В данной работе мы устанавливаем модель дисфункции слезных желез на крысах, чтобы обеспечить основу для изучения синдрома сухого глаза с дефицитом водянистой жидкости.
Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.
Методическая статья
Модель синдрома сухого глаза крысы с дисфункцией слезных желез, индуцированной скополамином
* These authors contributed equally
В этой статье
Краткое содержание
Аннотация
Синдром сухого глаза с дефицитом воды (СДВГ) — это тип синдрома сухого глаза, который может привести к снижению количества и качества слезной секреции. Длительная аномальная выработка слезы может привести к нарушению среды глазной поверхности, включая повреждение роговицы и воспаление. В тяжелых случаях СДВП может привести к потере зрения или даже слепоте. В настоящее время лечение синдрома сухого глаза ограничивается глазными каплями или физиотерапией, которые могут только облегчить симптомы дискомфорта в глазах и не могут фундаментально вылечить синдром сухого глаза. Для восстановления функции слезной железы при синдроме сухого глаза мы создали животную модель дисфункции слезных желез у крыс, индуцированных скополамином. С помощью комплексной оценки слезной железы, роговицы, конъюнктивы и других факторов мы стремимся обеспечить полное понимание патологических изменений СДВГ. По сравнению с текущей моделью мышей с синдромом сухого глаза, эта животная модель ADDE включает функциональную оценку слезной железы, обеспечивая лучшую платформу для изучения дисфункции слезных желез при СДВ.
Введение
К 2021 году примерно 12% людей страдают от синдрома сухогоглаза1, что делает его одним из наиболее распространенных хронических заболеваний глаз. Синдром сухого глаза можно разделить на два типа: синдром сухого глаза с дефицитом воды (ADDE) и испаряющийся синдром сухого глаза (EDE)2, в зависимости от различных факторов, влияющих на заболевание. СДДП подразделяется на синдром Шегрена (СС) и не-СС, но большинство пациентов с синдромом сухого глаза не являются пациентами с синдромом СС в клинике3. Хронические симптомы сухого глаза серьезно влияют на качество зрения пациентов. В настоящее время традиционное лечение DED включает в себя применение искусственных слез для смазывания глазной поверхности и физиотерапию век. Тем не менее, синдром сухого глаза не может предложить полного излечения во многих случаях. Поэтому изучение патогенеза синдрома сухого глаза имеет решающее значение для разработки новых методов лечения и лекарств. Животные модели синдрома сухого глаза обеспечивают основу для дальнейших исследований.
Существует множество способов построения животных моделей синдрома сухого глаза4, включая изменение уровня слезоотделения путем изменения уровня гормонов. Например, удаление семенников крыс может снижать секрецию андрогенов, увеличивать слезную секрецию, снижать концентрацию свободного секреторного компонента (СК) и IgA в слезах 5,6. Другой метод заключается в выявлении аутоиммунных реакций в слезной железе путем удаления поверхностных нервов глаза, которые контролируют железу. Кроме того, непосредственное уменьшение секреции слезы может быть достигнуто путем хирургического удаления слезной железы7. Изменяющиеся условия окружающей среды также могут ускорить испарение слезы. Например, культивирование животных в условиях низкой влажности и сухой вентиляции позволяет создать модель чрезмерной испарительной сухости глаз8, которую можно комбинировать с другими методами для увеличения тяжести синдрома сухого глаза. Основными препаратами, используемыми для индуцирования синдрома сухого глаза, являются атропин и скополамин9. В качестве парасимпатических ингибиторов оба могут индуцировать фармакологическую блокаду холинергических (мускариновых) рецепторов в слезной железе и ингибировать секрецию слезы. По сравнению с сухостью глаз, вызванной мышечной инъекцией атропина10, скополамин оказывает более сильное ингибирующее действие на железы секреции, более длительную продолжительность действия препарата и более слабое воздействие на гладкую мускулатуру сердца, тонкой кишки и бронхов. Это один из самых зрелых препаратов для животных с синдромом сухого глаза.
