Трехмерное акустическое сборочное устройство для массового производства клеточных сфероидов

3D-модели культивирования in vitro, которые обеспечивают больше структурных и морфологических характеристик in vivo по сравнению с обычными 2D-моделями культивирования, были признаны перспективными системами в различных биомедицинских приложениях, таких как тканевая инженерия, моделирование заболеваний и скрининг лекарств ^1,2,3. Как один из типов 3D-модели культуры, клеточные сфероиды обычно относятся к клеточной агрегации, создавая трехмерные сфероидальные структуры, характеризующиеся усиленными межклеточными и межклеточными и межклеточными матриксными взаимодействиями ^4,5,6. Таким образом, изготовление клеточных сфероидов стало мощным инструментом для проведения разнообразных биологических исследований.

Для получения сфероидов были разработаны различные методы, в том числе подвесная капля⁷, неадгезивные пластины⁸ или устройства⁹ с микролунками. В принципе, эти методы обычно облегчают сборку клеток, используя физические силы, такие как гравитационная сила, при этом сводя к минимуму взаимодействия между клетками и субстратом. Однако они часто связаны с трудоемкими процессами, имеют низкую производительность и создают проблемы для управления размером сфероида ^10,11. Важно отметить, что производство сфероидов желаемого размера и однородности в достаточном количестве имеет первостепенное значение для удовлетворения конкретных биологических задач. В отличие от вышеупомянутых методов, акустические волны, как один из видов техники, управляемой внешней силой 12,13,14, показали потенциал для массового производства клеточных сфероидов с высоким качеством и пропускной способностью, основанных на принципе усиления агрегации клеток за счет внешних сил 15,16,17,18. В отличие от электромагнитных или магнитных сил, акустические методы манипулирования клетками являются неинвазивными и не требуют меток, что позволяет формировать сфероиды с отличной биосовместимостью^19,20.

Как правило, для генерации сфероидов разрабатываются устройства, основанные на акустических волнах стоячей поверхности (ПАВ) и объемных акустических волнах (БАВ), с использованием акустических узлов (АН), создаваемых соответствующими стоячими акустическими полями 21,22,23. В частности, акустические сборочные устройства на основе БАВ, обладающие такими достоинствами, как удобство изготовления, простота эксплуатации и отличная масштабируемость, привлекли внимание изготовлением сфероидов ячеек^24,25. Недавно мы разработали легкое акустическое сборочное устройство на основе BAWs, способное генерировать сфероиды с высокой пропускной способностью²⁶. Предлагаемое устройство состоит из квадратной камеры из полиметилметакрилата (ПММА) с тремя преобразователями цирконат-титаната (ПЗТ), расположенными соответственно в плоскости X/Y/Z. Такая компоновка позволяет создавать 3D-точечную матрицу левитирующих акустических узлов (ЛВС) для сборки ячеек. По сравнению с ранее описанными устройствами на основе BAW или SAW, которые могут создавать только 1D или 2D массив ANs ^27,28,29, настоящее устройство позволяет создавать 3D точечный массив локальных сетей для быстрого образования клеточных агрегатов в растворе желатина метакрилоила (GelMA). Впоследствии клеточные агрегаты созревали в сфероиды с высокой жизнеспособностью в фотоотвержденных скаффолдах GelMA после трех дней культивирования. Наконец, большое количество сфероидов одинакового размера было легко получено из скаффолдов GelMA для последующих применений.

1. Изготовление устройства 3D акустической сборки

1. Начните с подготовки четырех листов ПММА толщиной 1 мм с помощью лазерной резки³⁰, а затем склейте их вместе, чтобы сформировать квадратную камеру с внутренней шириной 21 мм и высотой 10 мм.
2. Затем прикрепите еще один лист ПММА толщиной 1 мм к нижней части камеры, который будет служить держателем для биочернил.
3. Аккуратно прикрепите три преобразователя из цирконат-титаната (PZT) (каждый размером 20 мм в длину, 10 мм в ширину, 0,7 мм в толщину и с первичной резонансной частотой 3 МГц, см. таблицу материалов) к внешней стороне трех ортогональных стенок камеры соответственно. Убедитесь, что нижний датчик PZT находится по центру под камерой.
4. Припаяйте провода к двум токопроводящим областям каждого преобразователя PZT.
5. Наконец, закрепите устройство на полом основании, чтобы нижняя часть PZT не соприкасалась с другими столешницами.

