Создание модели рака колопроктита у мышей и оценка терапевтического эффекта китайской медицины

Колоректальный рак (КРР) является распространенным злокачественным новообразованием желудочно-кишечного тракта, третьим по распространенности злокачественным новообразованием и второй по распространенности причиной смерти в мире, на его долю приходится 10% глобальной заболеваемости раком и 9,4% от общего^{числа смертей,} связанных с раком1,2. Генетические факторы, хроническое воспаление, диета с высоким содержанием жиров, диабет и аномальная кишечная флора являются факторами риска развития КРР ^3,4. Среди них воспалительные заболевания кишечника, особенно язвенный колопроктит (ЯК), являются явным фактором риска развития КРР ^5,6. ЯК-ассоциированный КРР (ЯК-КРР) – это переходный процесс воспаления, атипичной гиперплазии и рака, основанный на хроническом воспалении толстой кишки, который отличается от типичной модели развития аденомы-аденокарциномы КРР ^7,8. По сравнению с общей популяцией, риск развития КРР примерно в 10-40 раз выше у пациентов с воспалительными заболеваниями кишечника⁹.

В настоящее время хирургическое вмешательство по-прежнему является стандартным методом лечения КРР, и в зависимости от локализации и стадии опухоли возможна лучевая терапия, системная лекарственная терапия или их комбинация¹⁰. Несмотря на то, что эти традиционные методы лечения добились значительного прогресса из-за высокой гетерогенности и частоты рецидивов КРР, прогноз неблагоприятный, а эффект лечения не идеален^11,12. Поэтому раннее выявление, ранняя диагностика и комплексное лечение являются ключом к повышению выживаемости пациентов с КРР, и особенно важно обратить внимание на трансформацию ЯК в КРР. На протяжении многих лет традиционная китайская медицина (ТКМ) привлекала большое внимание в лечении ЯК-КРР или хронического гастрита из-за ее ограниченных побочных эффектов и значительной эффективности. Основываясь на диалектическом лечении, известные практикующие китайскую медицину разных поколений создали большое количество классических рецептов, таких как отвар Хуанци Цзяньчжун¹³, отвар Сыцзюньцзы¹⁴ и пилюля Сышэнь¹⁵.

Отвар Люцзюньцзы (LJZD) возник из работ И Сюэ Чжэн Чжуаня, составленных во времена династии Мин, и является классическим рецептом в ТКМ¹⁶. Как показано в таблице 1, LJZD состоит из шести традиционных трав, в том числе Codonopsis pilosula (Franch.) Наннф. (Dangshen), Poria cocos (Schw.), Wolf (Fuling), Atractylodes macrocephala Koidz. (Baizhu), Glycyrrhiza uralensis Fisch. (Gancao), Citrus reticulata Blanco (Chenpi) и Pinellia ternata (Thunb.) Брейт (Banxia), который обладает эффектом восполнения ци и укрепления селезенки, подсушивая сырость и рассасывая мокроту. В современной клинической практике его часто используют для лечения хронического гастрита, язвенной болезни желудка, двенадцатиперстной кишки. Современные фармакологические исследования показали, что LJZD и модифицированный LJZD имеют высокую прикладную ценность в адъювантном лечении ЯК и рака пищеварительного тракта 17,18,19.

В настоящее время существует множество способов построения мышиных моделей UC-CRC, но модель мышей, индуцированная азоксиметаном (AOM)/dextran sulfate sodium (DSS), является наиболее широко используемой моделью UC-CRC; клинические симптомы, морфологические и патологоанатомические наблюдения доказали, что модель очень похожа на ЯК-КРР^{человека 20,21}. Основной принцип заключается в том, чтобы сначала индуцировать канцерогенез химическим канцерогеном AOM, а затем непрерывно подвергать мышей воздействию среды стимуляции воспаления DSS, чтобы имитировать непрерывное повреждение и восстановление эпителия слизистой оболочки кишечника, тем самым конструируя мышиную модель^{UC-CRC 22}. Целью данного исследования является создание мышиной модели ЯК-КРР путем внутрибрюшинного введения АОМ и циклической стимуляции ДСС в краткосрочной перспективе, а также оценка влияния препарата и молекулярного механизма ЛЖЖД на ЯК-КРР, чтобы обеспечить научную основу для лечения ЯК-КРР.

Процедура на животных была одобрена Комитетом по этике Чанчуньского университета китайской медицины (регистрационный номер: 2021214). Специфические мыши C57BL/6J (8-10 недель, масса 18-22 г), самцы и самки, содержались в независимо вентилируемых клетках при температуре 22 °C и относительной влажности воздуха 65%. Мыши начинали эксперимент после 7 дней адаптивного кормления, во время которого у них был свободный доступ к воде и рациону.

