Органоиды, полученные от желудочных пациентов, находят все большее применение в исследованиях, однако формальные протоколы получения органоидов желудка человека из одноклеточных пищеварителей со стандартизированной плотностью посева отсутствуют. В данном протоколе представлен подробный метод надежного создания органоидов желудка из биопсийной ткани, полученной при эндоскопии верхних отделов желудка.
Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.
Методическая статья
Установление и характеристика органоидов желудка, полученных от пациентов, из биопсии доброкачественного тела желудка и антрального эпителия
В этой статье
Краткое содержание
Аннотация
Органоиды, полученные от пациентов желудка (PDOs), предлагают уникальный инструмент для изучения биологии и патологии желудка. Следовательно, эти PDO находят все большее применение в широком спектре исследовательских приложений. Тем не менее, существует нехватка опубликованных подходов к получению желудочных ЗОП из одноклеточных дигестов при сохранении стандартизированной начальной плотности посева клеток. В этом протоколе акцент делается на инициации желудочных органоидов из изолированных единичных клеток и предоставлении метода пассации органоидов путем фрагментации. Важно отметить, что протокол демонстрирует, что стандартизированный подход к начальной плотности посева клеток последовательно дает органоиды желудка из доброкачественной биопсийной ткани и позволяет стандартизировать количественную оценку роста органоидов. Наконец, фактические данные подтверждают новое наблюдение о том, что желудочные ЗОП демонстрируют различную скорость образования и роста в зависимости от того, происходят ли органоиды из биопсии тела или антральных областей желудка. В частности, выявлено, что использование ткани антральной биопсии для инициации органоидов приводит к образованию большего количества органоидов и более быстрому росту органоидов в течение 20-дневного периода по сравнению с органоидами, полученными из биопсии тела желудка. Протокол, описанный в настоящем документе, предлагает исследователям своевременный и воспроизводимый метод успешного создания и работы с желудочными ЗОП.
Введение
Органоиды представляют собой миниатюрные трехмерные (3D) клеточные структуры, которые напоминают архитектуру и функциональность органов, из которых они были получены 1,2. Эти выращенные в лаборатории модели создаются путем культивирования стволовых клеток или тканеспецифичных клеток в контролируемой среде, которая позволяет этим клеткам самоорганизовываться и дифференцироваться в различные типы клеток 1,2,3. Одним из ключевых преимуществ органоидов является их способность более точно повторять биологию человека, чем традиционные двумерные (2D) клеточные культуры 1,2,3. В частности, было показано, что органоиды человека сохраняют генетическое разнообразие тканей своего происхождения 3,4,5. Органоиды дают уникальную возможность изучать развитие органов человека, моделировать заболевания и тестировать потенциальные терапевтические средства в контролируемых лабораторных условиях. Кроме того, органоиды могут быть получены из индивидуальных образцов пациентов, что позволяет применять персонализированные подходы к медицине и потенциальную разработку индивидуализированных методов лечения 3,6,7.
Исследователи использовали органоиды желудка человека для изучения различных аспектов биологии и патологии желудка. Яркими примерами являются использование органоидов, полученных от пациентов (PDO), для прогнозирования ответов на химиотерапию рака желудка 8,9,10 и моделирования эпителиального ответа на инфекцию Helicobacter pylori 11,12,13. Органоиды желудка человека состоят из различных типов клеток, обнаруженных в желудке, включая клетки шеи, клетки ямки и другие поддерживающие клетки11,14. Органоиды желудка могут быть получены либо из индуцированных плюрипотентных стволовых клеток (ИПСК), либо из стволовых клеток, непосредственно выделенных из ткани желудка, полученной с помощью биопсии, или из образцов резекции желудка11,14. Выделение желудочных стволовых клеток из желудочной ткани обычно осуществляется путем изоляции и культивирования желудочных желез или ферментативного расщепления образцов тканей для высвобождения отдельных клеток 9,13,15. Важно отметить, что дифференцировка клеток в органоидах желудка, полученных с помощью любого из этих методов, была аналогичной13. Протокол, описанный здесь, основан на дайджесте с одной клеткой.
