буфером пермеабилизации только для вторичного контроля антител.
  6. Инкубируют 16-24 ч при 4 °С.

7. День окрашивания II

  1. На следующий день первичные антитела удаляют пипеткой или вакуум-аспирацией.
  2. Промыть 2 раза 300 мкл на лунку 1-кратным буфером пермеабилизации на льду.
  3. Добавьте 300 мкл флуоресцентного вторичного антитела (см. таблицу материалов), используя разведение 1:500 в буфере пермеабилизации 1x (включая контроль только вторичной обработки).
    ПРИМЕЧАНИЕ: Избегайте света при использовании флуоресцентных антител.
  4. Выдерживают 30-45 мин при температуре 4 °С в темноте.
  5. Вторичное антитело удаляют пипеткой или вакуум-аспирацией.
  6. Промыть 2 раза 300 мкл на лунку 1-кратным буфером пермеабилизации на льду.
  7. Промыть 1 раз 300 мкл на лунку 1x PBS.
  8. Добавьте 150 мкл монтажной среды 4',6-диамидино-2-фенилиндол (DAPI) (см. таблицу материалов) в каждую лунку и инкубируйте в течение 15 мин при RT в темноте.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Пластину можно завернуть в парапленку и хранить при температуре 4 °C в темноте в течение 1 недели.
  9. Вид под флуоресцентным микроскопом. Сделайте 5 изображений каждого конкретного флуоресцентного канала для каждой лунки с помощью объектива с 10-кратным увеличением (убедитесь, что на одном изображении есть масштабная линейка).
    ПРИМЕЧАНИЕ: DAPI имеет возбуждение/излучение 358 нм/461 нм. Используйте флуоресцентный микроскоп, оснащенный соответствующими фильтрами для обнаружения как DAPI, так и флуорофора вторичных антител.

8. Анализ ImageJ (Рисунок 2)

ПРИМЕЧАНИЕ: Рекомендуется использовать ImageJ версии 1.52a или выше.

  1. Откройте изображение, содержащее масштабную линейку, в ImageJ. Щелкните значок Straight Line (Прямая линия ) и нарисуйте линию точной длины масштабной линейки [Рисунок 2 (1)]
    ПРИМЕЧАНИЕ: При необходимости нажмите значок «Увеличить стекло », чтобы увеличить или уменьшить масштаб.
  2. Перейдите на вкладку «Анализ». Выделите и нажмите кнопку Задать масштаб.
  3. Измените Известное расстояние на расстояние масштабной линейки. Измените Единицы длины на единицы масштабной линейки. Глобально примените настройки, установив флажок Global. Нажмите кнопку ОК , чтобы задать масштаб.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Как только эта настройка будет применена, каждое открытое изображение будет показывать рассчитанную площадь поля зрения в единицах, введенных пользователем.
  4. Откройте в ImageJ изображение, доступное только для DAPI. Перейдите на вкладку «Процесс » и выделите «Вычесть фон». Удаляйте фон по 50 пикселей за раз, пока незапятнанные участки не станут черными.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Если изображение не содержит фона, этот шаг не требуется.
  5. Перейдите на вкладку «Изображение » и выделите «Тип». Нажмите на 8-бит , чтобы сделать изображение в оттенках серого [Рисунок 2 (2)].
  6. Установите пороговое значение изображения вручную или автоматически, чтобы включить все частицы DAPI (будьте осторожны, чтобы вручную не превысить пороговое значение) [Рисунок 2 (3)]. Перейдите на вкладку «Изображение » и выделите «Настроить». Нажмите кнопку Пороговое значение. Нажмите кнопку Применить , когда закончите.
  7. Перейдите на вкладку «Процесс » и выделите «Двоичный». Щелкните Водораздел.
  8. Перейдите на вкладку Analyze (Анализ) и выделите /click Analyze Particles (Анализ частиц) [Рисунок 2 (4)]. Установите Размер на 5-Бесконечность и Круглость на 0.00-1.00. На раскрывающейся вкладке Показать выберите Структуры. Убедитесь, что установлены флажки "Показать результаты", "Суммировать" и "Включить отверстия". Нажмите кнопку ОК.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Желаемый диапазон частиц может быть скорректирован, если пороговое значение дает фоновые пиксели.
  9. Запишите результат подсчета как TOTAL DAPI.
  10. Откройте объединенное изображение Cytokeratin 18/DAPI в ImageJ.
  11. Используйте значок Multi-Point [Рисунок 2 (5)], чтобы вручную подсчитать все неокрашенные частицы DAPI для цитокератина 18.
  12. Запишите результат как ЯЧЕЙКИ ФИДЕРА. Используйте приведенное ниже уравнение для определения гепатоцита DAPI.
    DAPI гепатоцитов = Общий DAPI - Фидерная ячейка DAPI