1. Приготовление препарата

1. Подготовка LJZD
   ПРИМЕЧАНИЕ: Используемое китайское лекарство было приобретено в Филиале больницы Чанчуньского университета китайской медицины и было идентифицировано как подлинное китайское лекарство (см. Таблицу 1).
   1. Положите Даншэнь (12 г), Байчжу (12 г), Ганьцао (6 г), Чэньпи (12 г), Цзянбанься (9 г) в специальный керамический горшок (см. Таблицу материалов). Добавьте 1000 мл дистиллированной воды и замочите при комнатной температуре на 1 ч (см. рисунок 1А).
   2. Порошок 12 г Измельчить в мелкий порошок с помощью измельчителя и замочить в 300 мл дистиллированной воды в другой емкости на 1 ч при комнатной температуре.
   3. Смешайте вышеуказанное китайское лекарство в специализированном керамическом горшке. Вскипятите смесь, а затем держите на среднем огне до тех пор, пока не останется всего 300 мл отвара. Используйте медицинскую марлю для процеживания и храните фильтрат при комнатной температуре.
   4. Добавьте 1000 мл дистиллированной воды и повторите вышеуказанную операцию с отваром еще раз. Процеживают еще раз, используя медицинскую марлю. Соедините фильтрат и кипятите до тех пор, пока не останется всего 150 мл.
   5. Центрифугируют концентрированную жидкость при 10 000 х г в течение 5 мин и далее концентрируют полученную надосадочную жидкость до 30 мл на среднем огне. Переложите готовый концентрат в посуду и высушите его с помощью электрической сушильной печи до тех пор, пока не останется только растворенное вещество в виде порошка.
   6. Взвесьте вышеуказанное твердое вещество и растворите его в стерильной дистиллированной воде до получения раствора, содержащего 22,85 мг препарата на 0,2 мл (114,16 мг/мл), что является суточной дозировкой мышей.
2. Приготовление 5-аминоссалициловой кислоты
   ПРИМЕЧАНИЕ: 5-аминосалициловая кислота (5-АСК; см. таблицу материалов) оказывает хорошее профилактическое действие на ЯК-КРР, и она использовалась в качестве положительного препарата в этом исследовании²³.
   1. Растворите 64 мг порошка 5-АСК в 200 мл стерильной дистиллированной воды до получения раствора 5-АСК 1,82 мг/мл. Суточная доза для одной мыши составляла 0,2 мл.
3. Приготовление раствора для инъекций АОМ
   1. Добавьте 2,5 мл стерильной дистиллированной воды в порошок 25 мг AOM (см. Таблицу материалов) и перемешайте с помощью вихревого смесителя (см. Таблицу материалов) до получения исходного раствора AOM 10 мг/мл, храните при -20 °C до использования.
   2. Приготовьте раствор для инъекций АОМ, разбавив исходный раствор АОМ стерильной дистиллированной водой в соотношении 10:1 (1 мг/мл).

2. Создание модели UC-CRC

ПРИМЕЧАНИЕ: Эксперимент был разделен на 4 группы: контрольную, модельную, LJZD и группу 5-ASA, по 10 мышей в каждой группе. Кроме контрольной группы, остальные группы получали лечение АОМ и ДСС.

1. Внутрибрюшинное введение раствора для инъекций АОМ
   ПРИМЕЧАНИЕ: После адаптивного кормления в течение 7 дней мышам вводили раствор для инъекций AOM (1 мг/мл) путем внутрибрюшинной инъекции (см. рис. 1B).
   1. Держите мышь животом вверх и слегка опущенной головой. Возьмитесь за кожу спины, чтобы подтянуть кожу живота, и проткните кожу примерно на 1 см справа от пересечения линии корня обоих бедер на средней линии живота шприцем объемом 1 мл (см. Таблицу материалов).
   2. Протолкните иглу шприца объемом 1 мл на расстояние 3-5 мм под кожей, держа ее параллельно средней линии живота, и введите иглу 0,3-0,5 мм в брюшную полость под углом 45°.
   3. После того, как наконечник проходит через мышцу живота, оператор ощущает внезапную потерю сопротивления. Затем потяните шприц наружу и назад, чтобы посмотреть, не просачивается ли жидкость. Если нет, медленно вводите раствор для инъекций AOM мышам в дозе 0,1 мл/10 г.
2. Циклическая стимуляция 2% раствора ДСС
   ПРИМЕЧАНИЕ: Каждой мыши, индуцированной AOM, давали по 500 мл раствора DSS на 3-й, 6-й и 9-й неделях, и мыши свободно пили в течение этого периода.
   1. Приготовьте 2% раствор ДСС, добавив 500 мл стерильной дистиллированной воды к 10 г ДСС (см. Таблицу материалов). Смешайте вихревым миксером и храните при температуре 4 °C до использования.
   2. Каждая мышь, индуцированная АОМ, свободно выпивает 500 мл 2% раствора ДСС в течение 7 дней на 3-й, 6-й и 9-й неделях после индукции АОМ.