Органоиды представляют собой научную инновацию, которая устраняет разрыв между традиционной клеточной культурой и целыми органами. По мере того, как исследования в этой области продолжают прогрессировать, органоиды готовы внести свой вклад в разработку более эффективных методов лечения и терапии для широкого спектра применений. Учитывая растущее использование желудочных ЗОП, существует острая необходимость в стандартизированном подходе к их созданию. Описан протокол получения ЗОП желудка человека из единичных клеток, выделенных из доброкачественной биопсийной ткани желудка, полученной при эндоскопии верхних отделов желудка. Важно и уникально то, что для посева определяется стандартизированное количество отдельных клеток, чтобы надежно генерировать желудочные ЗОП и позволять впоследствии характеризовать. С помощью этого метода продемонстрированы достоверные различия в образовании и росте органоидов, полученных при биопсии тела желудка или антрального слоя желудка.
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Протокол
Все человеческие ткани, использованные в этом протоколе, были собраны у лиц, которые дали информированное согласие на забор тканей в рамках исследования сбора тканей желудка, одобренного Институциональным наблюдательным советом Университета Пенсильвании (IRB #842961). Участники этого исследования должны были пройти эндоскопию верхних отделов позвоночника в рамках планового ухода, быть не моложе 18 лет и быть в состоянии предоставить информированное согласие. Все проводимые исследования проводились в соответствии с руководящими принципами, установленными Университетом Пенсильвании.
1. Подготовка эксперимента
- Приготовьте кондиционированную среду L-WRN, как описано выше16. Хотя это и не является обязательным, концентрации Wnt-3A, R-спондина и ноггина, содержащиеся в кондиционированных средах, можно проверить с помощью имеющихся в продаже наборов для ИФА в соответствии с инструкциями производителя (см. таблицу материалов).
- Приготовьте RPMI-антибиотики (RPMI-ABX), PBS-антибиотики (PBS-ABX), PBS-ДИТИОТРЕЙТОЛ (PBS-DTT), ПИЩЕВАРИТЕЛЬНЫЙ БУФЕР И ЖЕЛУДОЧНУЮ ОРГАНОИДНУЮ СРЕДУ (СМ. Дополнительную таблицу 1 для подробного состава). Органоидная среда желудка стабильна в течение 1 недели при 4 °С.
- Автоклавные щипцы, ножницы для тонкого препарирования и пробирки объемом 1,5 мл.
- Начните размораживание базальной мембранной матрицы (Matrigel) на льду.
- Начните размораживание пищеварительного буфера и трипсина-ЭДТА на водяной бане с температурой 37 °C.
- Установите орбитальный шейкер инкубатора на 37 °C и 200 об/мин.
2. Выделение единичных клеток из биопсийной ткани
- Забор биопсии желудка во время эндоскопии верхних отделов17 в соответствии с клиническим протоколом учреждения, вероятно, с использованием больших щипцов. Используйте иглу с тупым концом, чтобы извлечь образцы тканей из щипцов и поместить их в коническую пробирку объемом 15 мл, содержащую среду RPMI-ABX. Держите пробирку на льду для быстрой транспортировки в лабораторию.
ПРИМЕЧАНИЕ: Необходимо собрать минимум 2-4 биопсии. - Дайте биопсийной ткани осесть на дне конической трубки. Используйте пипетку для аспирации среды и дважды промойте биопсию 1 мл буфера PBS-ABX. Нет необходимости в центрифугировании, так как кусочки ткани естественным образом оседают в конической пробирке.
- Перенесите минимум 20 мг биопсийной ткани в пробирку объемом 1,5 мл, содержащую 1 мл PBS-DTT.
- С помощью тонких ножниц для препарирования разрежьте ткань на кусочки размером 1-2 мм или меньше.
- Используйте настольную миницентрифугу в течение 15 с, чтобы собрать кусочки ткани на дне пробирки и отсосать как можно больше надосадочной жидкости. Допустим небольшой остаточный объем PBS-DTT.
- Добавьте 5 мл свежеподогретого пищеварительного буфера в коническую пробирку объемом 50 мл. Чтобы перенести небольшие кусочки ткани без потери ткани, возьмите 500 мкл пищеварительного буфера и добавьте его в пробирку объемом 1,5 мл, содержащую ткань. Затем модифицируйте наконечник пипетки на 1000 мкл с помощью ножниц, чтобы увеличить диаметр наконечника, что позволит легко аспирировать и переносить кусочки ткани в коническую пробирку объемом 50 мл, содержащую буфер для пищеварения.
