Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.

Методическая статья

Использование изображений ex vivo в реальном времени для исследования деления и движения клеток во время обновления зубов мыши

2.5K просмотров

⸱

DOI:

10.3791/66020

⸱

27 октября 2023 г.

 ,  ,  ,  , 
1School of Dentistry, University of California Los Angeles, 2The Institute of Biomedical and Oral Research, Faculty of Dental Medicine, Hebrew University of Jerusalem, 3Molecular Biology Institute, University of California Los Angeles

* These authors contributed equally

В этой статье

Краткое содержание

Визуализация ex vivo в реальном времени является мощным методом изучения динамических процессов клеточных движений и взаимодействий в живых тканях. Здесь мы представляем протокол, который реализует двухфотонную микроскопию для отслеживания эпителиальных клеток зубов в культивируемых цельных резцах взрослой мыши.

Аннотация

Непрерывно растущий резец мыши становится модельной системой с высокой проходимостью для исследования регуляции взрослых эпителиальных и мезенхимальных стволовых клеток и регенерации зубов. Эти популяции-предшественники активно делятся, перемещаются и дифференцируются, поддерживая гомеостаз тканей и оперативно регенерируя утраченные клетки. Однако традиционные анализы с использованием фиксированных срезов тканей не могли охватить динамические процессы клеточных движений и взаимодействий, что ограничивало наши возможности по изучению их регуляции. В данной статье описывается протокол сохранения целых резцов мыши в системе культивирования эксплантов и отслеживания эпителиальных клеток зубов в реальном времени с помощью многофотонной таймлапс-микроскопии. Этот метод дополняет наш существующий инструментарий для стоматологических исследований и позволяет исследователям получать пространственно-временную информацию о поведении и организации клеток в живой ткани. Мы ожидаем, что эта методология поможет исследователям в дальнейшем изучении механизмов, контролирующих динамические клеточные процессы, происходящие как во время обновления зубов, так и во время регенерации.

Введение

За последние два десятилетия резцы мыши стали бесценной платформой для исследования принципов регуляции взрослых стволовых клеток и регенерации зубов 1,2. Резец мыши постоянно растет и обновляется на протяжении всей жизни животного. Это достигается за счет поддержания как эпителиальных, так и мезенхимальных стволовых клеток, которые могут самообновляться и дифференцироваться в различные типы клеток зуба 1,2. В то время как зубные эпителиальные стволовые клетки дают начало амелобластам, которые секретируют эмалевый матрикс, зубные мезенхимальные стволовые клетки дают начало одонтобластам, цементобластам и фибробластам, которые образуют дентин, цемент и периодонтальную связку соответственно 3,4,5,6. Это постоянное поступление новых клеток поддерживает гомеостаз тканей и позволяет заменять старые клетки, которые теряются из-за жевательного износа или травм 7,8. Таким образом, выяснение клеточных и молекулярных механизмов, регулирующих поддержание и дифференцировку стоматологических стволовых клеток, занимает центральное место в понимании регенерации зубов, области, представляющей растущий интерес.

Анатомически большая часть резцов взрослой мыши заключена в челюстную кость. В то время как режущий край зуба обнажен, апикальный конец резца входит в лунку и прочно прикрепляется к окружающей кости через периодонтальные связки и соединительные ткани (рис. 1A, B). Апикальный конец резца также является областью роста зуба и поддерживает стволовые и прогениторные клетки зуба как в эпителиальном слое, так и в мезенхимальной пульпе 9,10,11,12,13. В частности, стволовые клетки зубного эпителия поддерживаются на луковичном конце эпителия, известном как апикальная почка, также называемая губной шейной петлей (рис. 1C). Подобно эпителию кишечника и эпидермису, обновление эпителия в резце в основном поддерживается активно циркулирующими стволовыми клетками и их высокопролиферативными промежуточными потомками, называемыми транзитно-амплифицирующими клетками14, 15, 16, 17, расположенными во внутренней части шейной петли. Тем не менее, содержит ли эпителий резца и использует ли он покоящиеся стволовые клетки во время регенерации, еще предстоит определить. Напротив, в апикальной пульпе были идентифицированы как активные, так и неподвижные зубные мезенхимальные стволовые клетки, а неподвижные стволовые клетки функционируют как резервная популяция, которая активируется во время восстановления травмы13,18.

