Методическая статья

Трехмерное акустическое сборочное устройство для массового производства клеточных сфероидов

DOI:

10.3791/66078

⸱

13 октября 2023 г.

 ,  ,  , 
1School of Automation, Hangzhou Dianzi University, 2Key Laboratory of Medical Information and 3D Bioprinting of Zhejiang Province, Hangzhou Dianzi University

В этой статье

Краткое содержание

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Клеточные сфероиды рассматривались как одна из потенциальных моделей в области биологических приложений. В данной статье описываются протоколы для масштабируемой генерации клеточных сфероидов с использованием 3D-акустического сборочного устройства, которое обеспечивает эффективный метод надежного и быстрого изготовления однородных клеточных сфероидов.

Аннотация

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Клеточные сфероиды являются перспективными трехмерными (3D) моделями, получившими широкое применение во многих областях биологии. В этом протоколе представлен метод изготовления высококачественных и высокопроизводительных клеточных сфероидов с использованием устройства 3D-акустической сборки с помощью маневренных процедур. Устройство акустической сборки состоит из трех преобразователей из титаната цирконата свинца (PZT), каждый из которых расположен в плоскости X/Y/Z квадратной камеры из полиметилметакрилата (ПММА). Эта конфигурация позволяет генерировать 3D-точечную матрицу левитирующих акустических узлов (ЛВС) при подаче трех сигналов. В результате ячейки в растворе желатина метакрилоила (GelMA) могут быть перемещены в ЛВС, образуя однородные клеточные агрегаты в трех измерениях. Затем раствор GelMA подвергается УФ-фотоотверждению и сшивается в качестве каркаса, поддерживающего рост клеточных агрегатов. Наконец, массы зрелых сфероидов получают и извлекают путем последующего растворения скаффолдов GelMA в мягких условиях. Предлагаемое новое 3D-устройство для сборки акустических клеток позволит масштабировать производство клеточных сфероидов и даже органоидов, предлагая большой потенциал технологии в биологической области.

Введение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

3D-модели культивирования in vitro, которые обеспечивают больше структурных и морфологических характеристик in vivo по сравнению с обычными 2D-моделями культивирования, были признаны перспективными системами в различных биомедицинских приложениях, таких как тканевая инженерия, моделирование заболеваний и скрининг лекарств 1,2,3. Как один из типов 3D-модели культуры, клеточные сфероиды обычно относятся к клеточной агрегации, создавая трехмерные сфероидальные структуры, характеризующиеся усиленными межклеточными и межклеточными и межклеточными матриксными взаимодействиями 4,5,6. Таким образом, изготовление клеточных сфероидов стало мощным инструментом для проведения разнообразных биологических исследований.

Для получения сфероидов были разработаны различные методы, в том числе подвесная капля7, неадгезивные пластины8 или устройства9 с микролунками. В принципе, эти методы обычно облегчают сборку клеток, используя физические силы, такие как гравитационная сила, при этом сводя к минимуму взаимодействия между клетками и субстратом. Однако они часто связаны с трудоемкими процессами, имеют низкую производительность и создают проблемы для управления размером сфероида 10,11. Важно отметить, что производство сфероидов желаемого размера и однородности в достаточном количестве имеет первостепенное значение для удовлетворения конкретных биологических задач. В отличие от вышеупомянутых методов, акустические волны, как один из видов техники, управляемой внешней силой 12,13,14, показали потенциал для массового производства клеточных сфероидов с высоким качеством и пропускной способностью, основанных на принципе усиления агрегации клеток за счет внешних сил 15,16,17,18. В отличие от электромагнитных или магнитных сил, акустические методы манипулирования клетками являются неинвазивными и не требуют меток, что позволяет формировать сфероиды с отличной биосовместимостью19,20.