Для индуцирования синдрома сухого глаза скополамином могут использоваться различные методы, такие как подкожная инъекция, лекарственная помпа или наложение пластыря 4,11,12. Для того, чтобы снизить частоту введения препарата экспериментальным животным, многие исследователи накладывают трансдермальные пластыри на хвосты мышей или используют лекарственные насосы. Однако оба этих метода имеют ограничения. Например, при рассасывании трансдермальных пластырей необходимо учитывать индивидуальную абсорбцию мышей, что может привести к непостоянной дозировке препарата. Несмотря на то, что лекарственные насосы могут точно контролировать дозировку каждого введения, они не всегда совместимы с доставляемым препаратом или используемой концентрацией. Они также должны быть размещены хирургическим путем, что является более инвазивным для животного, требует анестезии и может привести к послеоперационным осложнениям, таким как расхождение швов. Подкожная инъекция, хотя и более громоздкая, может обеспечить точную дозировку для каждого введения и поддерживать последовательность при введении препарата у разных крыс. При этом он имеет меньшую стоимость и подходит для проведения большого количества экспериментов на животных.
В этом исследовании применяется повторная подкожная инъекция скополамина для создания модели сухого глаза крысы. Мы анализируем такие показатели сухого глаза, как дефекты роговицы, уровень слезосекреции и патологическая морфология роговицы, конъюнктивы и слезной железы. Комбинируя концентрацию препарата, патологические проявления и симптомы синдрома сухого глаза, мы детально развиваем модель крыс с синдромом сухого глаза, предоставляя более точные экспериментальные данные для изучения лечения синдрома сухого глаза и патологических механизмов. Мы также подробно опишем процесс моделирования для будущих исследователей.
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Протокол
Все эксперименты на животных, проводимые в соответствии с этим протоколом, проводятся с одобрения Институционального комитета по уходу за животными и их использованию (IACUC).
1. Подготовка животных
- Подготовьте 12 здоровых 6-недельных крыс SPF Wistar весом 160 г ± 20 г.
- Используйте щелевую лампу и офтальмоскоп для изучения состояния глаз всех крыс, чтобы убедиться в отсутствии заболеваний переднего сегмента или сетчатки.
- Выращивайте всех крыс в течение 1 недели с достаточным количеством пищи и воды.
- Случайным образом разделили всех крыс на группы с нормальной концентрацией препарата скополамин 2,5 мг/мл, концентрацией препарата скополамин 5 мг/мл и концентрацией препарата скополамина 7,5 мг/мл, по три животных в каждой группе.
2. Приготовление раствора
- Приготовьте скополамина гидробромид, растворив его в 0,9% растворе натрия хлорида, чтобы получить раствор с концентрациями 7,5 мг/мл, 5 мг/мл и 2,5 мг/мл.
- Готовят 0,9% раствор натрия хлорида без скополамина гидробромида для использования в качестве инъекций для контрольной группы крыс.
3. Подготовка оборудования и материалов
- Подготовьте микроскоп для маленьких животных.
- Подготовьте материалы для эксперимента, в том числе одноразовый шприц с иглой объемом 1 мл (26 г); флуоресцеиновые натриевые офтальмологические полоски; тест-полоска Ширмера на разрыв; абсолютный этанол; 4% параформальдегида; ксилол; нейтральный бальзам; гематоксилин, эозин; и набор периодического кислотного окрашивания по Шиффу.
4. Подкожная инъекция
ПРИМЕЧАНИЕ: Эта процедура требует помощи второго человека, чтобы помочь обезопасить крыс.
- Держите тело крысы устойчиво, поймайте и вытяните ее левые (или правые) задние лапы.
ПРИМЕЧАНИЕ: Помощник может помочь в удержании животного. - Место инъекции промыть спиртом.
- Ввести одноразовый шприц с иглой объемом 1 мл (26 G) в основание кожной складки между большим и указательным пальцами.