Многие из открытий в области биологии обновления и регенерации резцов мышей являются результатом гистологических исследований, в ходе которых образцы получают в различных временных точках, фиксируют, обрабатывают, а затем разрезают на микронные тонкие срезы вдоль определенной плоскости. Благодаря детальному анализу гистологических срезов различных мышиных моделей, которые позволяют отслеживать родословную или генетические возмущения, ученые определили клеточные линии различных популяций предшественников, а также генетические и сигнальные пути, которые контролируют гомеостаз резцов и восстановление повреждений 19,20,21. Однако статические двумерные (2D) изображения невитальных клеток в разрезах не могут охватить весь спектр клеточного поведения и пространственных организаций в живой ткани, таких как изменения формы клеток, движения и клеточная кинетика. Обнаружение и измерение этих быстрых клеточных изменений, которые происходят в масштабе времени, неразрешимом с помощью срезов тканей, требуют другой стратегии. Более того, получение такой информации также имеет решающее значение для понимания того, как зубные клетки взаимодействуют друг с другом, реагируют на различные сигнальные стимулы и самоорганизуются для поддержания тканевых структур и функций.

Появление четырехмерной (4D) визуализации глубоких тканей с использованием двухфотонной микроскопии22, технологии, которая объединяет три пространственных измерения с временным разрешением, преодолевает ограничения, присущие гистологическому анализу, позволяя проводить пространственно-временное исследование культивируемых тканевых эксплантов, органоидов или даже тканей in situ 23,24,25,26 . Например, 4D-визуализация развивающегося эпителия зуба в реальном времени выявила пространственно-временные закономерности деления и миграции клеток, которые координируют рост тканей, формирование сигнального центра и морфогенез зубного эпителия 27,28,29,30,31,32. В резце взрослой мыши 4D-визуализация недавно была адаптирована для изучения клеточного поведения во время восстановления повреждений зубного эпителия. Визуализация в реальном времени показала, что промежуточные клетки слоя в надбазальном слое могут быть непосредственно преобразованы в амелобласты в базальном слое для регенерации поврежденного эпителия, что бросает вызов традиционной парадигме восстановления повреждений эпителия15.

Здесь мы опишем вскрытие, культивирование и визуализацию резца взрослой мыши, уделяя особое внимание эпителиальным клеткам в губной шейной петле (рис. 1). Этот метод сохраняет жизнеспособность зубных клеток в течение более 12 часов и позволяет отслеживать флуоресцентно меченные клетки в реальном времени с разрешением одной клетки. Этот подход позволяет исследовать движение и миграцию клеток, а также динамические изменения формы клеток и ориентации деления в нормальных условиях культивирования или в ответ на генетические, физические и химические возмущения.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

Все мыши содержались в свободных от патогенов животных в Калифорнийском университете в Лос-Анджелесе (UCLA) или Еврейском университете в Иерусалиме (HUJI). Все эксперименты с участием мышей проводились в соответствии с правилами и протоколами, утвержденными соответствующим Комитетом по уходу за животными и их использованию (IACUC) (ARC-2019-013; Калифорнийский университет в Лос-Анджелесе) или (MD-23-17184-3; HUJI). Общий рабочий процесс экспериментальных этапов показан на рисунке 2A. См. Таблицу материалов для получения подробной информации, относящейся ко всем инструментам, реагентам и материалам, используемым в этом протоколе.