Как правило, для генерации сфероидов разрабатываются устройства, основанные на акустических волнах стоячей поверхности (ПАВ) и объемных акустических волнах (БАВ), с использованием акустических узлов (АН), создаваемых соответствующими стоячими акустическими полями 21,22,23. В частности, акустические сборочные устройства на основе БАВ, обладающие такими достоинствами, как удобство изготовления, простота эксплуатации и отличная масштабируемость, привлекли внимание изготовлением сфероидов ячеек24,25. Недавно мы разработали легкое акустическое сборочное устройство на основе BAWs, способное генерировать сфероиды с высокой пропускной способностью26. Предлагаемое устройство состоит из квадратной камеры из полиметилметакрилата (ПММА) с тремя преобразователями цирконат-титаната (ПЗТ), расположенными соответственно в плоскости X/Y/Z. Такая компоновка позволяет создавать 3D-точечную матрицу левитирующих акустических узлов (ЛВС) для сборки ячеек. По сравнению с ранее описанными устройствами на основе BAW или SAW, которые могут создавать только 1D или 2D массив ANs 27,28,29, настоящее устройство позволяет создавать 3D точечный массив локальных сетей для быстрого образования клеточных агрегатов в растворе желатина метакрилоила (GelMA). Впоследствии клеточные агрегаты созревали в сфероиды с высокой жизнеспособностью в фотоотвержденных скаффолдах GelMA после трех дней культивирования. Наконец, большое количество сфероидов одинакового размера было легко получено из скаффолдов GelMA для последующих применений.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Изготовление устройства 3D акустической сборки

  1. Начните с подготовки четырех листов ПММА толщиной 1 мм с помощью лазерной резки30, а затем склейте их вместе, чтобы сформировать квадратную камеру с внутренней шириной 21 мм и высотой 10 мм.
  2. Затем прикрепите еще один лист ПММА толщиной 1 мм к нижней части камеры, который будет служить держателем для биочернил.
  3. Аккуратно прикрепите три преобразователя из цирконат-титаната (PZT) (каждый размером 20 мм в длину, 10 мм в ширину, 0,7 мм в толщину и с первичной резонансной частотой 3 МГц, см. таблицу материалов) к внешней стороне трех ортогональных стенок камеры соответственно. Убедитесь, что нижний датчик PZT находится по центру под камерой.
  4. Припаяйте провода к двум токопроводящим областям каждого преобразователя PZT.
  5. Наконец, закрепите устройство на полом основании, чтобы нижняя часть PZT не соприкасалась с другими столешницами.

2. Настройка акустической системы сборки

  1. Начните с установки акустического устройства на столик микроскопа, что позволит наблюдать за внутренним пространством камеры с высоты птичьего полета.
  2. Расположите цифровой микроскоп на стороне устройства, свободной от преобразователей PZT, что позволит наблюдать за внутренней частью камеры сбоку.
  3. Независимо друг от друга подключите последовательно провода от трех преобразователей PZT к трем усилителям мощности и трем выходным каналам генераторов функций (см. таблицу материалов).
  4. Запрограммируйте настройки генераторов функций для каждого преобразователя PZT, указав такие параметры, как синусоидальная форма сигнала, частота и амплитуда.
  5. Для обеспечения стерилизации заполняют камеру акустического устройства 75% спиртом на 5 мин с последующей тщательной очисткой стерильным раствором PBS. Затем облучайте камеру ультрафиолетовым светом в чистом помещении в течение не менее 1 часа.

3. Культивирование клеток и процедура сбора урожая

  1. Начните с культивирования клеток С3А, клеточной линии гепатоцеллюлярной карциномы человека, в колбе с клеточной культурой Т25 с использованием модифицированной среды Eagle (DMEM) компании Dulbecco, дополненной 10% фетальной бычьей сывороткой и 1% пенициллин-стрептомицином (см. таблицу материалов).
  2. Когда клетки C3A достигнут примерно 80% слияния, проводят клеточный пассаж следующим образом: сначала дважды промывают дно колбы для культивирования PBS. Затем добавьте 2 мл 0,05% трипсина-ЭДТА в колбу для клеточной культуры и инкубируйте при 37 °C, чтобы облегчить отслоение клеток. Остановите процесс трипсинизации, добавив 2 мл полной питательной среды.
  3. Перелейте клеточный раствор в пробирку объемом 15 мл и центрифугируйте его при 200 × г в течение 5 мин при комнатной температуре до получения клеточной гранулы.

