Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.

Методическая статья

Оценка цитотоксичности метаболитов типичных триазоловых пестицидов в организме растений

1.5K просмотров

⸱

DOI:

10.3791/66048

⸱

22 декабря 2023 г.

 ,  ,  ,  , 
1Key Laboratory of Microbial Control Technology for Industrial Pollution in Zhejiang Province, College of Environment, Zhejiang University of Technology, 2Research and Teaching Center of Agriculture, Zhejiang Open University, 3International Joint Research Center for Persistent Toxic Substances (IJRC-PTS), College of Environment, Zhejiang University of Technology

В этой статье

Краткое содержание

В протоколе описан новый метод оценки интегральной цитотоксичности метаболитов триазоловых пестицидов в растениях.

Аннотация

В результате антропогенной деятельности в окружающую среду попадают различные органические загрязнители. Эти загрязнители могут поглощаться сельскохозяйственными культурами, создавая потенциальные угрозы для экосистемы и здоровья человека на всех этапах пищевой цепи. Биотрансформация загрязняющих веществ в растениях приводит к образованию ряда метаболитов, которые могут быть более токсичными, чем их исходные соединения, что означает, что эти метаболиты следует учитывать при оценке токсичности. Тем не менее, метаболиты загрязняющих веществ в растениях чрезвычайно сложны, что затрудняет всестороннее получение токсикологической информации обо всех метаболитах. В этом исследовании была предложена стратегия оценки интегральной цитотоксичности метаболитов загрязнителей в растениях путем обработки их как целого во время токсикологических испытаний. Триазоловые пестициды, класс фунгицидов широкого спектра действия, широко применяются в сельскохозяйственном производстве. Загрязнение сельскохозяйственных угодий их остатками привлекает все большее внимание. Таким образом, в качестве исследуемых загрязнителей были выбраны четыре триазоловых пестицида, включая флусилазол, диниконазол, тебуконазол и пропиконазол. Метаболиты были получены в результате обработки морковной каллуса испытанными триазольными пестицидами. После обработки в течение 72 ч были экстрагированы метаболиты пестицидов в каллусе моркови, после чего были проведены токсикологические испытания с использованием клеточной линии Caco-2. Результаты показали, что метаболиты исследуемых пестицидов в каллусе моркови существенно не ингибировали жизнеспособность клеток Caco-2 (P>0,05), демонстрируя отсутствие цитотоксичности метаболитов пестицидов. Этот предлагаемый метод открывает новые возможности для оценки цитотоксичности метаболитов загрязнителей в растениях, что, как ожидается, предоставит ценные данные для точной оценки токсичности.

Введение

Сельскохозяйственные культуры, произрастающие на сельскохозяйственных угодьях, могут подвергаться воздействию различных органических загрязнителей, возникающих в результате антропогенной деятельности 1,2. Загрязняющие вещества могут поглощаться растениями, создавая дальнейшую угрозу для экосистемы и здоровья человека через пищевые цепи 3,4. Ксенобиотики в растениях, вероятно, претерпевают ряд биотрансформаций, таких как метаболизм фазы I иII5, генерируя ряд метаболитов. Согласно концепции зеленой печени у растений, метаболизм растений может снизить токсичность ксенобиотиков 6,7. Тем не менее, было выявлено, что токсичность некоторых метаболитов может быть выше, чем у их родителей. Например, доказано, что дебромированный продукт тетрабромбисфенола А (ТББПА) и О-метилированный продукт бисфенола А (БФА) гораздо более токсичны, чем ихродители8,9, а дебромирование и О-метилирование составляют основные пути метаболизма фазы I в растениях. Таким образом, оценка токсичности исключительно на основе родителей загрязнителей в растениях не является точной, в то время как следует учитывать соответствующие метаболиты.