2. Настройка акустической системы сборки

1. Начните с установки акустического устройства на столик микроскопа, что позволит наблюдать за внутренним пространством камеры с высоты птичьего полета.
2. Расположите цифровой микроскоп на стороне устройства, свободной от преобразователей PZT, что позволит наблюдать за внутренней частью камеры сбоку.
3. Независимо друг от друга подключите последовательно провода от трех преобразователей PZT к трем усилителям мощности и трем выходным каналам генераторов функций (см. таблицу материалов).
4. Запрограммируйте настройки генераторов функций для каждого преобразователя PZT, указав такие параметры, как синусоидальная форма сигнала, частота и амплитуда.
5. Для обеспечения стерилизации заполняют камеру акустического устройства 75% спиртом на 5 мин с последующей тщательной очисткой стерильным раствором PBS. Затем облучайте камеру ультрафиолетовым светом в чистом помещении в течение не менее 1 часа.

3. Культивирование клеток и процедура сбора урожая

1. Начните с культивирования клеток С3А, клеточной линии гепатоцеллюлярной карциномы человека, в колбе с клеточной культурой Т25 с использованием модифицированной среды Eagle (DMEM) компании Dulbecco, дополненной 10% фетальной бычьей сывороткой и 1% пенициллин-стрептомицином (см. таблицу материалов).
2. Когда клетки C3A достигнут примерно 80% слияния, проводят клеточный пассаж следующим образом: сначала дважды промывают дно колбы для культивирования PBS. Затем добавьте 2 мл 0,05% трипсина-ЭДТА в колбу для клеточной культуры и инкубируйте при 37 °C, чтобы облегчить отслоение клеток. Остановите процесс трипсинизации, добавив 2 мл полной питательной среды.
3. Перелейте клеточный раствор в пробирку объемом 15 мл и центрифугируйте его при 200 × г в течение 5 мин при комнатной температуре до получения клеточной гранулы.

4. Приготовление биочернил

1. Готовят 6%-ный (массовый) раствор GelMA, содержащий 0,5% (w/v) лития-фенил-2,4,6-триметилбензоилфосфинат (LAP), растворяя 0,3 г GelMA и 0,025 г LAP (см. таблицу материалов) в 5 мл фосфатного буферного раствора (PBS). Оставьте смесь на водяной бане с температурой 47 °C в течение 1 часа.
2. Перед смешиванием с клетками раствор GelMA пропускают через фильтр 0,22 мкм (см. Таблицу материалов) для стерилизации.
3. Ресуспендируйте клеточную гранулу, упомянутую выше (шаг 3.3), в питательной среде. Окрасьте небольшой объем клеток 0,4% раствором трипанового синего, а затем используйте чистый гемоцитометр для подсчета клеток.
4. Смешайте соответствующее количество клеток C3A, рассчитанное на основе плотности клеток, полученной выше, со стерилизованным раствором GelMA для получения биочернил с плотностью клеток 2 × 10⁶ клеток/мл.
5. Для визуализации собранных клеточных сфероидов предварительно окрасьте клетки C3A, инкубируя их клеточным трекером 2 мкМ (краситель DiO, см. таблицу материалов) при 37 °C в течение 20 мин. В дальнейшем меченые клетки трижды промывают свежей питательной средой для клеточных культур.