9. Количественное определение общего количества прикрепленных гепатоцитов и процента прикрепления (пластинчатость)

  1. Создайте масштабный коэффициент для 24-луночной области культивирования, используя приведенное ниже уравнение. Измерения поля зрения можно найти в верхней части каждого открытого изображения [Рисунок 2 (2), зеленая рамка].
    figure-protocol-2
  2. Рассчитайте общее количество прикрепленных гепатоцитов, используя приведенное ниже уравнение.
    Прикрепленные гепатоциты = масштабный фактор × гепатоцитах DAPI
  3. Рассчитайте процент прикрепления гепатоцитов, используя приведенное ниже уравнение.
    figure-protocol-3

10. Альбуминовый анализ

  1. Измеряют продукцию альбумина с помощью сэндвич-иммуноферментного анализа (ИФА) (см. таблицу материалов) на образцах, разбавленных в соотношении 1:200.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Для обеспечения точности пользователь подтверждает, что образцы попадают в стандартный линейный диапазон кривой. Указанный набор содержит все материалы и инструкции для проведения анализа.
  2. Нормализуйте концентрацию образца в прикрепленных гепатоцитах, используя приведенное ниже уравнение.
    figure-protocol-4

11. Анализ мочевины

ВНИМАНИЕ: Кислотный реагент азота мочевины крови (АМК) содержит серную кислоту. Концентрация серной кислоты в кислотном реагенте BUN считается коррозионной. Не принимайте внутрь. Работайте в помещении с хорошей вентиляцией и носите соответствующие СИЗ.

  1. Синтез мочевины измеряют с помощью модифицированного метода диацетилмоноксима (см. таблицу материалов).
  2. Разбавьте 53,3 мкл мочевины 75 мг/дл в 346,7 мкл полной питательной среды, чтобы получить стандарт #1 (100 мкг/мл)
  3. Маркируйте пробирки 2-8 и используйте последовательное разведение 1:2 для получения стандартов анализа мочевины (Таблица 1).
  4. Добавьте 10 мкл образца или стандарта в лунки 96-луночной планшета с черными стенками и прозрачным дном (см. таблицу материалов).
  5. Добавьте 150 мкл реагента BUN в каждую лунку, содержащую образец. Приготовьте реактив BUN, смешав 1/3 цветного реагента BUN с 2/3 кислотного реактива BUN. Используйте приведенное ниже уравнение для помощи в расчетах.
    figure-protocol-5
    Цветной реагент BUN (мл) = Общее количество необходимых реагентов BUN × 0,333
    Кислотный реагент BUN (мл) = общее количество необходимых реагентов BUN × 0,667
  6. Инкубируйте планшет в течение 90 минут в духовке или инкубаторе при температуре 60 °C.
  7. Считывание абсорбции пластины сразу при 540 нм и 650 нм.
  8. Создайте стандартную кривую, вычитая пустое и фоновое поглощение (650 нм) из всех образцов и стандартов. Создание линии наилучшего соответствия с помощью линейного регрессионного анализа.
  9. Определите неизвестную концентрацию образца по стандартной кривой.
  10. Нормализуйте концентрацию образца к прикрепленным гепатоцитам, используя приведенную ниже формулу.
    figure-protocol-6