Метаболиты ксенобиотиков в растениях чрезвычайно сложны10,11, что затрудняет их всестороннюю идентификацию и разделение. Кроме того, можно получить лишь несколько стандартов идентифицированных метаболитов. Следовательно, токсикологические данные по всем метаболитам недоступны, что затрудняет всестороннюю оценку токсичности. В этом исследовании была предложена стратегия оценки интегральной токсичности метаболитов загрязняющих веществ в растениях путем их обработки как единого целого во время токсикологических испытаний, что позволило получить новые данные для точной оценки токсичности загрязняющих веществ в растениях. Наше предыдущее исследование показало, что культура каллуса растений открывает простой и эффективный путь к получению метаболитов ксенобиотиков в растениях12. Соответственно, культура каллуса растений была использована в этом исследовании для получения метаболитов загрязняющих веществ в растениях с последующей химической экстракцией и токсикологическими испытаниями с использованием клеточной линии человека. Кишечный тракт является одним из непосредственных органов-мишеней ксенобиотиков, подвергающихся воздействию животных и человека. Клеточная линия Caco-2 оказалась лучшей моделью для исследования кишечного поведения и токсичности ксенобиотиков in vitro 13,14,15. Таким образом, в данном исследовании была выбрана модель клеток Caco-2.

Триазоловые пестициды, класс фунгицидов широкого спектра действия, широко применяются в сельскохозяйственном производстве16. Загрязнение сельскохозяйственных угодий их остатками привлекает все большее внимание17,18. Здесь в качестве типичных загрязнителей были выбраны четыре широко используемых триазоловых пестицида, включая флусилазол, диниконазол, тебуконазол и пропиконазол. Морковь была выбрана в этом исследовании в качестве репрезентативного растения для свежих, готовых к употреблению овощей. Морковная каллус первоначально подвергалась воздействию испытанных пестицидов в концентрации 100 мг/л. После экспозиции в течение 72 ч метаболиты экстрагировали для оценки цитотоксичности с использованием клеточной линии Caco-2. Этот метод может быть легко расширен для оценки интегральной цитотоксичности метаболитов других типов загрязнителей в растениях.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

1. Дифференциация морковной каллуса

Примечание: Подробный протокол дифференциации мозоли моркови был описан в предыдущем исследовании12. Вот краткое описание.

  1. Стерилизовать поверхность яровизированных семян 75% этанолом в течение 20 минут, а затем 20% H2O2 в течение 20 минут. Промойте дистиллированной водой не менее 3 раз.
  2. Высевают семена на безгормональную среду из агара-желли (1% по массе) Мурашиге и Скуга (MS) (pH =5,8, автоклавирование при 121 °C) и инкубируют их в течение 16 ч фотопериода (350 мкмоль/м2с) при 26 °C в течение 15 дней для формирования рассады.
  3. Соберите экспланты, разрезав гипокотиль и семядоль рассады на мелкие кусочки (0,5 см) и инкубируйте экспланты в среде MS, содержащей ауксимон 1 мг/л 2,4-дихлорфеноксиуксусной кислоты и фитокинин 0,5 мг/л 6-бензиламинопурина при 26 °C в темноте в течение 3-4 недель для индуцирования каллуса.
  4. Соберите каллус (около 1 см в диаметре, компактный) с помощью скальпелей и щипцов.

2. Обработка мозоли моркови пестицидами

  1. Флусилазол, диниконазол, тебуконазол и пропиконазол растворить по 10 мг в 100 мл стерильной среды МС с конечными концентрациями 100 мг/л (рН 5,6-7,0).
    ПРИМЕЧАНИЕ: Концентрация обработки испытуемых пестицидов была выбрана в качестве максимальной 50% концентрации ингибирования роста клеток (IC50) в клетке Caco-2.
  2. Смешайте 3 г морковной каллуса (с шага 1.4) с 10 мл приготовленных растворов пестицидов (с шага 2.1) в стеклянных колбах в стерильных условиях.
  3. Смешайте 3 г морковной каллуса (с шага 1.4) с 10 мл асептической среды MS в стеклянных колбах в стерильных условиях.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Все стеклянные колбы были автоклавными.
  4. Инкубируйте морковную каллус (из этапов 2.2 и 2.3) при 130 об/мин и 26 °C в темноте в течение 72 часов.
    Установите все процедуры в трех экземплярах.
  5. Соберите морковную мозоль из среды путем фильтрации с помощью фильтров из стекловолокна (0,45 мкм) после инкубации в течение 72 ч. Промойте мозоль сверхчистой водой 3 раза.
  6. Сублимационную сушку мозолей с помощью сублимационной сушилки при температуре -55 °C, а затем гомогенизацию с помощью высокопроизводительной шлифовальной машины для салфеток с частотой 70 Гц в течение 3 минут.

