Модель ex vivo перитонеального метастазирования рака яичников с использованием сальника человека

Краткое содержание

Этот протокол описывает создание трехмерной (3D) ex vivo модели взаимодействия раковых клеток и сальника. Модель обеспечивает платформу для выяснения проопухолевых механизмов в жировой нише и для тестирования новых методов лечения.

Аннотация

Рак яичников является самым смертоносным гинекологическим злокачественным новообразованием. Сальник играет ключевую роль в обеспечении поддерживающего микроокружения для метастатических раковых клеток яичников, а также иммуномодулирующих сигналов, которые обеспечивают устойчивость опухоли. Тем не менее, у нас есть ограниченные модели, которые точно имитируют взаимодействие между клетками рака яичников и тканями, богатыми жировыми отложениями. Для более глубокого понимания клеточных и молекулярных механизмов, с помощью которых сальник обеспечивает проопухолевое микроокружение, мы разработали уникальную 3D-модель взаимодействия раковых клеток и сальников ex vivo . Используя сальник человека, мы можем выращивать раковые клетки яичников в этой богатой жиром микросреде и контролировать факторы, ответственные за рост опухоли и иммунную регуляцию. В дополнение к предоставлению платформы для изучения этого богатого жировой тканью опухолевого микроокружения, модель обеспечивает отличную платформу для разработки и оценки новых терапевтических подходов к воздействию на метастатические раковые клетки в этой нише. Предложенная модель проста в создании, недорога и применима к трансляционным исследованиям.

Введение

Рак яичников является самым смертоносным гинекологическим злокачественным новообразованием во всем мире¹. Риск развития этого вида рака в течение жизни составляет примерно 1 к 70, а средний возраст постановки диагноза составляет⁶³ года. Первичные злокачественные опухоли яичников гистологически классифицируются как эпителиальные или неэпителиальные. Эпителиальный рак яичников (ЭОК) составляет более 90% опухолей, а наиболее распространенным подтипом является серозная карцинома высокой степени злокачественности (HGSC), на долю которой приходится примерно 70%-80% ЭОК. В настоящее время не существует эффективных методов скрининга для раннего выявления заболевания. Таким образом, большинству пациентов диагноз ставится на поздней стадии (т.е. на III или IV стадии Международной федерации гинекологии и акушерства (FIGO) после того, как рак распространился по всей брюшной полости^.

Стандартным лечением первой линии является циторедуктивная операция по удалению всех видимых макроскопических заболеваний с последующей адъювантной химиотерапией на основе платины для уничтожения любого остаточного микроскопического заболевания. Несмотря на то, что за последние два десятилетия в лечении рака яичников было достигнуто много успехов, примерно у 70% пациенток с прогрессирующим заболеванием в течение 3^{лет после начала} лечения наступает рецидив. Учитывая общий неблагоприятный прогноз для этих пациентов, текущие и будущие трансляционные исследования в EOC направлены на выявление биомаркеров для раннего выявления, предотвращения метастазирования, совершенствования существующих методов лечения для уклонения от резистентности и разработки новых персонализированных методов лечения рака.

Генерализованное метастазирование в брюшной полости и связанная с ним химиорезистентность являются двумя основными ограничениями для улучшения лечения пациенток с раком яичников ^4,5. Сальник, жировая структура, похожая на фартук, которая свисает с желудка над кишечником, является основным местом метастазирования рака яичников ^6,7. Было показано, что в дополнение к своей функции физического барьера сальник обладает регенеративными и ангиогенными способностями и обладает иммунной активностью, которая в совокупности способствует васкуляризации, ускоряет заживление ран и ограничивает инфекцию⁸. Он содержит высокую концентрацию стволовых клеток, которые могут дифференцироваться в различные типы клеток и могут помочь восстановить поврежденные ткани. Сальник может воспаляться в ответ на травму или инфекцию, что вызывает миграцию иммунных клеток к месту повреждения⁹. Эти иммунные клетки высвобождают факторы роста и другие молекулы, которые способствуют восстановлению и регенерации поврежденных тканей. Иммунные клетки, такие как макрофаги, лимфоциты и плазматические клетки, локализующиеся в сальнике, представляют собой структуры, известные как «млечные пятна», которые отвечают за обнаружение и атаку патогенов и регулирование перитонеального иммунитета. Также было показано, что сальник играет роль в индуцировании иммунной толерантности¹⁰, которая представляет собой способность иммунной системы переносить аутоантигены и не атаковать здоровые ткани. Тем не менее, та же самая иммунная активность также участвует в патологических реакциях, таких как рост опухолей яичников, метастазирование и ускользание от иммунного надзора ^9,11. Предыдущие исследования, проведенные в нашей лаборатории и других лабораториях, продемонстрировали уникальную и активную роль микроокружения жировой ткани в ингибировании противоопухолевых иммунных реакций и в приобретении химиорезистентности^12,13,14. К сожалению, мы располагаем ограниченной информацией о клеточных и молекулярных механизмах, с помощью которых сальник обеспечивает проопухолевое микроокружение.