5. Сборка сфероидов клеток с помощью акустического устройства

1. Пипеткой более 1 мл биочернил в стерилизованную камеру. Убедитесь, что расстояние лицом к лицу между поверхностью жидкости и дном камеры кратно половине длины акустической волны.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Это расстояние можно контролировать, регулируя объем добавляемых биочернил. Акустическую длину волны (λ) можно оценить по формуле λ = c/f, где c — скорость звука в среде, а f — частота преобразователя PZT.
2. Включите генератор функций и усилитель мощности, чтобы инициировать срабатывание каждого преобразователя PZT.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Рекомендуется сначала индивидуально приводить в действие каждый преобразователь PZT для достижения оптимальной параллельной ячеистой диаграммы. Этого можно достичь, выполнив развертку частоты с шагом 0,001 МГц вблизи первичной резонансной частоты для каждого преобразователя PZT. После этого одновременно подайте эти оптимальные сигналы на все три преобразователя PZT, чтобы получить ожидаемый 3D-точечный ячеистый рисунок. Перед подачей каждого входного сигнала убедитесь, что клетки равномерно распределены в биочернилах путем мягкого перемешивания.
3. Сшить биочернила с помощью синего света (405 нм, 60 мВт/^см2, 30 с) для создания 3D-гидрогелевого каркаса, который инкапсулирует клеточные агрегаты, собранные акустически. После этого выключите генератор функций и усилитель мощности.
4. Аккуратно перенесите 3D-гидрогелевый каркас из камеры в чашку Петри и нарежьте его на небольшие кусочки (например, 2 мм × 2 мм × 2 мм) с помощью чистой бритвы.
5. Добавьте питательную среду для культивирования.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Не забывайте менять питательную среду каждый день.

6. Извлечение клеточных сфероидов

1. Начните с наблюдения за образованием сфероидов в разных слоях скаффолдов с помощью инвертированного микроскопа.
2. Через 3 дня культивирования удалить питательную среду и дважды тщательно промыть гидрогелевые скаффолды PBS.
3. Инкубируют скаффолды с более чем 2 мл лизисного буфера GelMA в разведении 1:200 со средой для клеточных культур в течение 30 мин в клеточном инкубаторе. Этот этап направлен на растворение гидрогелевых каркасов.
4. Перелейте раствор из предыдущего шага в пробирку, а затем центрифугируйте его при 200 × г в течение 5 мин при комнатной температуре до получения гранулы сфероида ячейки.
5. Выбросьте надосадочную жидкость и повторно суспендируйте гранулу в свежей питательной среде для последующего применения.

7. Анализ жизнеспособности сфероида

1. Оцените жизнеспособность клеточных сфероидов либо в гидрогелевых каркасах, либо в извлеченных сфероидах с помощью набора для окрашивания живых/мертвых (см. таблицу материалов).
2. Инкубируют образцы в разные моменты времени культивирования с 1 мл раствора PBS, содержащего 1 мкл кальцеина-AM и 2 мкл йодида пропидия (PI), в течение 15 мин при 37 °C.
3. Для образцов внутри гидрогелевых каркасов промойте их непосредственно PBS дважды. Для извлеченных сфероидов центрифугу при 200 × г в течение 5 мин при комнатной температуре до получения гранулы сфероида и дважды промывают ее перед наблюдением.
4. Осмотрите образцы с помощью флуоресцентного микроскопа и сделайте флуоресцентные изображения.
5. Рассчитайте отношение площади, окрашенной кальцеином-AM, к общей площади, окрашенной как кальцеином-AM, так и PI, используя ImageJ для определения жизнеспособности сфероида.

В этом исследовании было разработано устройство 3D-акустической сборки для массового производства клеточных сфероидов. Акустическое устройство состояло из квадратной камеры с двумя преобразователями PZT, прикрепленными к плоскостям X и Y на внешней поверхности камеры, и одним преобразователем PZT на нижней части камеры (рис. 1A, B). Три выходных канала от двух функциональных генераторов были подключены к трем усилителям мощности для генерации трех независимо синусоидальных сигналов для срабатывания преобразователей PZT (рис. 1C).