Результаты

Общий метод гальванического покрытия, культивирования и тестирования базовой функциональности системы печеночной культуры включает в себя общие методы и анализ первичных клеточных культур, как показано на рисунке 1. Прикрепление гепатоцитов и процент пластинчатости были рассчитаны на 14-й день с использованием анализа ImageJ, по крайней мере, пяти изображений цитокератина 18 и окрашивания DAPI на лунку (рис. 2). Репрезентативные изображения ПГХ, культивируемых с помощью фидерных клеток, показаны на рисунке 3. Различная плотность посева в печени показала визуальные различия в слиянии в зависимости от плотности посева и сохранила типичную печеночную, кубовидную морфологию в течение 14 дней культивирования. Были получены изображения донорских партий гепатоцитов А и В для каждой исследуемой плотности посева (рис. 4А). Средний процент пластинчатости донора Б (89,04% ± 3,99%, 198 552 ± 49 885 PHH) был выше, чем у донора A (66,08% ± 6,67%, 146 128 ± 33 063 PHH) при всех используемых плотностях посева (рис. 4B). Донор А имел значительно более высокий процент пластинчатости при использовании 150 000 PHH на лунку (76,07% ± 12,87%) по сравнению с 250 000-300 000 PHH на лунку (62,75% ± 9,64%). У донора Б не было выявлено существенных различий в проценте пластинчатости гепатоцитов. Донор Б имел самую низкую пластинчатость гепатоцитов (85,78% ± 13,25%) при самой высокой плотности посева, 300 000 PHHs/лунку. Как и в случае с донором А, посев донора Б при 150 000 PHHs/лунку имел самый высокий процент пластинируемости гепатоцитов (94,75% ± 15,07%).

Продукцию альбумина и синтез мочевины измеряли в трех временных точках в течение 14-дневного периода культивирования и нормализовали к рассчитанным прикрепленным гепатоцитам. В целом, у донора А наблюдалась повышенная продукция альбумина по сравнению с донором В (41,32 ± 4,58 мкг альб/сут/106 ПГХ против 34,66 ± 10,03 мкг альб/сут/10,6 ПГГ) (рис. 5). Доноры А и Б имели самую высокую продукцию альбумина при посеве гепатоцитов на уровне 150 000 ПГГ/лунка, 45,91 ± 5,96 мкг ПГ/сут/106 ПГ и 48,67 ± 20,44 мкг ПГ/сут/106 ПГГ соответственно. Существенных различий в продукции альбумина в плотности посева не наблюдалось. Как отмечают Baudy et al.3, желательно, чтобы микрофизиологические системы печени поддерживали стабильную продукцию альбумина и синтез мочевины с изменениями менее чем на 50% в течение 14 дней посева. Коэффициент вариации (CV) рассчитывали путем деления среднего значения на стандартное отклонение для 7-го, 10-го и 14-го дней. Все образцы были запущены в двух экземплярах. CV для выхода альбумина за 14-дневный период культивирования при 150 000 PHHs/лунка составила 12,24% для донора А и 37,97% для донора B, что ниже желаемого критерия 50%. Высокая вариабельность продукции альбумина наблюдалась как у донора А, так и у донора Б при посеве в дозах 250 000 и 300 000 PHHs/лунку. При такой плотности посева у обоих доноров наблюдается резкое снижение продукции альбумина между 7, 10 и 14 днями культивирования (CV-донор А — 22,49% и донор Б — 45,07%).

Синтез мочевины донора В (95,09 ± 18,91 мкг мочевины/сут/106) был увеличен по сравнению с донором А (64,92 ± 4,66 мкг мочевины/сут/106 ПГХ) при усреднении данных по партиям 7, 10 и 14 ПГХ (рис. 6). Донор B (113,49 ± 37,34 мкг мочевины/сут/106 PHHs) и донор A (69,12 ± 17,06 мкг мочевины/сут/106 PHHs) имели наибольший синтез мочевины за 14-дневный период посева при плотности 150 000 PHHs/лунку и 200 000 PHH/лунку соответственно. Обе партии-донора имели самый низкий выход карбамида и самый высокий CV – 300 000 PHH на скважину. Существенных различий в синтезе мочевины в плотности посева выявлено не было. Самый низкий CV для синтеза мочевины у донора А наблюдался при культивировании 250 000 PPHs/лунка (23,11%) и 200 000 PHHs/лунка для донора B (28,26%). Как показывают эти результаты, оптимальная плотность посева для данной партии PHH зависит от желаемого уровня слияния во время анализа и характера измеряемых результатов; Более высокая плотность посева не всегда может коррелировать с более высоким сигналом или динамическим диапазоном.