- Аспирируйте шприц, оттянув поршень шприца назад. Любая кровь в шприце указывает на неправильное размещение иглы; Снимите и переместите иглу.
- Вводят 0,9% раствор натрия хлорида с гидробромидом скополамина или без него равномерным плавным движением.
- Вводите всем крысам в соответствии с различными концентрациями, по 0,5 мл каждый раз и четыре раза в день (в 9:00, 12:00, 15:00 и 18:00) в течение последовательного периода в течение 19 дней, чередуя левую и правую конечности.
ПРИМЕЧАНИЕ: Группы называются следующим образом:
Группа без скополамина гидробромида: 0 группа (контроль)
Группа со скополамином гидробромидом 2,5 мг/мл: 2,5 группа
Группа со скополамина гидробромидом 5 мг/мл: 5 группа
Группа со скополамином гидробромидом 7,5 мг/мл: 7,5 группа - Верните животное в клетку и понаблюдайте за дыханием и поведением в течение 5-10 минут.
5. Тест на слезную секрецию (слезный тест Ширмера, STT)
- Создайте модифицированную полоску фильтровальной бумаги для крыс11. Отрежьте половину полоски фильтровальной бумаги, используемой для людей, вдоль центральной линии (1 мм × 15 мм) и обрежьте головку полоски, чтобы сделать ее гладкой.
ПРИМЕЧАНИЕ: Перед проведением теста на слезную секрецию вручную удерживайте тело крысы, чтобы предотвратить движение и обеспечить воздействие на глаза крысы. - Поместите полоску фильтровальной бумаги на внешнюю 1/3 конъюнктивального мешка нижнего века крысы.
- Засекайте время проведения теста в течение 5 минут. Контролируйте закрытие глаз крысы на протяжении всей процедуры.
- После измерения с помощью пинцета зажмите полоску фильтровальной бумаги в микроцентрифужной пробирке и запишите объем слезы, сделав отметку на стенке пробирки.
- Измерьте секрецию слезы на день 0, день 1, день 3, день 5, день 7, день 11, день 15 и день 19.
6. Флуоресцеиновое окрашивание роговицы
- Капните 0,5 мкл 0,5% раствора флуоресцеина натрия в нижний конъюнктивальный мешок каждой крысы.
- Наблюдайте за роговицей в синем свете в течение 3 минут после инстилляции флуоресцеина.
- Запишите флуоресцентное окрашивание роговицы каждой крысы и понаблюдайте за тем, есть ли дефект роговицы.
- Выполняйте окрашивание роговицы флуоресцеином на день 0, день 1, день 3, день 5, день 7, день 11, день 15 и день 19.
7. Гистологическое исследование ткани конъюнктивы
- После завершения разработки модели глубоко обезболивайте крыс внутрибрюшинной инъекцией 0,4 мл/100 г 10% водного хлоралгидрата, чтобы снять напряжение у животных. Затем усыпляют крыс вывихом шейки матки.
- Возьмите бульбарную конъюнктиву из одних и тех же областей каждой крысы, размером примерно 2 мм х 2 мм.
- Ткани немедленно фиксируют в 4% параформальдегиде на 24 ч и заделывают в парафин13.
- Отрежьте участки толщиной 5 мкм и покрасьте гематоксилином и эозином (HE)14 и периодической кислотой-красителем Шиффа (PAS) (следуйте инструкциям производителя).
8. Гистологическое исследование ткани роговицы и слезных желез
- После завершения разработки модели усыпьте крысу, как описано в шаге 7.1.
- Возьмите роговицу с правой стороны каждой крысы и сразу же зафиксируйте ее в 4% растворе параформальдегида.
- Разрежьте эпидермис головки и подкожную клетчатку по линии, соединяющей ухо и наружный угол глаза, расширьте разрез в обе стороны и дополнительно изолируйте желтоватую доорбитальную железу.
- Тщательно удалите шерсть крысы и отделите заглазничную железу 0,9% раствором натрия хлорида.
