Здесь мы представляем протокол извлечения яда из Trichogramma dendrolimi с использованием искусственного хозяина, созданного с помощью полиэтиленовой пленки и раствора аминокислоты.
Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.
Методическая статья
Извлечение яда из паразитоидной осы Trichogramma dendrolimi с использованием искусственного хозяина
* These authors contributed equally
В этой статье
Краткое содержание
Аннотация
Паразитоидные осы представляют собой разнообразную группу перепончатокрылых насекомых, которые служат бесценными ресурсами для биоборьбы с вредителями. Чтобы обеспечить успешный паразитизм, паразитоидные осы впрыскивают яд своим хозяевам, чтобы подавить иммунитет своих хозяев, модулировать их развитие, метаболизм и даже поведение. Насчитывая более 600 000 видов, разнообразие паразитоидных ос превосходит разнообразие других ядовитых животных, таких как змеи, конусные улитки и пауки. Яд паразитоидной ос является малоизученным источником биологически активных молекул с потенциальными применениями в борьбе с вредителями и медицине. Тем не менее, сбор паразитоидного яда затруднен из-за невозможности использования прямой или электрической стимуляции и трудности вскрытия из-за их небольшого размера. Трихограмма - это род крошечных (~0,5 мм) яиц паразитоидных ос, которые широко используются для биологической борьбы с чешуекрылыми вредителями как в сельском хозяйстве, так и в лесах. Здесь мы сообщаем о методе извлечения яда из T. dendrolimi с использованием искусственных хозяев. Этих искусственных хозяев создают с помощью полиэтиленовой пленки и растворов аминокислот, а затем прививают осам трихограммы от паразитизма. Впоследствии яд собирали и концентрировали. Этот метод позволяет извлекать большое количество яда трихограммы , избегая при этом загрязнения других тканей, вызванного вскрытием, что является распространенной проблемой в протоколах вскрытия резервуаров яда. Этот инновационный подход облегчает изучение яда трихограммы , прокладывая путь для новых исследований и потенциальных применений.
Введение
Паразитоидные осы являются паразитическими перепончатокрылыми насекомыми, которые являются важными ресурсами для биологического контроля1. Существует большое разнообразие паразитоидных ос, насчитывающее более 600 000видов2. Разнообразие паразитоидных ос намного превосходит разнообразие других ядовитых членистоногих, таких как змеи, конусные улитки, пауки, скорпионы и пчелы. Яд является важным паразитарным фактором паразитоидных ос. При успешном паразитизме яд вводится в организм хозяина, модулируя его поведение, иммунитет, развитие и метаболизм3. Кроме того, яд паразитоидных ос демонстрирует удивительное разнообразие в своих молекулярных структурах, мишенях и функциях, что отражает сложную коэволюцию с их хозяевами. Таким образом, паразитоидный яд является ценным и недооцененным ресурсом активных молекул для инсектицидных или медицинских целей4. В отличие от яда змей, конусных улиток, пауков, скорпионов и пчел, яд паразитоидных ос не может быть собран прямой стимуляцией илиэлектростимуляцией. Современный метод извлечения яда паразитоидных ос заключается в вскрытии резервуара яда. Однако паразитоидные осы часто бывают мелкими, и вскрытие паразитоидных ос требует высоких технических навыков. Поэтому, если мы сможем найти способ эффективно и удобно собирать яд паразитоидных ос, это будет большим подспорьем для исследования яда паразитоидных ос.