figure-results-1
Рисунок 1: Блок-схема гальванического, культивируемого и функционального тестирования гепатоцитов с фидерными клетками. (A) Питательные ячейки размораживают в специальной среде для размораживания (см. Таблицу материалов), повторно суспендируют в полной гальванической среде (см. Таблицу материалов) и подсчитывают ячейки. Клетки разводят, покрывают и инкубируют в течение 60 мин при 37 °C/5% CO2. (Б) Гепатоциты размораживают в специальной размораживающей среде (см. Таблицу материалов), ресуспендируют в полной гальванической среде, и клетки подсчитывают. Гепатоциты разбавляют и покрывают питательными клетками. Клетки инкубируют в течение 2-4 ч при 37 °C/5%CO2, встряхивая в движении N-S-E-W каждые 15 минут в течение первых 60 минут культивирования. Гальваническая среда заменяется предварительно нагретой полной питательной средой для поддержания культуры (см. таблицу материалов). Подкармливают культуры ежедневно. (C) На 7-й, 10-й и 14-й дни отбирают пробы среды для определения альбумина и мочевины. После забора образцов на 14-й день клетки фиксируют и окрашивают антителами к цитокератину 18 (см. таблицу материалов) через 16-24 ч при 4 °C. Далее их инкубируют в соответствующем вторичном антителе, промывают и монтируют с помощью DAPI (см. таблицу материалов) для захвата и анализа изображений. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этого рисунка.

figure-results-2
Рисунок 2: Анализ изображений с помощью программного обеспечения ImageJ. Обработка отснятых изображений ImageJ. Шаг 1: ко всем изображениям применяется шкала на основе масштабной линейки микроскопа. Шаг 2: тип изображения изменен. Шаг 3: применяется пороговый предел для отбора частиц DAPI. Шаг 4: выполняется анализ частиц и записывается количество. Шаг 5: чтобы определить количество прикрепленных ячеек фидера, объединенное изображение подсчитывается с помощью многоточечного инструмента. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этого рисунка.

figure-results-3
Рисунок 3: Морфология различной плотности посева печени, культивируемой с фидерными клетками. Репрезентативные изображения на 7-й и 14-й день ПГХ, культивируемых с фидерными клетками (50 000 клеток/лунку) при плотности посева печени 150 000, 200 000, 250 000 и 300 000 ПГХ/лунки. Изображения были сделаны с помощью 10-кратного объектива на инвертированном фазово-контрастном микроскопе. Масштабная линейка = 100 мкм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

figure-results-4
Рисунок 4: Флуоресцентная иммуноцитохимия различных плотностей посева печени, культивируемых с фидерными клетками. (A) Репрезентативные изображения окрашивания цитокератином 18 (красный) на 14-й день при плотности посева печени 150 000, 200 000, 250 000 и 300 000 PHHs/лунки. Две лунки для каждой плотности посева устанавливали на 30 мин при 4 °С. Лунки инкубировали 16-24 ч при 4°С с первичными антителами в соотношении 1:1000. Вторичное антитело использовали в дозе 1:500 в течение 30 мин при 4 °C в темноте. Ядерный краситель DAPI (синий) добавляли в скважины в течение 15 мин при комнатной температуре. Изображения были сделаны с помощью 10-кратного объектива на инвертированном флуоресцентном микроскопе. Масштабная линейка = 100 мкм. (B) Расчет прикрепленных гепатоцитов и процентной пластинируемости различных плотностей посева печени, рассчитанных с помощью ImageJ. *p ≤ 0,05, в процентах пластинчатости для 200 000, 250 000 и 300 000 PHHs/лунка. Столбцы погрешности представляют собой стандартное отклонение (n ≥ 5 изображений на условие). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этого рисунка.

figure-results-5
Рисунок 5: Продукция альбумина гепатоцитами, культивируемыми с фидерными клетками. Производство альбумина из плотности посева в печени при 150 000, 200 000, 250 000 и 300 000 PHHs/скважина. Столбцы представляют собой 14-дневное среднее количество микрограммов альбумина в день, нормализованное к общему количеству прикрепленных гепатоцитов. Строка представляет CV между 7, 10 и 14 днями. Столбцы погрешности представляют собой стандартное отклонение (n ≥ 2 лунки на условие с репликациями). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этого рисунка.

figure-results-6
Рисунок 6: Синтез мочевины гепатоцитов, культивируемых с фидерными клетками. Синтез карбамида из плотности посева печени при 150 000, 200 000, 250 000 и 300 000 PHHs/скважина. Столбцы представляют собой среднее значение мкг мочевины в день за 14 дней, нормализованное к общему количеству прикрепленных гепатоцитов. Линия представляет %CV между 7, 10 и 14 днями. Столбцы погрешности представляют собой стандартное отклонение (n ≥ 2 лунки на условие с репликациями). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этого рисунка.