3. Медикаментозное лечение

ПРИМЕЧАНИЕ: Взрослым людям необходимо 63 г LJZD в день. Согласно формуле пересчета экспериментальной дозы препарата для мышей и человека, эквивалентная экспериментальная доза для мышей (мг/кг) = доза человека (мг/кг)/масса тела (60 кг) х 9,1, суточная доза мышей составила около 9,6 г/кг.

1. На 7-й и 15-й неделях на 7-й и 15-й неделе соответственно лечат группу LJZD и группы 5-ASA 0,1 мл/10 г приготовленного раствора LJZD и 5-ASA через желудочный зонд.
   1. Для внутрижелудочного введения мышам выполняют следующую процедуру. Держите мышь в левой руке, а в правой держите аппарат перфузии желудка. Вставьте иглу шприца в рот и сдвиньте ее вниз по задней стенке глотки мышей. Скользите вниз по глотке, пока мыши глотают, и продолжайте двигаться вперед. Когда возникнет ощущение сопротивления, и шприц можно будет протолкнуть в глотку, вытащите иглу и завершите укол.
2. Обработайте контрольную и модельную группы одинаковым количеством физиологического раствора (см. Таблицу материалов).
3. Мышей в каждой группе обрабатывают соответствующим препаратом один раз в сутки в одно и то же время в течение периода введения.