3. Химическая экстракция морковной каллуса

  1. Смешайте в центрифужной пробирке (10 мл) 0,2 г измельченного порошка лиофилизированной каллуса с 3 мл ацетонитрила.
  2. Проведите вихревую обработку центрифуги в течение 8 минут, а затем обработайте ее ультразвуком в течение 5 минут (150 Вт, 40 кГц).
  3. Соберите надосадочную жидкость с помощью пипетирования после центрифугирования при 8 000 x g при 4 °C в течение 10 минут.
  4. Повторите процедуру экстракции 3 раза и сгруппируйте экстракты в чистой центрифужной пробирке (10 мл).
  5. Сконцентрируйте собранные экстракты до сухости с помощью концентратора для продувки азотом при температуре 40 °C.
  6. Остатки экстрактов (начиная с шага 3.5) повторно растворить в 1 мл модифицированной Дульбекко среды Игла (DMEM) с 0,3% диметилсульфоксидом (DMSO).
    ПРИМЕЧАНИЕ: Остатки на этапе 3.6 были получены из экстрактов каллуса, обработанного пестицидами (из этапа 2.2).
  7. Повторно растворите остатки экстрактов (начиная с шага 3.5) с 1 мл DMEM с 0,3% ДМСО и растворите 1 мг флусилазола, диниконазола, тебуконазола и пропиконазола в 4 разных пробирках соответственно.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Остатки на шаге 3.7 были получены из экстрактов пустой каллуса (из шага 2.3).
    ПРИМЕЧАНИЕ: DMEM готовили из 10% фетальной бычьей сыворотки (FBS) и 1% антибиотиков (пенициллин и стрептомицин).

4. Реанимация клетки Caco-2

Примечание: Все реагенты и материалы, участвующие в тестах клеток Caco-2, были автоклавированы в течение 20 минут и стерилизованы под ультрафиолетовым светом в течение 2 часов.

  1. Извлеките пробирку для криоконсервации (для хранения замороженных клеток) из резервуара с жидким азотом и быстро перенесите ее на водяную баню при температуре 37 °C. Непрерывно встряхивайте его, чтобы замерзший раствор оттаял.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Избегайте попадания воды через крышку криоконсервационной трубки при встряхивании.
  2. Продезинфицируйте поверхность пробирки для криоконсервации 75% спиртом после того, как замерзший раствор оттает. Быстро переложите клеточный раствор в стерильную центрифужную пробирку с помощью пипетирования.
  3. Удалите надосадочную жидкость из пробирки для криоконсервации после центрифугирования при температуре 1 000 x g при 4 °C в течение 3 минут. Добавьте 1 мл DMEM и приостановите клетки, слегка постукивая и встряхивая.
  4. Перенесите клеточную суспензию (из шага 4.3) в стеклянную колбу с помощью пипетирования. Добавьте 5 мл DMEM в стеклянную колбу, и аккуратно встряхните стеклянную колбу, чтобы равномерно распределить клетки.
  5. Инкубируйте клетки в инкубаторе при температуре 37 °C с 5%CO2.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Шаги 4.2-4.4 выполнялись на очень чистой скамейке.