Стандарт (S) #Концентрация (мкг/мл)Раствор мочевины (мкл)Полная культура (мкл)
110053.3
75 мг/дл		346.7
250100
(Решение S1)		100
325100
(Решение S2)		100
412.5100
(Решение S3)		100
56.26100
(Решение S4)		100
63.125100
(Решение S5)		100
71.5625100
(Решение S6)		100
Пустой00100

Таблица 1: Подготовка стандартных образцов карбамида. Используя 75 мг/дл исходной мочевины, приготовьте раствор мочевины 100 мкг/мл. Кратно распределите предложенные объемы, чтобы достичь конечной концентрации для стандартной кривой.

Обсуждение

Описанная система культивирования печени может быть установлена в лабораториях, оснащенных стандартным оборудованием для культивирования тканей. Система, состоящая из ПГХ, культивируемых с помощью фидерных клеток, позволяет пользователю культивировать ПГГ в течение не менее двух недель со стабильным производством альбумина и синтезом мочевины. Из-за вариабельности партий доноров PHH для использования в системе рекомендуются только предварительно проверенные и квалифицированные PHH. Несмотря на то, что количество прикрепленных PHH варьируется в зависимости от донорской партии и плотности посева, относительная пластинчатость остается одинаковой в пределах каждой донорской партии. Несмотря на то, что рекомендуется рекомендуемая плотность посева, приведенные выше данные свидетельствуют о том, что плотность засева гепатоцитов может быть скорректирована для различных экспериментальных нужд; однако следует отметить, что посев большего количества PHH может не обеспечить более высоких или более стабильных функциональных результатов. Анализ оцененных партий PHH показал самые низкие CV для производства альбумина и синтеза карбамида при более низкой плотности посева 150 000 PHHs/скважина и 200 000 PHH/скважина; Однако существенных различий между альбумином и мочевиной при любой плотности посева обнаружено не было. Более высокая плотность посева 250 000 PHH на лунку и 300 000 PHH на лунку свидетельствует о большем снижении альбумина и мочевины в течение 14-дневного периода культивирования. Присущая донору вариабельность пластинчатости может влиять на стабильность продукции альбумина и синтеза мочевины при 250 000 ПГХ/лунку и 300 000 ПГХ/лунку для исследованных донорских партий. Как и в случае с крупными сфероидами гепатоцитов, пересев PHH в системе TV2D+ может иметь негативные последствия для долгосрочного культивирования и функциональности PHH.

Все этапы размораживания, нанесения покрытия и технического обслуживания имеют решающее значение для успешной культуры и создания данных; Однако есть несколько распространенных ошибок, которых неопытные пользователи могут избежать. PHH очень восприимчивы к повреждениям, вызванным колебаниями температуры, напряжением сдвига и воздействием воздуха 9,10. При размораживании ПГХ следует соблюдать меры предосторожности, чтобы избежать длительных сроков размораживания и чрезмерного пипетирования. Использование метода ручной заливки, таймера и немедленного переноса с водяной бани на лед уменьшит эти распространенные ошибки, которые могут повлиять на жизнеспособность и пластинчатость PHH. Кроме того, в связи с тем, что проблемы с цепочками поставок становятся все более распространенными, может быть трудно получить пластины с коллагеновым покрытием. Для решения этой проблемы можно использовать ручное покрытие планшетов, обработанных культурой тканей, коммерческими растворами коллагена типа I (5-10 мкг/см2); Тем не менее, для оптимальной производительности и консистенции рекомендуется использовать предварительно покрытые коллагеновые пластины. В процессе перехода от культивирования только фидерных клеток к введению ПГХ крайне важно не допустить высыхания слоя фидерных клеток. Никогда не допускайте попадания воздуха на ячейки питателя. Любое время воздействия воздуха может привести к ухудшению качества слоя питательных клеток, что негативно скажется на долгосрочном культивировании ПГХ. Рекомендуется оставлять небольшое количество остаточной среды между сменами среды. В некоторых случаях PHH могут содержать избыток мусора от изоляции, что может затруднить изучение морфологии. Чтобы решить эту проблему, встряхните пластину перед заменой среды и используйте вакуумную аспирацию. Наконец, при смене среды осторожно аспирируйте отработанную среду, стараясь не повредить культивируемые клетки. Нанесите пипетку свежего среднего объема вниз по краю лунки, чтобы избежать пипетирования непосредственно на клеточный слой. Пользователь также должен избегать воздействия воздуха при каждой смене среды, используя рекомендуемую замену 3 лунок (разделы 3 и 4). Следует также отметить, что ежедневная смена среды идеальна, но не обязательна.