Trichogramma (лат. Trichogrammatidae) — род мелких (~0,5 мм длиной) паразитоидных ос6. Эти осы являются одними из наиболее широко используемых агентов биоконтроля, особенно нацеленных на яйца различных чешуекрылых вредителей как в сельском хозяйстве, так и в лесах. Например, T. dendrolimi, один из наиболее широко используемых видов Trichogramma в Китае, широко применяется для борьбы с различными сельскохозяйственными и лесными вредителями, такими как Dendrolimus superans, Ostrinia furnacalis и Chilo suppressalis. Предыдущие исследования показали, что осы Trichogramma могут вводить свои яйца в искусственных хозяев7. Искусственные хозяева могут быть созданы с использованием таких материалов, как воск8, агар9, парапленка10 и пластиковая пленка11. Раствор в искусственных хозяевах, который индуцирует достаточное количество яйцекладок для трихограммы , может быть простым, например, аминокислотами или неорганическими солями12. Основываясь на характеристике, что T. dendrolimi может паразитировать на искусственных хозяевах, в этом исследовании представлен новый метод извлечения яда из паразитоидных ос с использованием искусственных хозяев. Этот подход направлен на устранение недостатков, связанных с низким выходом, низкой чистотой и восприимчивостью к загрязнению в современных методах экстракции. С помощью этого метода можно извлечь большое количество яда высокой чистоты из T. dendrolimi , что отвечает потребностям научных исследований и скрининга биологически активных молекул для инсектицидных или медицинских целей.
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Протокол
1. Разведение насекомых
- Кормят Corcyra cephalonica на кукурузной муке при температуре 26 ± 1°С и относительной влажности воздуха 40% ± 10%.
- Разводить штамм T. dendrolimi из инсектария Цзилинь в помещении, используя яйца Corcyra cephalonica в качестве хозяев. Кормят взрослых ос 10%-ной сахарозой водой в трубках дрозофилы при температуре 26 ± 1 °C, относительной влажности воздуха 70% ± 10%, светлых (L): темных (D) периодов 14 ч: 10 ч.
2. Подготовка карт яиц из полиэтиленовой пленки
- Возьмите полиэтиленовую пленку длиной 16 см, шириной 12 см и толщиной 20 мкм. Выдавить 30 полукруглых выступов диаметром 2-3 мм и высотой примерно 3 мм с помощью стеклянного шлифовального стержня по стандартной схеме ПЦР-пластины из 96 отверстий.
ПРИМЕЧАНИЕ: Процесс выдавливания 30 полукруглых выступов с помощью стеклянного шлифовального стержня необходимо выполнять, обращая внимание на давление, потому что слишком твердый пресс проткнет пластик и загрязнит извлеченный неядовитый шлифовальный стержень. - Продезинфицируйте прессованную полиэтиленовую пленку, подвергая обе стороны воздействию ультрафиолета (УФ) в течение 1 часа.
- Добавьте небольшое количество 10% поливинилового спирта на полукруглую поверхность.
3. Паразитизм Trichogramma dendrolimi
- После анестезииСО2 поместите самок ос T. dendrolimi в ящик для сбора, и количество ос составило ~3000.
- Приложите выпуклую сторону пленочной карточки для яиц к коробке для сбора и закрепите края резинкой.
- Добавьте 4 мкл раствора аминокислоты (6 г/л лейцина, 4 г/л фенилаланина, 4,25 г/л гистидина) к каждому полукруглому выпячиванию. Накройте его плоской полиэтиленовой пленкой длиной 16 см и шириной 12 см. С помощью резинки плотно накройте сборный ящик двумя листами пластика.
- Дайте осам T. dendrolimi свободно паразитировать в течение 4-8 ч и обеспечьте 10%-ную сахарозную воду через смоченный хлопок.
4. Сбор яда T. dendrolimi
- Извлеките паразитизированный раствор аминокислоты из внутреннего выступа карточки искусственной яйцеклетки и переложите его в колпачок пробирки объемом 1,5 мл.
- Накройте крышку пробирки нейлоновой сеткой диаметром 10 мкм диаметром 25 мм, плотно закрепите нейлоновую сетку и центрифужную пробирку. Поместите центрифужную пробирку вертикально для короткого центрифугирования с помощью мини-центрифуги (1360 x g) на 10 с и соберите отфильтрованный раствор (~100 мкл яда T. dendrolimi ).
- Измерьте концентрацию собранного яда T. dendrolimi с помощью набора для анализа бицинхониновой кислоты (BCA) (таблица материалов).