4. Приготовление биочернил

  1. Готовят 6%-ный (массовый) раствор GelMA, содержащий 0,5% (w/v) лития-фенил-2,4,6-триметилбензоилфосфинат (LAP), растворяя 0,3 г GelMA и 0,025 г LAP (см. таблицу материалов) в 5 мл фосфатного буферного раствора (PBS). Оставьте смесь на водяной бане с температурой 47 °C в течение 1 часа.
  2. Перед смешиванием с клетками раствор GelMA пропускают через фильтр 0,22 мкм (см. Таблицу материалов) для стерилизации.
  3. Ресуспендируйте клеточную гранулу, упомянутую выше (шаг 3.3), в питательной среде. Окрасьте небольшой объем клеток 0,4% раствором трипанового синего, а затем используйте чистый гемоцитометр для подсчета клеток.
  4. Смешайте соответствующее количество клеток C3A, рассчитанное на основе плотности клеток, полученной выше, со стерилизованным раствором GelMA для получения биочернил с плотностью клеток 2 × 106 клеток/мл.
  5. Для визуализации собранных клеточных сфероидов предварительно окрасьте клетки C3A, инкубируя их клеточным трекером 2 мкМ (краситель DiO, см. таблицу материалов) при 37 °C в течение 20 мин. В дальнейшем меченые клетки трижды промывают свежей питательной средой для клеточных культур.

5. Сборка сфероидов клеток с помощью акустического устройства

  1. Пипеткой более 1 мл биочернил в стерилизованную камеру. Убедитесь, что расстояние лицом к лицу между поверхностью жидкости и дном камеры кратно половине длины акустической волны.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Это расстояние можно контролировать, регулируя объем добавляемых биочернил. Акустическую длину волны (λ) можно оценить по формуле λ = c/f, где c — скорость звука в среде, а f — частота преобразователя PZT.
  2. Включите генератор функций и усилитель мощности, чтобы инициировать срабатывание каждого преобразователя PZT.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Рекомендуется сначала индивидуально приводить в действие каждый преобразователь PZT для достижения оптимальной параллельной ячеистой диаграммы. Этого можно достичь, выполнив развертку частоты с шагом 0,001 МГц вблизи первичной резонансной частоты для каждого преобразователя PZT. После этого одновременно подайте эти оптимальные сигналы на все три преобразователя PZT, чтобы получить ожидаемый 3D-точечный ячеистый рисунок. Перед подачей каждого входного сигнала убедитесь, что клетки равномерно распределены в биочернилах путем мягкого перемешивания.
  3. Сшить биочернила с помощью синего света (405 нм, 60 мВт/см2, 30 с) для создания 3D-гидрогелевого каркаса, который инкапсулирует клеточные агрегаты, собранные акустически. После этого выключите генератор функций и усилитель мощности.
  4. Аккуратно перенесите 3D-гидрогелевый каркас из камеры в чашку Петри и нарежьте его на небольшие кусочки (например, 2 мм × 2 мм × 2 мм) с помощью чистой бритвы.
  5. Добавьте питательную среду для культивирования.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Не забывайте менять питательную среду каждый день.

6. Извлечение клеточных сфероидов

  1. Начните с наблюдения за образованием сфероидов в разных слоях скаффолдов с помощью инвертированного микроскопа.
  2. Через 3 дня культивирования удалить питательную среду и дважды тщательно промыть гидрогелевые скаффолды PBS.
  3. Инкубируют скаффолды с более чем 2 мл лизисного буфера GelMA в разведении 1:200 со средой для клеточных культур в течение 30 мин в клеточном инкубаторе. Этот этап направлен на растворение гидрогелевых каркасов.
  4. Перелейте раствор из предыдущего шага в пробирку, а затем центрифугируйте его при 200 × г в течение 5 мин при комнатной температуре до получения гранулы сфероида ячейки.
  5. Выбросьте надосадочную жидкость и повторно суспендируйте гранулу в свежей питательной среде для последующего применения.

7. Анализ жизнеспособности сфероида

  1. Оцените жизнеспособность клеточных сфероидов либо в гидрогелевых каркасах, либо в извлеченных сфероидах с помощью набора для окрашивания живых/мертвых (см. таблицу материалов).
  2. Инкубируют образцы в разные моменты времени культивирования с 1 мл раствора PBS, содержащего 1 мкл кальцеина-AM и 2 мкл йодида пропидия (PI), в течение 15 мин при 37 °C.
  3. Для образцов внутри гидрогелевых каркасов промойте их непосредственно PBS дважды. Для извлеченных сфероидов центрифугу при 200 × г в течение 5 мин при комнатной температуре до получения гранулы сфероида и дважды промывают ее перед наблюдением.
  4. Осмотрите образцы с помощью флуоресцентного микроскопа и сделайте флуоресцентные изображения.
  5. Рассчитайте отношение площади, окрашенной кальцеином-AM, к общей площади, окрашенной как кальцеином-AM, так и PI, используя ImageJ для определения жизнеспособности сфероида.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