5. Прохождение ячейки Caco-2

  1. Выньте стеклянную колбу из инкубатора и выбросьте питательную среду, когда плотность клеток достигнет более 80%. Промойте клетки PBS 3x.
  2. Добавьте 1 мл раствора трипсин-ЭДТА и равномерно распределите его, чтобы обеспечить полный контакт с клетками.
  3. Удаляют пищеварительный раствор, когда клетки уменьшаются от прилипшей формы до небольшой круглой точки и не подвешиваются под наблюдением микроскопа (100-кратное увеличение). Осторожно постучите по стенке колбы, чтобы вызвать удаление ячеек.
  4. Добавьте 2 мл DMEM, повторите полоскание стенки колбы 10 раз, осторожно постучите по стенке колбы и переложите 1 мл клеточной суспензии в другую стеклянную колбу.
  5. Добавьте 5 мл DMEM в стеклянные колбы. Аккуратно постучите по стенке колбы, чтобы равномерно распределить ячейки.
  6. Инкубируйте клетки в инкубаторе при температуре 37 °C с 5%CO2. Заменяйте питательную среду свежей DMEM каждые 24 ч до тех пор, пока плотность клеток не превысит 80%.
  7. Повторяйте процедуры пассажа клеток до тех пор, пока не будет собрано достаточное количество клеток (примерно 2 x 106) для следующих тестов на воздействие.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Шаги 5.1-5.5 выполнялись на сверхчистой скамейке. Количество клеток определяли с помощью гемоцитометра19.

6. Экспозиция клетки Caco-2

  1. Извлеките стеклянные колбы (из пункта 5.7) из инкубатора и повторите шаги 5.1-5.4 для сбора ячеек.
  2. Осторожно постучите по стенке колбы, чтобы равномерно распределить клетки и перенести суспензию клеток в центрифужную пробирку (15 мл).
  3. Разбавляют клеточную суспензию (начиная со стадии 6.2) с помощью DMEM в сочетании с цитометрией до достижения клеточной плотности примерно 1 x 105 клеток/мл. Аккуратно постучите по стенке колбы, чтобы равномерно распределить ячейки.
  4. Добавьте 100 мкл PBS в наружные лунки 96-луночного планшета для предотвращения испарения питательной среды из-за краевого эффекта.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Непрерывно постукивайте по стенке центрифужной пробирки, чтобы поддерживать однородность клеточной суспензии.
  5. Добавьте 100 мкл клеточной суспензии (начиная с шага 6.3) в левую лунку 96-луночного планшета и дайте отдохнуть в течение 10 минут.
  6. Инкубируйте клетки в инкубаторе при 37 °C с 5%CO2 в течение 48 часов.
  7. Извлеките 96-луночный планшет из инкубатора после инкубации в течение 48 ч и выбросьте питательную среду.
  8. Установите группу метаболитов пестицидов, добавив по 100 мкл растворов (из шага 3.6) в каждую лунку.
    Примечание: В каждой лунке на этапе 6.8 метаболиты пестицидов были получены из родителей 0,1 мг.
  9. Установите родительскую группу пестицидов, добавив 100 мкл растворов (из шага 3.7) в каждую лунку для сравнения.
    ПРИМЕЧАНИЕ: В каждой лунке на этапе 6.9 содержали 0,1 мг пестицида-родителя.
  10. Установите холостой контроль, добавив 100 мкл DMEM с 0,3% ДМСО в каждую лунку. Используйте по шесть лунок для каждой группы (шаг 6.8-6.9).
  11. Инкубируйте клетки в инкубаторе при температуре 37 °C с 5%CO2 в течение 24 ч.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Шаги 6.1-6.5 и 6.7-6.10 выполнялись на сверхчистой скамье.

7. Оценка жизнеспособности клеток

  1. Извлеките из инкубатора планшет на 96 лунок (начиная с 6.11) и выбросьте питательную среду после выдержки в течение 24 часов. Промойте клетки PBS 2x.
  2. Добавьте по 100 мкл DMEM в каждую лунку, а затем добавьте по 10 мкл реагентов CCK-8. Аккуратно встряхните пластину, чтобы равномерно распределить ячейки.
  3. Инкубируйте клетки в инкубаторе при температуре 37 °C с 5%CO2 в течение 4 ч.
  4. Извлеките 96-луночный планшет из инкубатора после инкубации в течение 4 часов и измерьте оптическое поглощение (OD) на длине волны 450 нм с помощью флуоресцентного спектрофотометра.
  5. Рассчитайте жизнеспособность клеток по следующему уравнению:
    жизнеспособность клеток (%) = (Экспериментальная группа ОД - ОДДМЭМ) / (контроль ОД - ОДДМЭМ)×100%.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Шаги 7.1-7.2 выполнялись на сверхчистой скамье.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