1. Приготовление растворов и гелей

  1. Среда для препарирования: Приготовьте свежий DMEM/F12 с 0,5% глюкозы и держите его теплым при температуре 37 °C до тех пор, пока он не понадобится на этапе 2.4.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Мы используем DMEM/F12 без фенольного красителя для уменьшения автофлуоресценции во время визуализации в реальном времени.
  2. 1x питательная среда: Приготовьте свежую среду, используя 50% DMEM/F12, 50% крысиную сыворотку, 1x заменитель глютамина, 1x заменимые аминокислоты MEM, 1% глюкозы, 0,1 мг/мл L-аскорбиновой кислоты и 0,5% пенициллина-стрептомицина. Держите его в тепле при температуре 37 °C до тех пор, пока это не понадобится на шаге 5.5. Эта среда используется для культивирования эксплантов резцов во время визуализации в реальном времени.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Сыворотка крыс должна быть высокого качества и специально подготовлена для культивирования целых тканей исследователями или из коммерческого источника. В частности, кровь должна быть центрифугирована (в течение 5 мин при 1200 × г при комнатной температуре) до того, как начнет формироваться свертывание. После центрифугирования образовавшийся фибриновый сгусток следует отжать и отбросить33.
  3. Культуральный гель: Целью геля является иммобилизация образцов во время визуализации и готовится в свежем виде.
    1. Приготовьте 2% гель в DMEM/F12, растворив 200 мг агарозы с низкой температурой плавления в 10 мл DMEM/F12 с помощью микроволновой печи. Храните 2% гель при температуре 37 °C.
    2. Сделайте 2x питательную среду (без DMEM/F12), смешав 50% крысиной сыворотки, 1x заменитель глютамина, 1x заменимые аминокислоты MEM, 1% глюкозы, 0,1 мг/мл L-аскорбиновой кислоты и 0,5% пенициллина-стрептомицина. Нагрейте питательную среду 2x (без DMEM/F12) до 37 °C.
    3. Приготовьте 1% гель для закваскивания, смешав равные объемы 2% геля и 2-кратной питательной среды (без DMEM/F12). Храните 1% гель для закваски при температуре 37 °C до тех пор, пока это не потребуется на шаге 5.1.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Перед смешиванием убедитесь, что все растворы теплые, чтобы избежать гелеобразования. Мы обнаружили, что 1% гель подходит для культивирования резцов взрослой мыши. Процентное содержание геля должно быть определено опытным путем, если необходимо культивировать другие ткани.

2. Извлечение жвалы взрослых мышей

  1. Усыпляйте мышей в желаемом возрасте, используя стандартные процедуры, одобренные IACUC.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Здесь мы используем асфиксиюСО2 с последующим вывихом шейки матки. Правила эвтаназии животных могут отличаться в разных регионах. Исследователи должны получить необходимое одобрение учреждения перед проведением экспериментов и обеспечить соблюдение местных правил ухода за животными.
  2. Продезинфицируйте мышь, используя 70% этанол.
  3. Обезглавьте мышь и извлеките левую и правую жвалы.
    1. Положите мышь на живот, затем используйте промышленную бритву #9 с одним лезвием, чтобы разрезать область шеи и отделить голову мыши от остальной части тела.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Если необходимо также собрать ткани из области глотки или шеи, обезглавливание не следует выполнять, и можно сразу перейти к шагу 2.3.2.
    2. Переверните мышь так, чтобы ее брюшная сторона была обращена вверх, а мандибулы были легко доступны.
    3. Зафиксируйте голову животного, осторожно удерживая ее между большим и указательным пальцами.
    4. Лезвием бритвы сделайте средний сагиттальный разрез, который разрезает кожу нижней челюсти от нижней губы к декольте.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Хирургическое лезвие #15 также может быть использовано для выполнения разреза и последующих рассечений (шаги 2.3.6-2.3.9).
    5. Когда разрез сделан, раздвиньте разрезанную кожу большим и указательным пальцами, чтобы обнажить мышцы и челюстную кость под ней.
    6. Используйте лезвие бритвы, чтобы разрезать жевательные мышцы на щечной стороне нижней челюсти, так что внешняя сторона левой и правой получелюстей теперь свободна от мышечных прикреплений.
    7. Разрежьте подъязычные мышцы вдоль внутренней стороны нижней челюсти, чтобы удалить там мышечные прикрепления.
    8. Сделайте еще один разрез на нижнечелюстном симфизе, который соединяет две гемимандибулы. После разрезания нижняя челюсть будет разделена на левую и правую половины.
    9. Вклините лезвие бритвы между мыщелком нижней челюсти и височно-нижнечелюстным суставом и осторожно отделите полумыщелк от остальной части головы.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Мы сочли полезным одновременно осторожно потянуть за резец во время резки. Следует соблюдать осторожность, чтобы не сломать нижнюю челюсть и не повредить мягкие ткани внутри.
  4. Немедленно перенесите рассеченные нижние челюсти в чашку Петри с предварительно подогретой средой для диссекции (шаг 1.1) и удалите оставшиеся мышечные ткани с помощью хирургического лезвия #15.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Хранение образцов в холодных средах замедляет активность клеток, что приводит к задержке или даже неудачному восстановлению определенных клеточных активностей, таких как пролиферация или движение клеток, во время визуализации в реальном времени.

3. Изоляция целых резцов мыши

ПРИМЕЧАНИЕ: Дальнейшая изоляция резца производится под диссекционным микроскопом с ярким полем.