- Храните яд при температуре -80 °C для дальнейшего анализа.
5. Анализ SDS-PAGE
- Добавьте 30 мкл яда T. dendrolimi в 10 мкл 4-кратного буфера для загрузки образца с додецилсульфатом-полиакриламидным гелем натрия (SDS-PAGE) (таблица материалов) и нагревайте при 95 °C в течение 10 мин.
- Выполните прогон геля SDS-PAGE при напряжении 130 В в течение 120 мин.
- Окрасьте и обесцвечивайте гель SDS-PAGE с помощью аппарата для окрашивания белков (таблица материалов).
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Результаты
Концентрацию белка в репрезентативных образцах яда измеряли с помощью набора для анализа белков, результаты представлены в таблице 1. Результаты показали, что концентрация белка яда, собранного этим методом, варьировала от 0,35 мкг/мкл до 0,46 мкг/мкл, в то время как отрицательный контроль раствора аминокислоты имел концентрацию белка только от 0,03 мкг/мкл до 0,05 мкг/мкл. Концентрация белка яда, собранного этим методом, намного выше, чем у отрицательного контроля, что показывает, что этот метод может х...
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Обсуждение
В данной статье мы представляем метод извлечения яда из T. dendrolimi с использованием искусственных хозяев. Ключевые моменты в эксперименте по сбору яда заключаются в следующем. (1) Во время приготовления T. dendrolimi необходимо быстро обезболивать соответствующей концентрацией CO2. Если концентрацияСО2 слишком низкая, ее будет недостаточно для быстрого обезболивания трихограммы . И наоборот, если концентрация слишком высока, трихограммы могут погибнуть, снижая ...
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Раскрытие информации
Автору нечего раскрывать и нет конкурирующих финансовых интересов.
Благодарности
Выражаем признательность за финансовую поддержку со стороны Фонда естественных наук провинции Хайнань (грант No 323QN262), Национального фонда естественных наук Китая (гранты No 31701843 и 32172483), Фонда инноваций в области сельскохозяйственной науки и технологий провинции Цзянсу (грант No 323QN262). CX(22)3012 и CX(21)3008), Фонд «Доктор Шуанчуан» провинции Цзянсу (грант No 202030472) и стартап-фонд Нанкинского сельскохозяйственного университета (грант No 804018).
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Материалы
| Имя | Компания | Каталожный номер | Комментарии |
|---|---|---|---|
| 10 μ m Нейлоновая сетка | Millipore | NY1002500 | Для фильтрации яиц |
| 10% Поливиниловый спирт | Аладдин | P139533 | Для привлечения T. dendrolimi для откладывания яиц |
| 10% Вода сахарозы | Химический реагент Sinopharm | 10021463 | Feed Trichogramma dendrolimi4x |
| LDS загрузочный буфер | Ace Hardware | B23010301 | SDS-PAGE |
| Collection box | Deli | 8555 | Контейнер для T. dendrolimi паразитизм |
| Future PAGE 4– 12% (12 лунок) | Ace Hardware | J70236502X | SDS-PAGE |
| Аппарат для окрашивания белка GenScript eStain L1 | GenScript | L00753 | SDS-PAGE |
| Стержень для шлифования стекла | Applygen | tb6268 | Полукруглые выступы |
| L- Leucine | Solarbio | L0011 | Компоненты искусственного хозяина |
| L-гистидин | Аладдин | A2219458 | Компоненты искусственного хозяина |
| L-фенилаланин | Solarbio | P0010 | Компоненты искусственного хозяина |
| Мини-центрифуги | Scilogex | D1008 | Центрифуга |
| MOPS-SDS беговой буфер | Ace Hardware | B23021 | SDS-PAGE |
| Набор для анализа белка Omni-Easy Instant BCA | Shanghai Yamay Biomedical Technology | ZJ102 | Для оценки концентрации белка яда |
| ПЦР планшет с раскладкой 96 отверстий | Thermo Fisher | AB1400L | Полукруглые выступы |
| Полиэтиленовая пленка | Сучжоу Аопанг Трейдинг | 001c5427 | Карта для искусственных яиц |
| Прекрасный цветной белковый маркер (10– 180 кДа) | YiFeiXue Biotech | YWB007 | SDS-PAGE |
| Резиновая лента | Guangzhou qianrui биология наука и техника | 009 | Затяните пластиковую пленку и коробку для сбора |
| Силиконовая резиновая септа коврик, 96-лунка, круглое отверстие | Sangon Biotech | F504416-0001 | Полукруглые выступы |
Ссылки
- Pennacchio, F., Strand, M. R. Evolution of developmental strategies in parasitic hymenoptera. Annual Review of Entomology. 51, 233-258 (2006).