Чтобы лучше понять взаимодействие между раковыми клетками и сальником, была разработана 3D-система культивирования, состоящая из клеток рака яичников человека и эксплантов сальника, полученных от пациентов. Протокол, описанный здесь, представляет собой новую модель перитонеального карциноматоза ex vivo . Эта модель имитирует естественное развитие онкогенеза рака яичников в этой богатой жировой тканью ткани. Предложенная модель проста в создании, недорога и потенциально применима для трансляционных исследований рака яичников.

Протокол

Следующий протокол исследования был рассмотрен и одобрен Институциональным наблюдательным советом Государственного университета Уэйна (IRB). Перед операцией от всех пациентов было получено информированное согласие. На рисунке 1 показаны три основных шага этого протокола.

1. Подготовка тканей сальника человека

1. Приготовьте питательную среду для сальника (DMEM/F12 + 10% фетальной бычьей сыворотки + 1% пенициллин-стрептомицин) и храните при 4 °C. Передайте 30-40 мл этой среды в стерильную коническую пробирку объемом 50 мл или контейнер для хирургических образцов.
2. Получение хирургических образцов при биопсии сальника или операции по оментэктомии. Стерильный образец погружают в питательную среду сальника сразу после удаления в операционной. Если рабочий процесс не позволяет это сделать, поместите образец в питательную среду для сальника как можно скорее. Перенесите образец, поместив его на лед, и храните при температуре 4 °C до обработки.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Размер взятого образца сальника определяет количество обрабатываемой ткани.
3. Обработайте образец сальника в течение 1-2 ч после сбора с помощью ламинарного колпака. Убедитесь, что все материалы и инструменты стерильны или стерилизована.
4. Извлеките сальник из контейнера для сбора и переложите его в культуральную чашку диаметром 100 мм. Погрузите образец в 1x фосфатно-солевой буфер (1x PBS) и осторожно промойте образец, чтобы удалить сгустки крови или мусор.
5. Разрежьте ткань на кусочки (0,5 см х 0,5 см или 100-200 мг; Рисунок 2А) с помощью небольших хирургических ножниц или скальпеля 10-15 мм. Используйте небольшие хирургические щипцы, чтобы манипулировать тканью и избежать раздавливания сальника. Если для хирургического удаления образца сальника использовалось энергетическое устройство, избегайте использования деформированной ткани у запечатанного края.
6. Поместите каждый кусочек разрезанного сальника в отдельные лунки 24-луночного культурального планшета и заполните лунки 500 мкл питательной среды сальника или до объема, достаточного для покрытия сальника, не позволяя кусочку сальника всплывать над дном лунки (рисунок 2B).
7. Хранят кусочки сальника в свежей питательной среде при температуре 4 °C до готовности к инъекциям.

2. Подготовка клеток рака яичников

1. Культивирование клеток рака яичников человека в колбе для культивирования 75 см2 при 37 °C и 5%^CO2 до слияния не менее 75% ко дню сбора сальника.
   ПРИМЕЧАНИЕ: В этом протоколе используются mCherry-положительные клетки рака яичников человека OCSC1-F2, описанные ранее 15,16,17,18. Он может быть модифицирован в любую линию раковых клеток, помеченную флуоресцентным сигналом.
2. Подготовьте клетки внутри ламинарного колпака сразу после забора образца сальника. Убедитесь, что все материалы и инструменты стерильны или стерилизована.
3. Добавьте 10 мл стерильного 1x PBS в колбу для культивирования и промойте клетки, осторожно покачивая колбу. Удалите 1x PBS, а затем добавьте 3 мл 0,05% трипсина-ЭДТА.
4. Осторожно встряхните колбу с культурой, чтобы покрыть все клетки, а затем поместите колбу в инкубатор (37 °C и 5% CO₂) не более чем на 5 мин. Постучите по колбе для культивирования, чтобы полностью отделить клетки, а затем нейтрализуйте трипсин, добавив 3 мл питательной среды для сальника.
5. Смешайте клеточную суспензию с помощью пипетирования, а затем перелейте суспензию в коническую пробирку объемом 15 мл. Центрифугу суспензии в течение 5 мин при 1 200 x g при 24 °C. Удалите надосадочную жидкость и повторно суспендируйте клеточную гранулу в 6 мл свежей питательной среды сальника.
6. Подсчитайте количество клеток с помощью гемацитометра. Разбавляют клеточную суспензию не менее чем до 100 000 клеток на 100-200 мкл суспензии. Это объем инъекции в каждый отрезанный кусочек сальника.
7. Перенесите соответствующее количество клеток в новую колбу для культивирования, чтобы продолжить пассаж клеток.