  1. Визуально определите овальную область нижней челюсти, которая покрывает гнездо резца и содержит апикальную часть резца.
  2. Расположите нижнюю челюсть так, чтобы внутренняя (лингвальная) поверхность была обращена вверх.
  3. Удерживая нижнюю челюсть на месте с помощью пары зазубренных щипцов, создайте окно в овальной области, сбрив вышележащую мембранную кость хирургическим лезвием #15 в направлении от мыщелка к коренным зубам. При этом обнажаются мягкие ткани верхушечного резца на внутренней поверхности.
  4. Переверните нижнюю челюсть так, чтобы внешняя (щечная) поверхность была обращена вверх.
  5. Создайте окно в овальной области на внешней нижней челюсти, как описано в шаге 3.3, и кончиком скальпеля удалите все оставшиеся костные фрагменты по краю. Убедитесь, что апикальный конец зуба виден с обеих сторон.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Избегайте чрезмерного давления во время бритья костей, чтобы предотвратить повреждение подлежащих мягких тканей.
  6. Систематически вырезайте кости, окружающие резец, чтобы изолировать весь зуб.
    1. Сделайте чистый срез в плоскости, которая непосредственно примыкает к верхушечному резцу, чтобы сначала удалить мыщелковый отросток.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Будьте осторожны, чтобы не порезать резец.
    2. Сделайте второй разрез чуть кзади от 3-го моляра, но дорсально от резца, не повреждая зуб. При этом удаляется кость, которая включает в себя венечный отросток.
    3. Последовательно разрезают от кончика углового отростка по направлению к резцу, чтобы постепенно ступенчато удалить вентральную нижнюю челюсть.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Эпителий зуба и связанные с ним ткани пародонта часто прилипают к кости и легко отрываются при одновременном разрезании большой части вентральной кости. Чтобы отделить кость от мягких тканей резца, можно вставить скальпель (или пару острых незазубренных щипцов) между двумя тканями на апикальном конце резца и осторожно сдвинуть инструмент вперед.
    4. Отрежьте альвеолярную кость с коренными зубами и все оставшиеся кости, которые все еще прикреплены к резцу.
    5. Теперь весь резец изолирован. Перенесите полностью рассеченный резец в чашку с чистой теплой средой для рассечения (шаг 1.1).
  7. Повторите шаги 3.2-3.6, чтобы при необходимости изолировать дополнительные резцы.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Верхнечелюстные/верхние резцы мыши также содержат взрослые стволовые клетки и могут быть использованы для изучения регенерации зубов34. Исследователи в области стоматологии обычно сосредотачиваются на нижних резцах, потому что они более доступны и могут быть легко рассечены, чем верхние резцы. Различия между клетками-предшественниками нижнечелюстного и верхнечелюстного резцов еще предстоит определить.

4. Удаление тканей пародонта для обнажения эпителиальной шейной петли резцов

  1. Когда весь резец лежит на язычной стороне и удерживает зуб на месте с помощью пары зубчатых щипцов, используйте пару тонких щипцов #5, чтобы начать подворачивать ткани пародонта, покрывающие апикальный резец и область шейной петли.
  2. Осторожно отделите ткань пародонта от апикальной почки так, чтобы латеральная сторона шейной петли (или другие интересующие области) стала видна под эндоскопом.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Следует соблюдать осторожность, чтобы не повредить эпителий зуба или не отделить его от мезенхимы. Если резец имеет флуоресцентные сигналы в интересующей области, и имеется флуоресцентный диссекционный микроскоп, флуоресцентные сигналы могут быть использованы для различения типов тканей и облегчения диссекции. Важно эффективно выполнять секции 2-4, чтобы образцы можно было быстро перенести в питательную среду и надлежащим образом поддерживать их с помощью культивирования эксплантов (см. ниже).