- Yan, Z. C., Ye, X. H., Wang, B. B., Fang, Q., Ye, G. Y. Research advances on composition, function and evolution of venom proteins in parasitoid wasps. Chinese Journal of Biological Control. 33 (1), 1-10 (2017).
- Asgari, S., Rivers, D. B. Venom proteins from endoparasitoid wasps and their role in host-parasite interactions. Annual Review of Entomology. 56, 313-335 (2011).
- Moreau, S. J. M., Guillot, S. Advances and prospects on biosynthesis, structures, and functions of venom proteins from parasitic wasps. Insect Biochemistry and Molecular Biology. 35 (11), 1209-1223 (2005).
- Yan, Z. C., et al. A venom serpin splicing isoform of the endoparasitoid wasp Pteromalus puparum suppresses host prophenoloxidase cascade by forming complexes with host hemolymph proteinases. Journal Biological Chemistry. 292 (3), 1038-1051 (2017).
- Woelke, J. B., et al. Description and biology of two new egg parasitoid species (Hymenoptera: Trichogrammatidae) reared from eggs of Heliconiini butterflies (Lepidoptera: Nymphalidae: Heliconiinae) in Panama. Journal of Natural History. 53 (11-12), 639-657 (2019).
- Zang, L. S., Wang, S., Zhang, F., Desneux, N. Biological control with Trichogramma in China: History, present status, and perspectives. Annual Review of Entomology. 66, 463-484 (2021).
- Nettles, W. C. J., Morrison, R. K., Xie, Z. N., Ball, D., Shenkir, C. A., Vinson, S. B. Synergistic action of potassium chloride and magnesium sulfate on parasitoid wasp oviposition. Science. 218, 4568(1982).
- Tilden, R. L., Ferkovich, S. M. Kairomonal stimulation of oviposition into an artificial substrate by the endoparasitoid Microplitis croceipes (Hymenoptera)Braconidae). Annals of the Entomological Society of America. 81 (1), 152-156 (1988).
- Xie, Z. N., Li, L., Xie, Y. Q. In vitro culture of Habrobracon hebetor. Chinese Journal of Biological Control. 5 (2), 49-51 (1989).
- Han, S. T., Liu, W. H., Li, L. Y., Chen, Q. X., Zeng, B. K. Breeding Trichogramma ostriniae with artificial eggs. Journal of Environmental Entomology. 21 (1), 9-12 (1999).
- Li, L. Y., Chen, Q. X., Liu, W. H. Oviposition behavior of twelve species of Trichogramma and its influence on the efficiency of rearing them in vitro. Journal of Environmental Entomology. 11 (1), 31-35 (1989).
- Xing, J. Q., Li, L. Y. Rearing of an egg parasite Anastatus japonicus Ashmead in vitro. Acta Entomologica Sinica. 33 (2), 166-173 (1990).
- Moreau, S. J. M. "It stings a bit but it cleans well": Venoms of Hymenoptera and their antimicrobial potential. Journal of Insect Physiology. 59 (2), 186-204 (2013).
- Moreau, S. J. M., Asgari, S. Venom proteins from parasitoid wasps and their biological function. Toxins. 7 (7), 2385-2412 (2015).
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Перепечатки и разрешения