3. Инъекция клеток рака яичников

1. С помощью шприца объемом 1 мл наберите клеточную суспензию, затем присоедините иглу 26-G. Не вытягивайте клеточную суспензию с помощью иглы, так как это может привести к фрагментации клеток.
2. С помощью небольших хирургических щипцов возьмите кусочек разрезанного сальника. Переложите сальник в отдельную рабочую стерильную посуду для облегчения инъекции. Аккуратно проткните сальник кончиком иглы и введите небольшой объем клеточной суспензии в ткань (рис. 2В).
3. Повторите инъекцию на несколько участков сальника до общего объема не менее 100 мкл или 100 000 клеток. Обратите внимание, что может показаться, что большая часть клеточной суспензии скапливается вокруг образца. Если есть опасения по поводу качества инъекции, то повторите инъекцию или введите в образец больший объем клеточной суспензии.
4. Верните введенные образцы сальника в каждую лунку 24-луночного культурального планшета. Обратите внимание, что объем питательной среды сальника должен быть таким, чтобы покрывать сальник, не позволяя ему всплывать. Осторожно обработайте планшет и поместите его в инкубатор (37 °C и 5% CO₂).
5. НЕОБЯЗАТЕЛЬНО: Используйте Matrigel (матрицу базальной мембраны) для суспендирования ткани сальника в твердом матриксе, чтобы облегчить инъекцию и более концентрированную доставку клеточной суспензии.
   1. Матрицу базальной мембраны разморозить при 4 °C и смешать в соотношении 1:1 с питательной средой сальника непосредственно перед использованием. Смесь базальной мембранной матрицы хранить на льду или при температуре 4 °C до инъекции. Заполните пустые лунки достаточным количеством смеси базальной мембранной матрицы, чтобы погрузить в нее отрезанный кусочек сальника.
   2. Поместите образцы в базальную мембранную матричную смесь, а затем поместите 24-луночный планшет для культивирования в инкубатор (37 °C и 5% CO₂) на 20 минут. Как только смесь застынет, продолжайте инъекцию, как описано выше.
6. Подтвердите успешную инъекцию с помощью флуоресцентной визуализации. Убедитесь, что полоса флуоресцентного сигнала визуализируется в местах инъекции (рис. 2D). Обратите внимание, что фактическое количество клеток, прикрепленных к сальнику после инъекции, непредсказуемо.

4. Совместное культивирование клеток рака сальника человека и яичников

1. Меняйте среду каждые 48-72 ч, добавляя 500-2000 мкл свежей питательной среды сальника. Не наносите питательную среду непосредственно на ткань сальника, так как это может привести к смещению раковых клеток. Обратите внимание, что если цвет носителя изменится на желтый, смените носитель.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Частота смены среды будет зависеть от объема используемой среды и траектории роста раковых клеток. После того, как раковые клетки засеяли сальник, плавает кусочек сальника или нет, уже не имеет значения.
2. ОПЦИОНАЛЬНО: Если используется матрица базальной мембраны, матрица, как правило, растворяется к моменту первой смены среды.
3. Контролируйте рост опухолей рака яичников с помощью флуоресцентной визуализации. Периодичность визуализации остается на усмотрение исследователя. Ожидайте появления небольших опухолей примерно через 14 дней (рис. 3A-C). Результаты могут отличаться в зависимости от качества инъекции.
4. Завершите эксперимент в зависимости от конечной точки эксперимента.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Рост опухоли и целостность ткани сальника наблюдались в течение последних 50 дней.

Результаты

Успешное внедрение клеток рака яичников в образцы сальника было очевидно примерно на 14-й день (рис. 3A-C). По крайней мере, 24 репликата были подготовлены и введены на каждый собранный образец, чтобы обеспечить возможность дальнейших экспериментов. Рост опухоли контролировали с помощью флуоресцентных снимков (рис. 3D, E). Изображения должны были быть тщательно интерпретированы, так как на дне каждой лунки также...

Обсуждение

С использованием этого протокола была разработана доклиническая модель перитонеального канцероматоса при раке яичников с использованием комбинации основных методов in vitro и ex vivo. Прогрессирующий рост опухоли наблюдался в течение 50 дней совместного культивирования после посева образцов сальника клетками рака яичников человека mCherry+ OCSC1-F2. Этот метод был разработан и оптимизирован в ходе нескольких экспериментальных испытаний с использованием различных образцов сальника. Успешный рост опухоли ...

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье

Имя	Компания	Каталожный номер	Комментарии
0,05% Трипсин-ЭДТА (1x)	Gibco	25300054
1 мл инсулинового шприца со съемной иглой 26 г	BD	329652
10 мл серологических пипеток	CELLTREAT	229010B
100 мм Чашка для культуры тканей	Fisherbrand	FB012924
15 мл центрифужной пробирки	CELLTREAT	229411
24 лунки Планшет	для культур Costar	3524
50 мл Центрифуга Пробирка	CELLTREAT	229421
75 см<суп>2 Колба для культуры тканей	CELLTREAT	229341
Счетчик клеток	Corning	9819000
Цитирование 5 имидж-сканер	Biotek
DMEM/F12 (1:1) (1x), +L-глутамин, +2,438 г/л натрия Бикарбонат	Gibco	11320033
фетальная сыворотка крупного рогатого скота, сертифицированная	Gibco	1043028
Matrigel	Corning	356230	Матрица базальной мембраны
No 10 Одноразовый скальпель из нержавеющей стали	Integra-Miltex	4410
Пенициллин стрептомицин	Gibco	15140122
фосфатный буферный раствор, pH 7,4 ( 1x)	Микроскоп Gibco	10010023
Revolve	Echo