5. Встраивание тканей для эксплантированной культуры

  1. Добавьте 500 мкл теплого незатвердевшего культурального геля в лунку в 24-луночном планшете и быстро перенесите рассеченные целые резцы в лунку. Покрутите пластину несколько раз, чтобы промыть резцы.
  2. Добавьте 400 мкл теплого незатвердевшего геля для культивирования в чашку для культивирования и перенесите промытые резцы в чашку.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Мы используем коммерчески доступную чашку для культивирования, совместимую с установкой перфузии. Альтернативные варианты см. в шаге 6.4.
  3. Расположите резец так, чтобы область шейной петли (или другие интересующие области) оказалась в центре чашки (рис. 2A, B) и отрегулируйте наклон апикального резца для желаемой плоскости изображения.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Ориентация тканей должна быть выполнена быстро, до полного гелеобразования.
  4. После того, как гель затвердеет, используйте тонкие щипцы, чтобы удалить гель поверх интересующей области, чтобы она не была покрыта гелем.
  5. Добавьте достаточный объем теплой питательной среды, медленно прижимая ее пипеткой к краю чашки, чтобы она просто покрыла образец (~150 мкл).
  6. Переместите эксплантированную культуру в инкубатор клеточных культур с температурой 37 °C, чтобы дать ткани возможность оседать и адаптироваться к условиям культуры в течение 1 ч.

6. Таймлапс-микроскопия эксплантов резцов

ПРИМЕЧАНИЕ: В этом эксперименте мы использовали вертикальный микроскоп, оснащенный 25-кратным объективом для погружения в воду с числовой апертурой 1. Как правило, погружная линза с высокой числовой апертурой лучше всего подходит для визуализации глубоких тканей.

  1. Включите микроскоп и двухфотонный лазер.
  2. Прикрепите чашку для культивирования к адаптеру столика и установите сверху кольцо адаптера для перфузии (Рисунок 2C).
  3. Подключите адаптер стола к регулятору температуры, настроенному на поддержание культуры при температуре 37 °C.
  4. Подсоедините входное и выходное кольцо переходного кольца к микроперфузионному насосу и начните перфузию питательной среды со скоростью перфузии, установленной на 20 на насосе. При этом образуется медленный поток (~5 мл/ч) питательной среды над образцами (рис. 2C).
    ПРИМЕЧАНИЕ: См. Таблицу материалов для получения подробной информации о системе для поддержания ткани в стабильно контролируемой среде. Можно использовать и другие системы. Также можно использовать комбинацию нагревательной пластины 37 °C и самодельной чашки для перфузионной культуры (дополнительный рисунок S1) с входом и выходом, подключенными к шприцевым насосам.
  5. Поместите барьерное кольцо атмосферного контроля (ACBR) поверх переходного кольца и опустите объектив через ACBR, чтобы установить контакт с питательной средой (рис. 2D).
  6. Настройте длину волны лазера на 920 нм, чтобы визуализировать сигналы GFP и красной флуоресценции (например, tdTomato).
  7. Находите образцы с помощью окуляров, а затем с помощью программного обеспечения микроскопа.
  8. Настройте Z-стеки, многопозиционные изображения и временные интервалы с помощью программного обеспечения. Чтобы следовать этому протоколу, используйте размер z-шага 4 мкм и временной интервал 5 минут в течение 14 часов.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Мы обнаружили, что интервал времени, превышающий 5 минут, часто недостаточен для того, чтобы зафиксировать плавные движения и деления клеток.
  9. Запустите таймлапс-съемку.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Положение образца может измениться в течение первого часа, и может потребоваться дальнейшая регулировка.
  10. Сохраняйте файлы для последующей обработки и анализа данных.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

Апикальная область резцов взрослой мыши заключена в нижнюю челюсть (рис. 1) и, следовательно, недоступна непосредственно для визуализации и отслеживания клеток-предшественников, находящихся в области роста. Поэтому мы разработали метод извлечения всего резца из челюстной кости и поддержания его в системе культивирования эксплантов для двухфотонной таймлапс-микроскопии (рис. 2). Здесь мы описываем репрезентативные результаты, которые отражают динамический процесс...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

Визуализация живых тканей является важным методом, который позволяет нам изучать динамические процессы и поведение клеток, когда они сохраняются в своей нишевойсреде. В идеале визуализация в реальном времени выполняется in vivo с высоким пространственно-временным разрешением. Тем не менее, визуализация органов млекопитающих in vivo может быть сложной задачей из-за недоступности тканей, оптической непрозрачности и трудностей с иммобилизацией животного или органа в течение длительн...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

У авторов нет конфликта интересов, который можно было бы раскрыть.