Несмотря на то, что флуоресцентные микроскопы стали обычным явлением в большинстве лабораторий, программное обеспечение, необходимое для выполнения специфического анализа изображений, может повлечь за собой дополнительные расходы. ImageJ можно скачать бесплатно, что делает его легкодоступным инструментом анализа изображений. Шаги, описанные в протоколе, обеспечивают основу, которую пользователю может потребоваться оптимизировать, в частности, анализ частиц при окрашивании DAPI; однако, при отсутствии возможности флуоресцентной визуализации, значения прикрепления PHH на 14-й день указываются в сертификатах анализа для конкретной партии. Плохое пороговое значение приведет к нетточному подсчету частиц DAPI. Также рекомендуется проверить площадь поверхности отдельных частиц DAPI перед установкой исключения по размеру. Этого можно достичь, используя значок овала [Рисунок 2 (1), значок круга под вкладкой Редактировать ] и нарисовав круг, охватывающий частицу DAPI. Вкладка Analyze (Анализ) может быть использована для измерения площади выбранной частицы DAPI. Конкретные измерения можно выбрать с помощью Set Measurements на вкладке Analyze (Анализ) [шаг 8.9 и Рисунок 2 (4)].

Современные методы культивирования PHH включают использование покрытий, таких как коллаген-I, для увеличения прикрепления клеток в традиционной 2-мерноймонокультуре11 или наложение внеклеточного матрикса, такого как мышиный Matrigel, метод, обычно называемый «сэндвич-культурой»12,13,14,15. Несмотря на то, что метод сэндвич-культивирования со временем улучшает морфологию и полярность PHH по сравнению с традиционной монокультурой, обоим подходам по-прежнему не хватает долгосрочной фенотипической стабильности в культуре для большинства пластинчатых партий PHH. Другим методом, используемым для культивирования PHH, является создание 3D-сфероидов; однако, как ранее указывали Glicklis et al.4, могут возникнуть технические проблемы с воспроизводимостью размера сфероида из-за вариабельности донора. В попытке создать более физиологически релевантную модель печени были разработаны многоклеточные модели. Как описано Ware et al.7, использование микропаттернов, мышиных фибробластов и первичных эндотелиальных клеток синусоидальной формы печени человека, окруженных PHH, позволило увеличить время культивирования in vitro. Тем не менее, микропаттернирование может быть сложным и трудоемким процессом, и нечеловеческие клетки-кормушки могут вносить свой вклад в фон метаболических сигналов, ограничивая полезность этой платформы в определенных приложениях. Использование различных непеченочных клеток, включая дермальные фибробласты человека и крысы и эндотелиальные клетки аорты крупного рогатого скота, в качестве фидерных клеток для совместного культивирования гепатоцитов показало секрецию альбумина и образование плотных соединений, сходных с кокультурами фидерных клеток печеночного происхождения16. Тем не менее, механизм взаимодействия между непеченочными клетками, питающимися TV2D+, и PHH в культуре нуждается в дальнейшем исследовании, чтобы лучше понять влияние на стабильность и функциональность PHH в этой системе. Культуральная система, ранее описанная Weaver et al.8, может успешно культивировать PHH в печеночных колониях в течение 42 дней, образуя обширные желчно-каналикулярные сети. ПГХ, культивируемые в этой системе, поддерживали ключевые функции печени, включая активность цитохрома 1A2, 2B6 и 3A4 и активность фермента на основе уридина-5'-дифосфо-глюкуронозилтрансферазы (UGT), образование метаболитов I и II фазы, продукцию альбумина и синтез мочевины в течение не менее 22 дней in vitro без матригеля. Эта система культивирования дает стабильные, физиологически значимые результаты, которые легко адаптируются к любой лаборатории для фармакологического и токсикологического применения. Несмотря на то, что ключевые функции PHH сохраняются в системе TV2D+, прямых сравнений с 3D-моделью сфероида не проводилось; тем не менее, будущая работа по сравнению одних и тех же доноров PHH между системами культивирования окажется ценной для определения ограничений и преимуществ обоих методов.