В этом исследовании было разработано устройство 3D-акустической сборки для массового производства клеточных сфероидов. Акустическое устройство состояло из квадратной камеры с двумя преобразователями PZT, прикрепленными к плоскостям X и Y на внешней поверхности камеры, и одним преобразователем PZT на нижней части камеры (рис. 1A, B). Три выходных канала от двух функциональных генераторов были подключены к трем усилителям мощности для генерации трех независимо синусоидальных с...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Эффективное и стабильное изготовление клеточных сфероидов с высокой пропускной способностью с использованием таких технологий, как устройство 3D-акустической сборки, имеет большие перспективы для развития биомедицинской инженерии и скрининга лекарств 1,2,3. Такой подход упрощает массовое производство клеточных сфероидов с помощью простых процедур.

Тем не менее, существуют критические факторы, которые ...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Авторам нечего раскрывать.

Благодарности

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Работа была поддержана Национальной ключевой программой исследований и разработок Китая (2022YFA1104600) и Фондом естественных наук провинции Чжэцзян Китая (LQ23H160011).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
0,22-μ m фильтрMerckSLGSM33SSИспользуется для стерилизации раствором GelMA
Чашка для культивирования клеток 35 мм Corning430165Используется для культивирования клеток
Конфокальный микроскопNikonA1RHD25Флуоресцентное наблюдение за клетками
DiO красительBeyotimeC1038Краситель используется для окрашивания клеток
DMEMGibco12430054Среды для культивирования клеток
FBSGibco10099141CДобавка к питательной среде для клеточных культур
Генератор функцийRigolDG5352Для генерации радиочастотных сигналов
GelMARegenovononeИспользуется для приготовления биочернил
Буфер для лизисаGelMA EFLEFL-GM-LS-001Используется для растворения скаффолдов GelMA
Инвертированный микроскопNikonTi-UНаблюдение за клетками
LAPSigma-Aldrich900889Используется в качестве фотоинициатора
Набор для живых умершихBeyotimeC2015MАнализ жизнеспособности клеток
PBSGibco10010002Используется в качестве буфера
Пенициллин-стрептомицинGibco15070063Предотвращение загрязнения клеточной культуры
Мощность усилителяМинисхемаLCY-22+Увеличение амплитуда напряжения радиочастотного сигнала
PZT преобразователиYantai Xingzhiwen Trading Co.,Ltd.PZT-41Функциональные узлы для акустической сборки устройства
T25 для культивирования клеточных культур колбаCorning430639Используется для культивирования клеток
Trypan blue Gibco15250061Подсчет клеток
Trypsin-EDTA Gibco25200056фермент диссоциации клеток
питания