4. Оценка модели UC-CRC и эффективности LJZD

1. Оценка индекса активности заболевания
   ПРИМЕЧАНИЕ: Согласно таблице 2, индекс активности заболевания (DAI) оценивали путем объединения потери веса, вязкости кала и кровотечения из кала мышей.
   1. Записывайте вес мышей ежедневно от начала адаптивного кормления до окончания медикаментозного лечения.
   2. Внимательно наблюдайте за консистенцией кала каждой подопытной мыши и записывайте испражнения как одно из трех состояний: нормальный, жидкий стул и водянистая диарея.
   3. Запишите фекальное кровотечение у экспериментальных животных как одно из трех состояний: отсутствие кровотечения, небольшое кровотечение и видимая кровь в стуле.
2. Определение уровня IL-6 в сыворотке крови
   1. Лечите мышей LJZD или 5-ASA в течение 9 недель. Зафиксируйте мышей, взявшись левой рукой за кожу шеи мыши и осторожно надавливая на экспериментальный стол, чтобы принять положение бокового пролежня. Отрежьте ножницами усы мышей. Аккуратно срежьте мышам усы ножницами (см. Таблицу материалов), чтобы не допустить заражения крови.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Мыши, которые не могли свободно покачиваться, считались правильно зафиксированными. Если этого не происходит, мышей следует зафиксировать.
   2. Обезболивайте мышь ингаляцией 2% изофлурана. Простерилизуйте кожу вокруг глазного яблока этанолом (см. Таблицу материалов). Осторожно надавите на кожу глаз сбоку, чтобы глазное яблоко было заложено и выпячивалось.
   3. Зажмите глазное яблоко локтевым пинцетом и извлеките глазные яблоки аккуратно и быстро. Дайте крови стечь в центробежную трубку (см. Таблицу материалов). В процессе нажимайте на сердце мыши, чтобы ускорить сбор крови.
   4. Собранную кровь хранят при комнатной температуре в течение 30 минут и центрифугируют ее при 3500 x g в течение 10 минут. Соберите надосадочную жидкость и определите уровень IL-6 в соответствии с инструкцией к набору для определения содержания IL-6 (см. Таблицу материалов).
3. Разделение колоректальной ткани
   1. Усыпляют мышей после забора крови путем вдыхания 5% передозировки изофлурана и вывиха шейки матки (см. Таблицу материалов) в соответствии с этикой животных.
   2. Держите мышей в криогенной анатомической среде. Обездвижите мышей в положении лежа на спине. Обрежьте ножницами волосы в нижней части живота и простерилизуйте их этанолом.
   3. Зажмите точку пересечения двух корешков бедра и средней линии живота щипцами для век (см. Таблицу материалов). Сделайте ножницами поперечный разрез примерно 1-1,5 см.
   4. Обрежьте продольный разрез по срединной линии живота от середины поперечного разреза по направлению к мечевидному отростку.
   5. Удалите околоректальные ткани в направлении анального отверстия, чтобы отделить толстую кишку от окружающих тканей. Будьте осторожны, чтобы не повредить колоректум.
   6. Отодвиньте кожу живота в стороны, чтобы полностью обнажить колоректум. Удалить колоректум из брюшной полости щипцами для век и отрезать сегменты от анального отверстия до слепой кишки (исключая); Общая длина около 10 см. Полученные колоректальные ткани хранят в физиологическом растворе при температуре 4 °С.
4. Оценка длины и веса прямой кишки
   1. Извлеките физиологический раствор при температуре 4 °C с помощью иглы объемом 5 мл (см. Таблицу материалов), чтобы промыть внутреннюю часть колоректума. Затем поместите колоректум на впитывающую бумагу, чтобы впитать влагу ткани.
   2. Взвесьте колоректальные ткани, а затем положите их на бумагу формата А4, чтобы измерить их длину.
5. Измерьте количество опухолей в толстой кисти
   1. Разрежьте толстую кишку вдоль, чтобы полностью развернуть ее, и понаблюдайте за количеством и размером опухолей в колоректуме.
6. Патологоанатомический анализ толстой кишки
   1. Зафиксируйте толстую кишку в 4% параформальдегиде на 24 ч. Неподвижная ткань прямой кишки помещается в расплавленный парафин и непрерывно разрезается толщиной 5 мкм с помощью микротома для замораживания тканей.
   2. Согласно методике Hou et ^al.24, срезы депарафинизируют в ксилоле, а затем обезвоживают последовательными концентрациями этанола. После окрашивания раствором гематоксилина в течение 5 мин промыть срезы чистой водой. После этого окрашивают 0,5% раствором эозина в течение 1 мин (см. Таблицу материалов).
   3. Снова выполните градиентное обезвоживание и прозрачную обработку ксилолом. Запечатайте срезы и осмотрите их под оптическим микроскопом (см. таблицу материалов) и сфотографируйте, как описано Xie et ^al.25.
7. Иммуногистохимический анализ толстой кишки
   1. Депарафинизируйте и обезвоживайте срезы в соответствии с вышеописанным методом. Репарировать антиген в срезах с помощью техники термической репарации под высоким давлением, как описано Gok et ^al.26.
   2. Замочите срезы в эндогенных блокаторах пероксидазы при комнатной температуре на 15 мин. Запечатайте срезы козьей сывороткой (см. Таблицу материалов).
   3. Добавьте в срезы первичные антитела ZO-1 (1:1000), окклюдин (1:1000) и KI67 (1:500; см. таблицу материалов) и инкубируйте в течение ночи при 4 °C. Срезы промывают буфером PBS (см. Таблицу материалов), добавляют к нему вторичные антитела общего назначения (1:5000; см. Таблицу материалов) и инкубируют при 37 °C в течение 30 мин.
   4. Добавьте решение DAB (см. Таблицу материалов) в разделы для разработки цвета. Окрасьте срезы раствором гематоксилина.
   5. Обезвоживайте, прозрачните и снова загерметизируйте секции. Наблюдайте за экспрессией белка с помощью оптического микроскопа.

Отвар ЛЖЗД готовили в соответствии с соотношением составов препаратов в таблице 1 и методом отваривания ТКМ на рисунке 1А. В соответствии с временным моментом, указанным на рисунке 1B, мышам внутрибрюшинно вводили 1 мг/мл АОМ на7-й день, и мышам предоставляли свободный доступ к питьевой воде, содержащей 2% DSS, на3-й,6-й и9-й неделях. Модель мыши UC-CRC была успешно создана на15-й неделе. Между тем, мышей лечили LJZD через зонд с 7-й по 15-ю неделю. Данные показали, что по сравнению с контрольной группой, в модельной группе ЯК-КРР наблюдалась значительная потеря массы тела, которая была смягчена лечением LJZD (рис. 2A, стр. < 0,01). В конце исследования лечение LJZD улучшило показатель DAI по сравнению с модельной группой UC-CRC (рис. 2B). По сравнению с контрольной группой, модельная группа ЯК-КРР имела более короткую колоректальную длину, которая была увеличена при лечении LJZD (рис. 2C, D, P < 0,01). Отношение массы толстой кишки к массе тела отражает развитие КРР у мышей, а более высокое соотношение указывает на развитие острой опухоли27. По сравнению с контрольной группой индекс колоректальных органов модельной группы был достоверно повышен, а лечение ЖЖЖД значительно снижало индекс колоректальных органов (рис. 2E, P < 0,05). Кроме того, лечение LJZD также ингибировало образование колоректальных опухолей (рис. 2F, P < 0,01) и уровень сывороточного провоспалительного фактора IL-628 (рис. 2G, P < 0,05).