- Инкубируйте пищеварительный буфер и тканевую смесь при 37 °C в течение 30 мин с орбитальным встряхиванием при 200 об/мин.
- Добавьте 5 мл подогретого трипсина с 0,25% ЭДТА в буфер для пищеварения и инкубируйте еще 10 мин при 37 °C с орбитальным встряхиванием при 200 об/мин.
- Нейтрализуйте буфер для пищеварения и трипсин, добавив равный объем среды Advanced (Adv.) DMEM/F12 и пропустите раствор через ситечко с ячейками 70 мкм.
- Гранулируют клетки центрифугированием при 1400 x g в течение 4 мин при 4 °C. В зависимости от исходного размера биопсийной ткани, мелкоклеточная гранула может быть видна, а может и не быть видимой.
- Ресуспендант клеточной гранулы в 1 мл среды Adv. DMEM/F12 и подсчитайте количество жизнеспособных клеток с помощью трипанового синего и гемоцитометра.
- Повторно гранулируют клетки центрифугированием при 1400 x g в течение 4 мин при 4 °C и удаляют надосадочную жидкость.
ПРИМЕЧАНИЕ: На рисунке 1 представлено схематическое изображение процесса выделения отдельных клеток из биопсийной ткани.
3. Встраивание одиночных ячеек в матрицу базальной мембраны «купол»
- На основе подсчитанного количества жизнеспособных клеток рассчитайте объем матрицы базальной мембраны, необходимый для достижения конечной концентрации 105 жизнеспособных клеток на 50 мкл матрицы базальной мембраны.
- Выполните следующие действия быстро, чтобы предотвратить полимеризацию матрицы базальной мембраны перед нанесением покрытия. Вынуть размороженную матрицу базальной мембраны изо льда, добавить в ячейки рассчитанный ранее объем матрицы базальной мембраны и аккуратно перемешать пипеткой вверх и вниз в течение примерно 10 с.
ПРИМЕЧАНИЕ: Очень важно избегать образования пузырей на этом этапе. Не разбавляйте матрицу базальной мембраны. - Быстро пипетка 50 мкл аликвот матрикса базальной мембраны и клеточной смеси в центр отдельных лунок в 24-луночном планшете для культуры тканей.
- Сразу же накройте 24-луночную пластину и одним плавным движением переверните пластину вверх дном. Поместите перевернутую пластину в инкубатор для культуры тканей при температуре 37 °C на 35 минут, чтобы матрица базальной мембраны полимеризовалась.
ПРИМЕЧАНИЕ: Инвертирование пластины необходимо для предотвращения опускания клеток на дно пластины и для того, чтобы матрица базальной мембраны могла полимеризоваться в 3D-форму «купола». - Добавьте 500 мкл предварительно подогретой желудочной органоидной среды в каждую лунку, убедившись, что верхняя часть каждого «купола» полностью погружена в среду. Распределите средство вниз по стенкам каждого колодца, чтобы не повредить «купол».
- Меняйте носитель каждые 2-3 дня.
4. Рутинный пассаж органоидов путем фрагментации
- Как только органоиды будут готовы к прохождению, удалите среду из каждой назначенной лунки.
ПРИМЕЧАНИЕ: Чтобы определить подходящее время для сдачи, обратитесь к разделу «Репрезентативные результаты». - Распределите 1 мл ледяного носителя Adv. DMEM/F12 непосредственно на матричный «купол» базальной мембраны. Это должно легко инициировать разрушение «купола». Продолжайте аспирацию и дозирование до тех пор, пока все фрагменты «купола» не отделятся от пластины.
- Транспортируйте как среду, так и фрагментированную матрицу базальной мембраны к следующей скважине, повторяя этот процесс для всех скважин, предназначенных для прохода. После разборки окончательного «купола» матрицы базальной мембраны распределите среду и смесь органоидов и матрицы базальной мембраны в пробирку объемом 1,5 мл.
- Прикрепите наконечник на 1000 мкл к пипетке P1000, а затем вставьте этот наконечник в наконечник на 200 мкл. Это позволит создать наконечник пипетки достаточно маленького диаметра, чтобы фрагментировать органоиды, но при этом обеспечить аспирацию большего объема.