- Изолированные внеглазничные железы помещают в 4% раствор параформальдегида на 24 ч и встраивают в парафин.
- Вырезать непрерывные участки толщиной ~5 мкм и окрасить их HE для образцов тканей роговицы и внесорбитальных желез.
9. Статистический анализ
- Используйте соответствующее программное обеспечение для статистического анализа данных.
- Выполните односторонний дисперсионный анализ (ANOVA) для анализа данных и тест на наименьшую значимую разницу (LSD) для сравнения между группами. Установите уровень статистической значимости на α = 0,05, где P < 0,05 указывает на статистическую значимость.
ПРИМЕЧАНИЕ: Для статистического анализа экспериментальных данных использовалось программное обеспечение SPSS 20.
- Выполните односторонний дисперсионный анализ (ANOVA) для анализа данных и тест на наименьшую значимую разницу (LSD) для сравнения между группами. Установите уровень статистической значимости на α = 0,05, где P < 0,05 указывает на статистическую значимость.
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Результаты
Тест Ширмера I, SIT I
Объем слезы крыс измеряли на 0, 3, 5, 7, 11, 15 и 19 сутки после начала эксперимента. Результаты эксперимента показали, что слезная секреция группы скополамина (2,5 группа, 5 группа, 7,5 группа) по сравнению с контрольной группой (0 группа) была достоверно снижена, а разница была статистически значимой (р < 0,01). Статистической значимости между группами 2,5, 5 и 7,5 не было (P > 0,05). Статистически значимой разницы между разными группами по количеству дней не наблюдалось ...
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Обсуждение
Синдром сухого глаза с дефицитом водянистой жидкости (СДВГ) является важным типом синдрома сухого глаза, на долю которого приходится около 1/3 от общей популяции синдрома сухогоглаза17, и основной причиной СДВ является патологическое повреждение слезных желез и воспаление13. Для этого типа сухого глаза наиболее распространенными клиническими методами лечения являются искусственные слезы для облегчения симптомов или местное применение стероидов или циклоспорина
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Раскрытие информации
У авторов отсутствуют потенциальные конфликты интересов, связанные с препаратами и материалами, используемыми в данной процедуре.
Благодарности
Это исследование было поддержано Гуандунским провинциальным центром клинических ключевых специальностей высокого уровня (SZGSP014) и Шэньчжэньским фондом естественных наук (JCYJ20210324125805012).
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Материалы
| Имя | Компания | Каталожный номер | Комментарии |
|---|---|---|---|
| 0,9% раствор хлорида натрия | SJZ No4 Фармацевтическая | H13023201 | |
| 4% параформальдегид | Wuhan Servicebio Technology Co., Ltd | G1113 | |
| Абсолютный этанол | Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd. | ||
| Флуоресцеин натрия офтальмологические полоски | Тяньцзинь Инуосинькан Медицинское устройство Тек Ко., Лтд | YN-YG-I | |
| Гематоксилин и эозин | Нанкинский институт биоинженерии Цзяньчэн | D006 | |
| Нейтральный бальзам | Пекин Solarbio Science & Технологическая компания, ООО | G8590 | |
| Парафин | Пекин Solarbio Наука и Наука Технология Ко., Лтд. | YA0012 | |
| Набор для периодического окрашивания кислотой-Шиффа | Beyotime Biotechnology | C0142S | |
| Schirmer тест-полоски на разрыв | Тяньцзинь Yinuoxinkang Medical Device Tech Co., Ltd | YN-LZ-I | |
| Скополамина гидробромид | Shanghai Macklin Biochemical Co., Ltd | S860151 | |
| Микроскоп для мелких животных | Head Biotechnology Co,. ООО | ЗМ191 | |
| Ксилол | Синофарм Химический реагент Ко., Лтд. |
Ссылки
- Papas, E. B. The global prevalence of dry eye disease: A Bayesian view. Ophthalmic Physiol Opt. 41 (6), 1254-1266 (2021).