Ссылки

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Eiraku, M., et al. Self-organizing optic-cup morphogenesis in three-dimensional culture. Nature. 472 (7341), 51-56 (2011).
  2. Lancaster, M. A., Knoblich, J. A. Organogenesis in a dish: modeling development and disease using organoid technologies. Science. 345 (6194), 1247125(2014).
  3. Habanjar, O., Diab-Assaf, M., Caldefie-Chezet, F., Delort, L. 3D cell culture systems: tumor application, advantages, and disadvantages. International Journal of Molecular Sciences. 22 (22), 12200(2021).
  4. Decarli, M. C., et al. Cell spheroids as a versatile research platform: formation mechanisms, high throughput production, characterization and applications. Biofabrication. 13 (3), 032002(2021).
  5. Lee, Y. B., et al. Engineering spheroids potentiating cell-cell and cell-ECM interactions by self-assembly of stem cell microlayer. Biomaterials. 165, 105-120 (2018).
  6. Zhuang, P., Chiang, Y. H., Fernanda, M. S., He, M. Using spheroids as building blocks towards 3d bioprinting of tumor microenvironment. International Journal of Bioprinting. 7 (4), 444(2021).
  7. Foty, R. A simple hanging drop cell culture protocol for generation of 3D spheroids. Journal of Visualized Experiments. 51, e2720(2011).
  8. Laschke, M. W., Menger, M. D. Life is 3D: boosting spheroid function for tissue engineering. Trends in Biotechnology. 35 (2), 133-144 (2017).
  9. Fu, W., et al. Combinatorial drug screening based on massive 3d tumor cultures using micropatterned array chips. Analytical Chemistry. 95 (4), 2504-2512 (2023).
  10. Kang, S. M., Kim, D., Lee, J. H., Takayama, S., Park, J. Y. Engineered microsystems for spheroid and organoid studies. Advanced Healthcare Materials. 10 (2), 2001284(2021).
  11. Kim, S. J., Kim, E. M., Yamamoto, M., Park, H., Shin, H. Engineering multi-cellular spheroids for tissue engineering and regenerative medicine. Advanced Healthcare Materials. 9 (23), 2000608(2020).
  12. Yang, Y., et al. 3D acoustic manipulation of living cells and organisms based On 2D array. IEEE Transactions on Biomedical Engineering. 69 (7), 2342-2352 (2022).
  13. Armstrong, J. P. K., et al. Engineering anisotropic muscle tissue using acoustic cell patterning. Advanced Materials. 30 (43), 1802649(2018).
  14. Drinkwater, B. W. A perspective on acoustical tweezers-devices, forces, and biomedical applications. Applied Physics Letters. 117 (18), 180501(2020).
  15. Bouyer, C., et al. A Bio-Acoustic Levitational (BAL) assembly method for engineering of multilayered, 3d brain-like constructs, using human embryonic stem cell derived neuro-progenitors. Advanced Materials. 28 (1), 161-167 (2016).
  16. Chansoria, P., Narayanan, L. K., Schuchard, K., Shirwaiker, R. Ultrasound-assisted biofabrication and bioprinting of preferentially aligned three-dimensional cellular constructs. Biofabrication. 11 (3), 035015(2019).
  17. Wu, Y., et al. Acoustic assembly of cell spheroids in disposable capillaries. Nanotechnology. 29 (50), 504006(2018).
  18. Hu, X., et al. On-chip hydrogel arrays individually encapsulating acoustic formed multicellular aggregates for high throughput drug testing. Lab on a Chip. 20 (12), 2228-2236 (2020).
  19. Wu, Z., et al. The acoustofluidic focusing and separation of rare tumor cells using transparent lithium niobate transducers. Lab on a Chip. 19 (23), 3922-3930 (2019).
  20. Chen, B., et al. High-throughput acoustofluidic fabrication of tumor spheroids. Lab on a Chip. 19 (10), 1755-1763 (2019).
  21. Sriphutkiat, Y., Kasetsirikul, S., Zhou, Y. Formation of cell spheroids using Standing Surface Acoustic Wave (SSAW). International Journal of Bioprinting. 4 (1), 130(2018).
  22. Guex, A. G., Di Marzio, N., Eglin, D., Alini, M., Serra, T. The waves that make the pattern: a review on acoustic manipulation in biomedical research. Materials Today Bio. 10, 100110(2021).
  23. Harley, W. S., et al. Advances in biofabrication techniques towards functional bioprinted heterogeneous engineered tissues: A comprehensive review. Bioprinting. 23, 00147(2021).
  24. Yang, Y., Dejous, C., Hallil, H. Trends and applications of surface and bulk acoustic wave devices: a review. Micromachines (Basel). 14 (1), 43(2022).
  25. Ma, Z., et al. Acoustic holographic cell patterning in a biocompatible hydrogel). Advanced Materials. 32 (4), 1904181(2020).
  26. Miao, T. K., et al. High-throughput fabrication of cell spheroids with 3D acoustic assembly devices. International Journal of Bioprinting. 9 (4), 733(2023).
  27. Jeger-Madiot, N., et al. Self-organization and culture of Mesenchymal Stem Cell spheroids in acoustic levitation. Scientific Reports. 11 (1), 8355(2021).
  28. Cai, H., et al. Acoustofluidic assembly of 3D neurospheroids to model Alzheimer's disease. Analyst. 145 (19), 6243-6253 (2020).
  29. Mei, J., Zhang, N., Friend, J. Fabrication of surface acoustic wave devices on lithium niobate. Jove-Journal of Visualized Experiments. (160), e61013(2020).
  30. Niculescu, A. G., Chircov, C., Bîrcă, A. C., Grumezescu, A. M. Fabrication and applications of microfluidic devices: a review. International Journal of Molecular Sciences. 22 (4), 2011(2011).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на повторное использование текста или иллюстраций этой статьи JoVE

Запросить разрешение

Теги

GelMAPZT

Похожие статьи