- Энергично пипетируйте смесь органоидов и матрицу базальной мембраны вверх и вниз примерно 25 раз, чтобы фрагментировать органоиды на мелкие кусочки.
- Центрифугируют фрагментированную органоидную смесь с помощью настольной центрифуги при 4 °C в течение 30 с при 2000 x g. В результате образуется гранула фрагментированных органоидов, отделенных от матрицы базальной мембраны и среды. Используйте пипетку для аспирации среды и надосадочной жидкости матрицы базальной мембраны. Не используйте вакуум для аспирации надосадочной жидкости, так как гранула рыхлая.
- Рассчитайте необходимый объем свежеразмороженной мембранной матрицы фундамента, чтобы количество лунок/куполов было разделено в соотношении 1:2 (50 мкл/купол). Добавьте свежую матрицу базальной мембраны и осторожно проведите пипеткой вверх и вниз, чтобы перемешать, стараясь не образовывать пузырьки.
- Быстрая аликвота 50 мкл смеси фрагментов органоидов и матрицы базальной мембраны в отдельные лунки 24-луночного планшета.
- Накройте планшет, переверните его вверх дном и поместите в инкубатор для культуры тканей при температуре 37 °C на 35 минут, чтобы матрица базальной мембраны полимеризовалась.
- Добавьте в каждую лунку 500 мкл предварительно подогретой желудочной органоидной среды.
ПРИМЕЧАНИЕ: На рисунке 2 представлен схематический обзор пассации органоидов, полученных от желудочного пациента, путем фрагментации.
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Результаты
Последующие репрезентативные результаты получены на основе биопсии, взятой из доброкачественного эпителия как желудочного тела, так и желудочного антрума желудка пяти разных пациентов, проходящих эндоскопию верхних отделов. От двух до четырех «куполов»/лунок были покрыты и проанализированы для каждого пациента как для биопсии тела желудка, так и для антрального аппарата. Органоиды были успешно получены из тела желудка и ткани биопсии антрального отдела желудка у всех пяти пациентов. В среднем анализировался 41 органоид н...
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Обсуждение
Изложен подробный протокол достоверной генерации органоидов желудка человека из единичных клеток, выделенных из биоптатов доброкачественного эпителия из тела желудка и антрума. Важнейшие этапы протокола связаны с синхронизацией, а также с обработкой матрицы базальной мембраны. Для сохранения жизнеспособности важно начать протокол как можно скорее после получения биопсийной ткани. Цель состоит в том, чтобы начать переваривание биопсийной ткани в течение 30 минут после проведения биопсии. Работа с матрицей базальной мембра...
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Раскрытие информации
Авторы не раскрывают информацию по этому поводу.
Благодарности
Университет Пенсильвании по геномной медицине T32 HG009495 (KHB), NCI R21 CA267949 (BWK), программа Men & BRCA в Центре Бассера для BRCA (KHB, BWK), грант Фонда семьи ДеГрегорио (BWK).
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Материалы
| Имя | Компания | Каталожный номер | Комментарии |
|---|---|---|---|
| 0,25% трипсин-ЭДТА | Gibco | 25200-056 | |
| A83-01 | R& D Systems | 2939 | |
| Advanced DMEM/F12 | Gibco | 12634-010 | |
| Amphotericin B | Invitrogen | 15290018 | |
| B27 | Invitrogen | 17504044 | |
| BZ-X710 | Keyence | n/a | |
| cellSens | Olympus | n/a | |
| Collagenase III | Worthington | LS004182 | |
| Dispase II | Sigma | D4693-1G | |
| Dithiothreitol (DTT) | EMSCO/Fisher | BP1725 | |
| DPBS | Gibco | 14200-075 | |
| Fungin | InvivoGen | NC9326704 | |
| Gastrin I | Sigma Aldrich | G9145 | |
| Гентамицин | Invitrogen | 1570060 | |
| глутамакс | Gibco | 35050-061 | |
| hEGF | Peprotech | AF-100-15 | |
| HEPES | Invitrogen | 15630080 | |
| hFGF-10 | Peprotech | 100-26 | |
| L-WRN Клеточная линия | ATCC | CRL-3276 | |
| Matrigel | Corning | 47743-715 | |
| Metronidazole | MP Biomedicals | 155710 | |
| N2 Добавка | Invitrogen | 17502048 | |
| Noggin ELISA Kit | Novus Biologicals | NBP2-80296 | |
| Pen Strep | Gibco | 15140-122 | |
| RPMI 1640 | Gibco | 11875-085 | |
| R-Spondin ELISA Kit | R& D Systems | DY4120-05 | |
| Wnt-3a ELISA Kit | R& D Systems | DY1324B-05 | |
| Y-27632 | Sigma Aldrich | Y0503 |
Ссылки
- Drost, J., Clevers, H. Organoids in cancer research. Nature Reviews Cancer. 18 (7), 407-418 (2018).