- Sy, A., et al. Expert opinion in the management of aqueous deficient dry eye disease (DED). BMC Ophthalmol. 15 (1), 133(2015).
- Seo, Y., et al. Activation of HIF-1alpha (hypoxia inducible factor-1alpha) prevents dry eye-induced acinar cell death in the lacrimal gland. Cell Death Dis. 5 (6), 1309(2014).
- Rahman, M. M., Kim, D. H., Park, C. -K., Kim, Y. H. Experimental models, induction protocols, and measured parameters in dry eye disease: Focusing on practical implications for experimental research. Int J Mol Sci. 22 (22), 12102(2021).
- Sullivan, D. A., Bloch, K. J., Allansmith, M. R. Hormonal influence on the secretory immune system of the eye: androgen regulation of secretory component levels in rat tears. J Immunol. 132 (3), 1130-1135 (1984).
- Sullivan, D. A., Allansmith, M. R. Hormonal modulation of tear volume in the rat. Exp Eye Res. 42 (2), 131-139 (1986).
- Maitchouk, D. Y., Beuerman, R. W., Ohta, T., Stern, M., Varnell, R. J. Tear production after unilateral removal of the main lacrimal gland in squirrel monkeys. Arch Ophthalmol. 118 (2), 246-252 (2000).
- Barabino, S., et al. The controlled-environment chamber: a new mouse model of dry eye. Invest Ophthalmol Vis Sci. 46 (8), 2766-2771 (2005).
- Viau, S., et al. Time course of ocular surface and lacrimal gland changes in a new scopolamine-induced dry eye model. Graefes Arch Clin Exp Ophthalmol. 246 (6), 857-867 (2008).
- Altinors, D. D., Bozbeyoglu, S., Karabay, G., Akova, Y. A. Evaluation of ocular surface changes in a rabbit dry eye model using a modified impression cytology technique. Curr Eye Res. 32 (4), 301-307 (2007).
- Daull, P., et al. Efficacy of a new topical cationic emulsion of cyclosporine A on dry eye clinical signs in an experimental mouse model of dry eye. Exp Eye Res. 153, 159-164 (2016).
- Dursun, D., et al. A mouse model of keratoconjunctivitis sicca. Invest Ophthalmol Vis Sci. 43 (3), 632-638 (2002).
- Fischer, A. H., Jacobson, K. A., Rose, J., Zeller, R. Cutting sections of paraffin-embedded tissues. CSH Protoc. 2008, (2008).
- Fischer, A. H., Jacobson, K. A., Rose, J., Zeller, R. Hematoxylin and eosin staining of tissue and cell sections. CSH Protoc. 2008, (2008).
- Shinomiya, K., Ueta, M., Kinoshita, S. A new dry eye mouse model produced by exorbital and intraorbital lacrimal gland excision. Sci Rep. 8 (1), 1483(2018).
- Ramos, M. F., et al. Nonproliferative and Proliferative Lesions of the Rat and Mouse Special Sense Organs(Ocular [eye and glands], Olfactory and Otic). J Toxicol Pathol. 31, (2018).
- Stapleton, F., et al. TFOS DEWS II Epidemiology report. Ocul Surf. 15 (3), 334-365 (2017).
- Foulks, G. N., et al. Clinical guidelines for management of dry eye associated with Sjogren disease. Ocul Surf. 13 (2), 118-132 (2015).
- Huang, W., Tourmouzis, K., Perry, H., Honkanen, R. A., Rigas, B. Animal models of dry eye disease: Useful, varied and evolving (Review). Exp Ther Med. 22 (6), 1394(2021).
- Brayer, J. B., Humphreys-Beher, M. G., Peck, A. B. Sjogren's syndrome: immunological response underlying the disease. Arch Immunol Ther Exp (Warsz. 49 (5), 353-360 (2001).
- Lin, Z., et al. A mouse dry eye model induced by topical administration of benzalkonium chloride). Mol Vis. 17, 257-264 (2011).
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Перепечатки и разрешения