Патологоанатомические результаты подтвердили, что по сравнению с контрольной группой, мыши в модельной группе UC-CRC имели более крупные колоректальные опухоли и сформировали аденокарциному, в то время как лечение LJZD уменьшало размер и степень опухоли (рис. 3). Иммуногистохимические данные показали, что лечение LJZD усиливало функцию колоректального барьера у мышей модели UC-CRC, о чем свидетельствует повышенная экспрессия белков ZO-1 и окклюдина29 (рис. 4). Параллельно лечение LJZD подавляло уровни экспрессии белка онкомаркера KI6730 (рис. 4).

Рисунок 1: Подготовка LJZD и создание мышиной модели рака колопроктита. А) Смесь Даншэнь (12 г), Байчжу (12 г), Ганьцао (6 г), Ченпи (12 г) и обработанного имбирем Бань Ся (9 г) погружали в 1000 мл дистиллированной воды комнатной температуры на 1 ч. 12 г порошка Фулинга замачивали в 300 мл дистиллированной воды комнатной температуры в течение 1 ч. Смесь вышеуказанных шести трав отваривали при 100 °C в течение 40 мин. (B) На 7-й день мышам C57BL/6J внутрибрюшинно вводили 1 мг/мл AOM. Мышам давали воду, содержащую 2% DSS, вволю на3-й,6-й и9-й неделях. С 7 по 15 недель мышам давали LJZD через зонд. Сокращения: АОМ, азометан; DAI, индекс активности заболевания; ДСС, декстран сульфат натрия; LJZD, отвар Люцзюньцзы; w, неделя. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этого рисунка.

Рисунок 2: Оценка модели UC-CRC и эффективности LJZD. (A) LJZD улучшил массу тела у мышей модели UC-CRC. (B) LJZD улучшил показатели DAI у мышей модели UC-CRC. (С, Г) LJZD увеличил длину толстой кишки у мышей модели UC-CRC. (E) LJZD снижал органный индекс толстой кишки у мышей модели UC-CRC. (F) LJZD ингибировал колоректальный опухолегенез у мышей модели колопроктита. (G) LJZD подавлял уровень IL-6 в сыворотке крови у мышей модели UC-CRC. #P< 0,05 и ##P< 0,01 по сравнению с контрольной группой; *P < 0,05 и **P< 0,01 по сравнению с модельной группой. Данные были выражены в виде среднего ± стандартных отклонений (n=10) и проанализированы методом одностороннего дисперсионного анализа (ANOVA) с последующим критерием Тьюки. P < 0,05 указывали на статистически значимую разницу. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этого рисунка.

Рисунок 3: Оценка патологических особенностей колоректальных тканей у мышей методом окрашивания гематоксилин-эозином. В контрольной группе патологических повреждений не выявлено. Опухолевая ткань модельной группы UC-CRC была большой и сформировала аденокарциному и неоплазию высокой степени злокачественности, в то время как в группе лечения LJZD опухолевая ткань была редуцирована, что сопровождалось небольшим количеством локальной аденомы и низкодифференцированной неоплазии. Черная стрелка обозначает предраковую диспластическую опухоль железы. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этого рисунка.

Рисунок 4: Влияние LJZD на функцию колоректального барьера и маркер рака у мышей модели UC-CRC. (A) Иммуногистохимические изображения ZO-1, окклюдина и KI67. (B) Статистические результаты экспрессии белков ZO-1, Окклюдина и KI67. Лечение LJZD увеличивало экспрессию функциональных белков колоректального барьера ZO-1 и окклюдина, в то время как уровень онкомаркера KI67 снижался у мышей модели UC-CRC. ## P < 0,01 по сравнению с контрольной группой; ** P < 0,01 по сравнению с модельной группой. Данные были выражены в виде среднего ± стандартных отклонений (n=10) и проанализированы методом одностороннего дисперсионного анализа (ANOVA) с последующим критерием Тьюки. P < 0,05 указывали на статистически значимую разницу. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этого рисунка.

Таблица 1: Состав и пропорции препаратов в ЖЖЖД.

Таблица 2: Оценка индекса активности заболевания для модели UC-CRC у мышей.

Авторам нечего раскрывать.