Потенциальные применения TV2D+ включают оценку метаболического клиренса и лекарственного взаимодействия соединений с низким оборотом, лекарственно-индуцированное повреждение печени и оценку риска агрохимикатов. Точное прогнозирование печеночного клиренса новых и перспективных лекарственных средств зависит от стабильного и пролонгированного посева ПГХ с сохранением ключевой гепатоцеллюлярной функциональности, что особенно сложно при оценке соединений с низкой оборачиваемостью. Кроме того, оценка риска и химически индуцированная токсичность для печени являются серьезными проблемами для здоровья, а существующие модели не обеспечивают долгосрочную стабильность и функциональность культуры для точной оценки потенциальной хронической химической токсичности, которая может быть вторичной по отношению к острому воздействию. Здоровые и больные ПГХ, культивируемые в TV2D+, показали характерные различия в функции и липидном расположении, которые сохранялись с течением времени17. Эти исследования подтверждают, что TV2D+ является многообещающим инструментом для различных фармакологических и токсикологических применений.

Раскрытие информации

JO, LW, EG, EL, SP и JW являются сотрудниками LifeNet Health, некоммерческой организации, которая производит TV2D+.

Благодарности

Мы хотели бы поблагодарить Меллиссу Келлер и Венди Хетман за помощь в рецензировании рукописей и рисунков.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
0,2 & микро; m PES  Фильтрующий блок Thermo Fisher Scientific 565-0020Предпочтения пользователя 
Конические пробирки 15 мл или 50 млThermo Fisher Scientific 352196 или 352070Пользовательские настройки 
Alexa Fluor 555, козий анти-кроликThermo Fisher Scientific A-21428Другие вторичные антитела могут работать
Антитела к цитокератину 18 abcamab24561Необходимо использовать тот же разбавитель
AOPI Nexcelom CS2-0106-5mLИспользуется для подсчета на целлометре 
Шкаф биобезопасности Labconoco3460801Пользовательские предпочтения 
Черностенный, прозрачное дно, 96-луночная пластина Thermo Fisher Scientific 165305Пользовательские настройки 
ЦентрифугаThermo Fisher Scientific Sorvall X4RСпособен к скорости до 400 x g
Пластина с коллагеновым покрытием, 24-луночныйGreiner Bio-One662950Коллагеновое покрытие из крысиного хвоста
Подсчет слайдовNexcelom CHT4-SD100-002Используется для подсчета на целлометре 
Питательная среда LifeNet Здоровье Культуральная добавка MED-TCCM
 LifeNet Здоровье MED-TCSC
DAPI Thermo Fisher Scientific 00-4959-52Содержит монтажный материал
DPBS (-Ca, -Mg)Thermo Fisher Scientific 14190250Пользовательские настройки 
Кормовая клеточная добавка LifeNet Здоровье MED-TCSA
Питательная среда для размораживания ячеекLifeNet Health MED-FCTM
Флуоресцентный микроскоп ZeissAxioObserver Z1Оснащен фильтрами для конкретных пользователей 
Среда для размораживания гепатоцитовLifeNet Health MED-HHTM4C-50ML
Набор для иммуноферментного анализа альбумина человека abcamab108788Необходимо при использовании одного и того же разведения
Человеческие питательные клеткиLifeNet Health PHFC24
Увлажненный инкубатор VWR97025-842способен к 5% CO2 
IC Фиксирующий буферThermo Fisher Scientific 00-8222-49Также можно использовать параформальдегид, 10% формалина
ImageJNational Insitute of Health Версия 1.52a 1,52А или выше 
Инвертированный фазово-контрастный микроскоп OlympusCK40-F100Пользовательские настройки 
Микроцентрифужные пробиркиVWR20170-022Пользовательские настройки 
Микропипетки (различные размеры)США Scientific Настройки пользователя ErgoOne 
Буфер для пермеабилизации (10x)Thermo Fisher Scientific 00-8333-56Другие буферы для проникновения могут работать
Считыватель пластин BMG LabtechCLARIOstarСпособен считывать абсорбцию 450-640 нм
Гальванический материал LifeNet Здоровье Добавка для покрытия MED-TCPM
 LifeNet Здоровье MED-TCSB
Первичные гепатоциты человека LifeNet Здоровье Разные Каталожный номер может отличаться в зависимости от номера партии
Вторичное антитело Thermo Fisher Scientific A-21428Предпочтения пользователя 
Серологический контроллер пипетокGilson F110120Предпочтения пользователя 
Бутылка для хранения 100– 500 мл VWR76311-770Пользовательские настройки 
Тест на азот мочевины (BUN) Stanbio0580-250
Водяная баняPolyScienceWBE05Возможность использования при температуре 37 градусов; С