На рисунке 1 представлена схема предложенного метода получения, экстракции и оценки цитотоксичности метаболитов пестицидов в каллусе моркови. На рисунке 2 представлены кривые поглощения и кинетики метаболизма испытуемых пестицидов, из которых мы можем видеть, что концентрации пестицидов в питательных средах экспоненциально снижались, в то время как концентрации пестицидов в морковной мозоли начали увеличиваться, достигая пика через 4 или 8 часов, с последующим п...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

Данный протокол был разработан для оценки интегральной цитотоксичности метаболитов триазоловых пестицидов в растениях путем объединения моделей каллуса растений и клеток человека. Важнейшими шагами для этого предлагаемого протокола являются культивирование каллуса растения и клетки Caco-2. Наиболее сложная часть и относительные советы по выращиванию каллусов были даны в нашем предыдущем исследовании12. Здесь следует отметить, что поддержание клеток является самой ...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

Авторам нечего раскрывать.

Благодарности

Это исследование было поддержано Национальным фондом естественных наук Китая (21976160) и Исследовательским проектом по применению технологий общественного благосостояния провинции Чжэцзян (LGF21B070006).

     

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
2,4-дихлорфеноксиуксусная кислотаWAKO1 мг/л
20% H2O2Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd.10011218-500ML
6-бензиламинопуринWAKO0,5 мг/л
75% этанолSinopharm Chemical Reagent Co., Ltd.1269101-500 мл
96-луночный планшетThermo Fisher
АцетонитрилSigma-Aldrich
Инкубатор искусственного климатаNingbo DongNan Lab Equipment Co.,LtdRDN-1000A-4
АвтоклавыSTIKMJ-Series
Caco-2 клеткиNuoyang Biotechnology Co.,Ltd.
Реактивы CCK8Nanjing Jiancheng Bioengineering Institute, КитайG021-1-3
ЦентрифугаThermo Fisher
CO2 инкубаторLabtripHWJ-3-160
ДиметилсульфоксидSolarbio Life SciencesD8371
Диниконазол, 98,7%J& K Scientific83657-24-3
Модифицированная среда Дульбекко Eagle's SolarbioLife Sciences11965-500 мл
электронные весыShanghai Precision Instrument Co., LtdFA1004B
Фетальная бычья сывороткаCellmax
Флуоресцентный спектрофотометрTecanInfinite M200
Флусилазол, 98,5%J& К Научный85509-19-9   
Сублимационная сушилкаSCIENTZ
Высокопроизводительная тканевая мельницаSCIENTZ
Инвертированный микроскопLeica BiosystemsDMi1
Milli-Q systemMillipore MS1922801-4 л
Murashige & Среда SkoogHOPEBIOHB8469-7
Концентратор для продувки азотомAOSHENGMD200-2
PBSSolarbio Life SciencesP1022-500 мл
Пенициллин-стрептомицин жидкийSolarbio Life SciencesP1400-100 мл
Пропиконазол, 100%J& К Научный60207-90-1 
Research plusEppendorf10-1000 μ L
Семена моркови с мизинцем (Daucus carota var. sativus)Shouguang Seed Industry Co., Ltd
Встряхивающие инкубаторыShanghai bluepard instruments Co., Ltd.THZ-98AB
Тебуконазол, 100%J& K Scientific107534-96-3
Трипсин-ЭДТА растворSolarbio Life SciencesT1300-100 мл
Ультразвуковой аппаратZKIUC-6
УФ-стерилизованный супер чистый стендAIRTECH
Vortex инструментWuxi Laipu Instrument Equipment Co., LtdBV-1010