Оптимальные резонансные частоты, используемые для приведения в действие трех преобразователей PZT, прикрепленных к плоскостям X/Y/Z камеры, составляли 3,209 МГц, 3,283 МГц и 3,215 МГц соответственно. Оптимальная амплитуда для всех трех преобразователей PZT составляла 10 размахов выходного напряжения (Vpp), измеренных осциллографом. На рисунке 2А показан механизм работы ячеистых агрегатов, генерируемых с помощью устройства 3D-акустической сборки. При подаче сигнала ячейки подгоняются к акустическим узлам под действием силы акустического излучения (ОПН). Для визуализации клеточных сфероидов клетки предварительно окрашивали 2 мкМ DiO (зеленая флуоресценция). После сборки акустических ячеек с помощью конфокального микроскопа наблюдали 3D-акустически собранные клеточные агрегаты. Было замечено, что эти клеточные агрегаты расположены в виде регулярной 3D-точечной матрицы с однородными зелеными флуоресцентными сигналами (рис. 2B). Различные виды изображений светлого поля сверху также продемонстрировали, что сформированные агрегаты в каждом слое были организованы в виде 2D-точечной матрицы (рис. 2C).

Наблюдался рост клеточных агрегатов внутри гидрогеля в разные моменты времени. Результаты показали, что собранные агрегаты постепенно интегрировались и образовали плотные сфероиды к 3-му дню, что сопровождалось увеличением диаметра сфероида (рис. 3А,Б). Для оценки жизнеспособности клеточных сфероидов было проведено окрашивание «живой/мертвый». Хорошая жизнеспособность клеток (>90%) была достигнута до 3-го дня, в то время как жизнеспособность немного снизилась после недели культивирования (рис. 3C, D).

Для извлечения сфероидов использовали лизисный буфер GelMA для диссоциации гидрогелевых скаффолдов, высвобождая инкапсулированные клеточные сфероиды (рис. 4A). Следовательно, после трех дней культивирования небольшие кусочки гидрогелевых скаффолдов обрабатывали лизисным буфером GelMA при 37 °C в течение 30 мин. Высвобожденные сфероиды сохраняли хорошую сферическую морфологию с узким распределением по размерам, а также экспрессию альбумина и желаемую жизнеспособность (рис. 4B-D).

Рисунок 1: Устройство 3D-акустической сборки. (A) Принципиальная схема, показывающая вид сверху на устройство 3D-акустической сборки, состоящее из камеры из ПММА, прикрепленной к трем преобразователям PZT. (B) Фотография, демонстрирующая реальное 3D-устройство акустической сборки. (C) Фотография, показывающая 3D-акустическую сборку, соединенную с двумя функциональными генераторами и тремя усилителями мощности. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этого рисунка.

Рисунок 2: Акустически собранные ячеечные агрегаты. (A) Схема, иллюстрирующая механизм работы клеточных агрегатов, генерируемых устройством 3D-акустической сборки, где ячейки подгоняются к акустическим узлам силой акустического излучения. (B) Конфокальные изображения, демонстрирующие 3D-акустически собранные клеточные агрегаты с разных ракурсов. (C) Изображения в светлом поле, показывающие сформированные клеточные агрегаты в различных слоях гидрогелевого каркаса. Масштабная линейка представляет 250 мкм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Рисунок 3: Рост клеточных агрегатов в сфероиды внутри каркаса GelMA. (A) Изображения в светлом поле, показывающие образование компактных клеточных сфероидов после 3-дневного периода культивирования. (B) Количественная оценка размеров сфероидов. (C) Живое/мертвое окрашивание сфероидов в гидрогелевом каркасе после одной недели культивирования. (D) Количественная оценка жизнеспособности сфероида клетки. Масштабная линейка представляет 250 мкм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Рисунок 4: Извлечение акустически изготовленных клеточных сфероидов. (A) Иллюстрация, изображающая этапы извлечения акустически изготовленных клеточных сфероидов. (B) Изображения в светлом поле, показывающие полученные сфероиды при различном увеличении. Масштабная линейка представляет 250 мкм. (C) Анализ жизнеспособности и функциональности полученных сфероидов. Масштабная линейка представляет 100 мкм. (D) Распределение сфероидов по размерам после извлечения. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этого рисунка.

Авторам нечего раскрывать.