Ссылки

  1. Khetani, S. R., Bhatia, S. N. Microscale culture of human liver cells for drug development. Nature Biotechnology. 26 (1), 120-126 (2008).
  2. Swift, B., Pfeifer, N. D., Brouwer, K. L. Sandwich-cultured hepatocytes: an in vitro model to evaluate hepatobiliary transporter-based drug interactions and hepatotoxicity. Drug Metabolism Reviews. 42 (3), 446-471 (2010).
  3. Baudy, A. R., et al. Liver microphysiological systems development guidelines for safety risk assessment in the pharmaceutical industry. Lab on a Chip. 20 (2), 215-225 (2020).
  4. Glicklis, R., Merchuk, J. C., Cohen, S. Modeling mass transfer in hepatocyte spheroids via cell viability, spheroid size, and hepatocellular functions. Biotechnology and Bioengineering. 86 (6), 672-680 (2004).
  5. Khetani, S. R., et al. Microengineered liver tissues for drug testing. Journal of Laboratory Automation. 20 (3), 216-250 (2015).
  6. Monckton, C. P., Brown, G. E., Khetani, S. R. Latest impact of engineered human liver platforms on drug development. APL Bioengineering. 5 (3), 031506(2021).
  7. Ware, B. R., Durham, M. J., Monckton, C. P., Khetani, S. R. A cell culture platform to maintain long-term phenotype of primary human hepatocytes and endothelial cells. Cellular and Molecular Gastroenterology and Hepatology. 5 (3), 187-207 (2018).
  8. Weaver, J. R., et al. The morphology, functionality, and longevity of a novel all human hepatic cell-based tri-culture system. Toxicology In Vitro. 86, 105504(2023).
  9. Li, W., et al. Matrix stiffness and shear stresses modulate hepatocyte functions in a fibrotic liver sinusoidal model. American Journal of Physiology, Gastrointestinal and Liver Physiology. 320 (3), G272-G282 (2021).
  10. Thompson, S. M., et al. Heat stress induced cell death mechanisms in hepatocytes and hepatocellular carcinoma: in vitro and in vivo study. Lasers in Surgery and Medicine. 46 (4), 290-301 (2014).
  11. Mooney, D., et al. Switching from differentiation to growth in hepatocytes: control by extracellular matrix. Journal of Cellular Physiology. 151 (3), 497-505 (1992).
  12. Berthiaume, F., Moghe, P. V., Toner, M., Yarmush, M. L. Effect of extracellular matrix topology on cell structure, function, and physiological responsiveness: hepatocytes cultured in a sandwich configuration. The FASEB Journal. 10 (13), 1471-1484 (1996).
  13. Hamilton, G. A., et al. Regulation of cell morphology and cytochrome P450 expression in human hepatocytes by extracellular matrix and cell-cell interactions. Cell and Tissue Research. 306 (1), 85-99 (2001).
  14. Orkin, R. W., et al. A murine tumor producing a matrix of basement membrane. Journal of Experimental Medicine. 145 (1), 204-220 (1977).
  15. Sivaraman, A., et al. A microscale in vitro physiological model of the liver: predictive screens for drug metabolism and enzyme induction. Current Drug Metabolism. 6 (6), 569-591 (2005).
  16. Goulet, F., Normand, C., Morin, O. Cellular interactions promote tissue-specific function, biomatrix deposition and junctional communication of primary cultured hepatocytes. Hepatology. 8 (5), 1010-1018 (1988).
  17. Characterization of primary human hepatocytes from diseased and healthy livers in an all-human cell based triculture system. The Toxicologist, a Supplement to Toxicological Sciences. Odanga, J. J., Breathwaite, E. K., Presnel, S., LeCluyse, E. L., Weaver, J. R. 62nd Annual Meeting & ToxExpo, , Nashville, TN. 4283(2023).

Перепечатки и разрешения

Теги

Первичные гепатоциты человекапосев гепатоцитовдолгосрочное культивированиефенотипическая стабильностьфидерные клеткипланшеты с коллагеновым покрытиемплотность посеваэкспрессия печеночных маркеров
Общечеловеческая система культивирования печени для разработки лекарств
Связаться с нами
Порекомендовать библиотеке

Конфиденциальность

Условия использования

Политики

© 2026 MyJoVE Corporation. Все права защищены.