Благодарности

Выражаем признательность Лаборатории передовой световой микроскопии/спектроскопии Калифорнийского университета в Лос-Анджелесе и Центру передового опыта Leica Microsystems при Калифорнийском институте наносистем (RRID:SCR_022789) за предоставление двухфотонной микроскопии. AS был поддержан ISF 604-21 Израильским научным фондом. JH поддержали R03DE030205 и R01DE030471 из NIH/NIDCR. AS и JH также получили грант 2021007 от Американо-израильского двунационального научного фонда (BSF).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
24 скважина, планшет для культивирования тканей с плоским дномOlympus пластик25-107
25x HC IRAPO motCORR цель для погружения в водуLeica11507704
Аскорбиновая кислота (витамин С)Acros Organics352685000
D-(+)-глюкозой bioxtra Система Sigma AldrichG7528
Delta T Bioptechs0420-4Включая контроль температуры, чашки для культивирования и установку для перфузии
Диссекционный микроскоп- LEICA S9ELeicaLED300 SLI
DMEM/F12Thermo Scientific11039047Базальные среды без фенола красного
Хирургическое лезвие Feather (#15)Feather72044-15
Тонкие щипцыF.S.T11252-23
Глутамакс Заменитель глютаминаThermo Scientific35050-061
Leica SP8-DIVE оснащен 25X HC IRAPO motCORR для погружения в воду Leican/a
Низкоплавкий агарозныйNuSieve50080
заменимые аминокислоты (100x)Thermo Scientific11140-050
пенициллин– стрептомицинThermo Scientific1514012210 000 ЕД/мл;
Чашка ПетриGen Clone32-107G90 мм 
Сыворотка для крысValley BiomedicalAS3061SCОбработано для визуализации в реальном времени
Лезвие бритвы #9VWR55411-050
Ручка для скальпеляF.S.T10003-12
НожницыF.S.T37133
Зубчатые щипцыF.S.T11000-13
Пружинные ножницыF.S.T91500-09