Ссылки

  1. Fan, Y., et al. Uptake of halogenated organic compounds (HOCs) into peanut and corn during the whole life cycle grown in an agricultural field. Environ Pollut. 263, 114400(2020).
  2. Wu, Q., et al. Trace metals in e-waste lead to serious health risk through consumption of rice growing near an abandoned e-waste recycling site: Comparisons with PBDEs and AHFRs. Environ Pollut. 247, 46-54 (2019).
  3. Liu, A. F., et al. Tetrabromobisphenol-A/S and nine novel analogs in biological samples from the Chinese Bohai Sea: Implications for trophic transfer. Environ Sci Technol. 50 (8), 4203-4211 (2016).
  4. Awasthi, A. K., Zeng, X., Li, J. Environmental pollution of electronic waste recycling in India: A critical review. Environ Pollut. 211, 259-270 (2016).
  5. Zhang, Q., et al. Plant accumulation and transformation of brominated and organophosphate flame retardants: A review. Environ Pollut. 288, 117742(2021).
  6. Sandermann, H. Higher plant metabolism of xenobiotics: the 'green liver' concept. Pharmacogenetics. 4, 225-241 (1994).
  7. Zhang, J. J., Yang, H. Metabolism and detoxification of pesticides in plants. Sci Total Environ. 790, 148034(2021).
  8. Debenest, T., et al. Ecotoxicity of a brominated flame retardant (tetrabromobisphenol A) and its derivatives to aquatic organisms. Comp Biochem Phys C. 152 (4), 407-412 (2010).
  9. McCormick, J. M., Van Es, T., Cooper, K. R., White, L. A., Haggblom, M. M. Microbially mediated O-methylation of bisphenol A results in metabolites with increased toxicity to the developing zebrafish (Danio rerio) embryo. Environ Sci Technol. 45 (15), 6567-6574 (2011).
  10. Zhang, Q., et al. Multiple metabolic pathways of 2,4,6-tribromophenol in rice plants. Environ Sci Technol. 53 (13), 7473-7482 (2019).
  11. Hou, X., et al. Glycosylation of tetrabromobisphenol A in pumpkin. Environ Sci Technol. 53 (15), 8805-8812 (2019).
  12. Wu, J., et al. Elucidating the metabolism of 2,4-Dibromophenol in plants. J Vis Exp. (192), e65089(2023).
  13. Zucco, F., et al. An Inter-laboratory study to evaluate the effects of medium composition on the differentiation and barrier function of Caco-2 cell lines. Atla-Altern Lab Anim. 33, 603-618 (2005).
  14. Eisenbrand, G., et al. Methods of in vitro toxicology. Food Chem Toxicol. 40, 193-236 (2002).
  15. Sambuy, Y., et al. The Caco-2 cell line as a model of the intestinal barrier: influence of cell and culture-related factors on Caco-2 cell functional characteristics. Cell Biol Toxicol. 21, 1-26 (2005).
  16. Li, H., et al. Uptake, translocation, and subcellular distribution of three triazole pesticides in rice. Environ Sci Pollut Res. 29 (17), 25581-25590 (2022).
  17. Satapute, P., Kamble, M. V., Adhikari, S. S., Jogaiah, S. Influence of triazole pesticides on tillage soil microbial populations and metabolic changes. Sci Total Environ. 651, 2334-2344 (2019).
  18. Xu, Y., et al. A possible but unrecognized risk of acceptable daily intake dose triazole pesticides exposure-bile acid disturbance induced pharmacokinetic changes of oral medication. Chemosphere. 322, 138209(2023).
  19. Louis, K. S., Siegel, A. C. Cell viability analysis using trypan blue: manual and automated methods. Methods Mol Biol. 740, 7-12 (2011).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Больше статей

Метаболиты триазольных пестицидовоценка цитотоксичностикультура каллуса растенийбиотрансформация пестицидовклеточная линия Caco-2анализ остатков пестицидовтоксикологическое тестированиеэкстракция из каллуса морковианализ жизнеспособности клетокреагент CCK8
Оценка цитотоксичности метаболитов типичных триазоловых пестицидов в организме растений
Связаться с нами
Порекомендовать библиотеке

Конфиденциальность

Условия использования

Политики

© 2026 MyJoVE Corporation. Все права защищены.