Ссылки

  1. Yu, T., Volponi, A. A., Babb, R., An, Z., Sharpe, P. T. Stem cells in tooth development, growth, repair, and regeneration. Current Topics in Developmental Biology. 115, 187-212 (2015).
  2. Jing, J., et al. Rodent incisor as a model to study mesenchymal stem cells in tissue homeostasis and repair. Frontiers in Dental Medicine. 3, 1068494(2022).
  3. Harada, H., et al. Localization of putative stem cells in dental epithelium and their association with Notch and Fgf signaling. Journal of Cell Biology. 147 (1), 105-120 (1999).
  4. Warshawsky, H., Smith, C. E. Morphological classification of rat incisor ameloblasts. The Anatomical Record. 179 (4), 423-445 (1974).
  5. Lekic, P., McCulloch, C. A. Periodontal ligament cell population: the central role of fibroblasts in creating a unique tissue. The Anatomical Record. 245 (2), 327-341 (1996).
  6. Takahashi, A., et al. Autocrine regulation of mesenchymal progenitor cell fates orchestrates tooth eruption. Proceedings of the National Academy of Sciences. 116 (2), 575-580 (2019).
  7. Ness, A. R. Eruption rates of impeded and unimpeded mandibular incisors of the adult laboratory mouse. Archives of Oral Biology. 10 (3), 439-451 (1965).
  8. Smith, C. E., Warshawsky, H. Cellular renewal in the enamel organ and the odontoblast layer of the rat incisor as followed by radioautography using 3H-thymidine. The Anatomical Record. 183 (4), 523-561 (1975).
  9. Seidel, K., et al. Hedgehog signaling regulates the generation of ameloblast progenitors in the continuously growing mouse incisor. Development. 137 (22), Cambridge, England. 3753-3761 (2010).
  10. Juuri, E., et al. Sox2+ stem cells contribute to all epithelial lineages of the tooth via Sfrp5+ progenitors. Developmental Cell. 23 (2), 317-328 (2012).
  11. Biehs, B., et al. BMI1 represses Ink4a/Arf and Hox genes to regulate stem cells in the rodent incisor. Nature Cell Biology. 15, 846-852 (2013).
  12. Feng, J., Mantesso, A., De Bari, C., Nishiyama, A., Sharpe, P. T. Dual origin of mesenchymal stem cells contributing to organ growth and repair. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108 (16), 6503-6508 (2011).
  13. Zhao, H., et al. Secretion of shh by a neurovascular bundle niche supports mesenchymal stem cell homeostasis in the adult mouse incisor. Cell Stem Cell. 14 (2), 160-173 (2014).
  14. Li, L., Clevers, H. Coexistence of quiescent and active adult stem cells in mammals. Science. 327 (5965), 542-545 (2010).
  15. Sharir, A., et al. A large pool of actively cycling progenitors orchestrates self-renewal and injury repair of an ectodermal appendage. Nature Cell Biology. 21 (9), 1102-1112 (2019).
  16. Hu, J. K. -H., et al. An FAK-YAP-mTOR signaling axis regulates stem cell-based tissue renewal in mice. Cell Stem Cell. 21 (1), 91-106 (2017).
  17. Yu, F., Li, F., Zheng, L., Ye, L. Epigenetic controls of Sonic hedgehog guarantee fidelity of epithelial adult stem cells trajectory in regeneration. Science Advances. 8 (29), (2022).
  18. An, Z., et al. A quiescent cell population replenishes mesenchymal stem cells to drive accelerated growth in mouse incisors. Nature Communications. 9 (1), 378(2018).
  19. Balic, A., Thesleff, I. Tissue interactions regulating tooth development and renewal. Current Topics in Developmental Biology. 115, 157-186 (2015).
  20. Yu, T., Klein, O. D. Molecular and cellular mechanisms of tooth development, homeostasis and repair. Development. 147 (2), (2020).
  21. Krivanek, J., Buchtova, M., Fried, K., Adameyko, I. Plasticity of dental cell types in development, regeneration, and evolution. Journal of Dental Research. 102 (6), 589-598 (2023).
  22. Helmchen, F., Denk, W. Deep tissue two-photon microscopy. Nature Methods. 2 (12), 932-940 (2005).
  23. Cetera, M., Leybova, L., Joyce, B., Devenport, D. Counter-rotational cell flows drive morphological and cell fate asymmetries in mammalian hair follicles. Nature Cell Biology. 20 (5), 541-552 (2018).
  24. Held, M., Santeramo, I., Wilm, B., Murray, P., Lévy, R. Ex vivo live cell tracking in kidney organoids using light sheet fluorescence microscopy. PLoS ONE. 13 (7), 0199918(2018).
  25. Mesa, K. R., et al. Homeostatic epidermal stem cell self-renewal is driven by local differentiation. Cell Stem Cell. 23 (5), 677-686 (2018).
  26. Mogollón, I., Ahtiainen, L. Live tissue imaging sheds light on cell level events during ectodermal organ development. Frontiers in Physiology. 11, 818(2020).
  27. Prochazka, J., et al. Migration of founder epithelial cells drives proper molar tooth positioning and morphogenesis. Developmental Cell. 35 (6), 713-724 (2015).
  28. Morita, R., et al. Coordination of cellular dynamics contributes to tooth epithelium deformations. PLOS ONE. 11 (9), 0161336(2016).
  29. Ahtiainen, L., Uski, I., Thesleff, I., Mikkola, M. L. Early epithelial signaling center governs tooth budding morphogenesis. The Journal of Cell Biology. 214 (6), 753-767 (2016).
  30. Panousopoulou, E., Green, J. B. A. Invagination of ectodermal placodes is driven by cell intercalation-mediated contraction of the suprabasal tissue canopy. PLoS biology. 14 (3), 1002405(2016).
  31. Mogollón, I., Moustakas-Verho, J. E., Niittykoski, M., Ahtiainen, L. The initiation knot is a signaling center required for molar tooth development. Development. 148 (9), (2021).
  32. Kim, R., et al. Early perturbation of Wnt signaling reveals patterning and invagination-evagination control points in molar tooth development. Development. 148 (14), 199685(2021).
  33. Takahashi, M., Makino, S., Kikkawa, T., Osumi, N. Preparation of rat serum suitable for mammalian whole embryo culture. Journal of Visualized Experiments JoVE. (90), e51969(2014).
  34. Katsuragi, Y., et al. Bcl11b transcription factor plays a role in the maintenance of the ameloblast-progenitors in mouse adult maxillary incisors. Mechanisms of Development. 130 (9-10), 482-492 (2013).
  35. Dassule, H. R., Lewis, P., Bei, M., Maas, R., McMahon, A. P. Sonic hedgehog regulates growth and morphogenesis of the tooth. Development. 127 (22), 4775-4785 (2000).
  36. Belteki, G., et al. Conditional and inducible transgene expression in mice through the combinatorial use of Cre-mediated recombination and tetracycline induction. Nucleic Acids Research. 33 (5), 51(2005).
  37. Tumbar, T., et al. Defining the epithelial stem cell niche in skin. Science. 303 (5656), 359-363 (2004).
  38. Muzumdar, M. D., Tasic, B., Miyamichi, K., Li, L., Luo, L. A global double-fluorescent Cre reporter mouse. Genesis. 45 (9), 593-605 (2007).
  39. Kimura, H., Cook, P. R. Kinetics of core histones in living human cells. The Journal of Cell Biology. 153 (7), 1341-1354 (2001).
  40. Kanda, T., Sullivan, K. F., Wahl, G. M. Histone-GFP fusion protein enables sensitive analysis of chromosome dynamics in living mammalian cells. Current Biology: CB. 8 (7), 377-385 (1998).
  41. Huang, Q., et al. The frontier of live tissue imaging across space and time. Cell Stem Cell. 28 (4), 603-622 (2021).
  42. Skylaki, S., Hilsenbeck, O., Schroeder, T. Challenges in long-term imaging and quantification of single-cell dynamics. Nature Biotechnology. 34 (11), 1137-1144 (2016).
  43. Knoblich, J. A. Mechanisms of asymmetric stem cell division. Cell. 132 (4), 583-597 (2008).
  44. Li, S., et al. Overview of the reporter genes and reporter mouse models. Animal Models and Experimental. 1 (1), 29-35 (2018).
  45. Mort, R. L., et al. Fucci2a: a bicistronic cell cycle reporter that allows Cre mediated tissue specific expression in mice. Cell Cycle. 13 (17), 2681-2696 (2014).
  46. Krivanek, J., et al. Dental cell type atlas reveals stem and differentiated cell types in mouse and human teeth. Nature Communications. 11 (1), 4816(2020).
  47. Dailey, M. E., Marrs, G. S., Kurpius, D. Maintaining live cells and tissue slices in the imaging setup. Cold Spring Harbor protocols. 2011 (4), (2011).
  48. Gorczyca, W., Bruno, S., Darzynkiewicz, R., Gong, J., Darzynkiewicz, Z. DNA strand breaks occurring during apoptosis - their early insitu detection by the terminal deoxynucleotidyl transferase and nick translation assays and prevention by serine protease inhibitors. International Journal of Oncology. 1 (6), 639-648 (1992).
  49. Aguilera-Castrejon, A., et al. Ex utero mouse embryogenesis from pre-gastrulation to late organogenesis. Nature. 593 (7857), 119-124 (2021).
  50. Wale, P. L., Gardner, D. K. Time-lapse analysis of mouse embryo development in oxygen gradients. Reproductive Biomedicine Online. 21 (3), 402-410 (2010).
  51. Tse, H. M., Gardner, G., Dominguez-Bendala, J., Fraker, C. A. The importance of proper oxygenation in 3D culture. Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 9, 634403(2021).
  52. Spinelli, J. B., et al. Fumarate is a terminal electron acceptor in the mammalian electron transport chain. Science. 374 (6572), 1227-1237 (2021).
  53. Johnson, S., Rabinovitch, P. Ex-vivo imaging of excised tissue using vital dyes and confocal microscopy. Current Protocols in Cytometry. , CHAPTER, Unit9.39 (2012).
  54. Combs, C. A., Shroff, H. Fluorescence microscopy: a concise guide to current imaging methods. Current Protocols in Neuroscience. 79, 1-25 (2017).
  55. McCoy, R. J., O'Brien, F. J. Influence of shear stress in perfusion bioreactor cultures for the development of three-dimensional bone tissue constructs: a review. Tissue Engineering. Part B, Reviews. 16 (6), 587-601 (2010).
  56. Chen, K. D., et al. Mechanotransduction in response to shear stress. Roles of receptor tyrosine kinases, integrins, and Shc. The Journal of Biological Chemistry. 274 (26), 18393-18400 (1999).
  57. Seddiqi, H., et al. Inlet flow rate of perfusion bioreactors affects fluid flow dynamics, but not oxygen concentration in 3D-printed scaffolds for bone tissue engineering: Computational analysis and experimental validation. Computers in Biology and Medicine. 124, 103826(2020).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Теги

Визуализация ex vivoрезцы мыширегуляция стволовых клетоккультура эксплантамультифотонная микроскопияотслеживание деления клетокэпителиальные клетки-предшественникирегенерация зубовтаймлапс-микроскопия
Использование изображений ex vivo в реальном времени для исследования деления и движения клеток во время обновления зубов мыши
Связаться с нами
Порекомендовать библиотеке

Конфиденциальность

Условия использования

Политики

© 2026 MyJoVE Corporation. Все права защищены.