- Corrò, C., Novellasdemunt, L., Li, V. S. A brief history of organoids. American Journal of Physiology-Cell Physiology. 319 (1), C151-C165 (2020).
- Zhao, Z., et al. Organoids. Nature Reviews Methods Primers. 2 (1), 94(2022).
- Weeber, F., et al. Preserved genetic diversity in organoids cultured from biopsies of human colorectal cancer metastases. Proceedings of the National Academy of Sciences. 112 (43), 13308-13311 (2015).
- Boretto, M., et al. Patient-derived organoids from endometrial disease capture clinical heterogeneity and are amenable to drug screening. Nature Cell Biology. 21 (8), 1041-1051 (2019).
- Lo, Y. H., Karlsson, K., Kuo, C. J. Applications of organoids for cancer biology and precision medicine. Nature Cancer. 1 (8), 761-773 (2020).
- Grönholm, M., et al. Patient-derived organoids for precision cancer immunotherapy. Cancer research. 81 (12), 3149-3155 (2021).
- Yan, H. H., et al. A comprehensive human gastric cancer organoid biobank captures tumor subtype heterogeneity and enables therapeutic screening. Cell Stem Cell. 23 (6), 882-897 (2018).
- Yoon, C., et al. Patient-derived organoids from locally advanced gastric adenocarcinomas can predict resistance to neoadjuvant chemotherapy. Journal of Gastrointestinal Surgery. 27 (4), 666-676 (2023).
- Miao, X., et al. Establishment of gastric cancer organoid and its application in individualized therapy. Oncology Letters. 24 (6), 1-8 (2022).
- Pompaiah, M., Bartfeld, S. Gastric organoids: an emerging model system to study Helicobacter pylori pathogenesis. Molecular Pathogenesis and Signal Transduction by Helicobacter pylori. 400, 149-168 (2017).
- Schlaermann, P., et al. A novel human gastric primary cell culture system for modelling Helicobacter pylori infection in vitro. Gut. 65 (2), 202-213 (2016).
- Bartfeld, S., et al. In vitro expansion of human gastric epithelial stem cells and their responses to bacterial infection. Gastroenterology. 148 (1), 126-136 (2015).
- Seidlitz, T., Koo, B. K., Stange, D. E. Gastric organoids-an in vitro model system for the study of gastric development and road to personalized medicine. Cell Death & Differentiation. 28 (1), 68-83 (2021).
- Bartfeld, S., Clevers, H. Organoids as model for infectious diseases: culture of human and murine stomach organoids and microinjection of Helicobacter pylori. Journal of Visualized Experiments. 105, e53359(2015).
- Miyoshi, H., Stappenbeck, T. S. In vitro expansion and genetic modification of gastrointestinal stem cells in spheroid culture. Nature Protocols. 8 (12), 2471-2482 (2013).
- Yang, H. J., et al. Sample collection methods in upper gastrointestinal research. Journal of Korean Medical Science. 38 (32), e255(2023).
- Kim, S., et al. Comparison of cell and organoid-level analysis of patient-derived 3D organoids to evaluate tumor cell growth dynamics and drug response. SLAS DISCOVERY: Advancing the Science of Drug Discovery. 25 (7), 744-754 (2020).
- Maru, Y., Tanaka, N., Itami, M., Hippo, Y. Efficient use of patient-derived organoids as a preclinical model for gynecologic tumors. Gynecologic Oncology. 154 (1), 189-198 (2019).
- McGowan, K. P., Delgado, E., Hibdon, E. S., Samuelson, L. C. Differential sensitivity to Wnt signaling gradients in human gastric organoids derived from corpus and antrum. American Journal of Physiology-Gastrointestinal and Liver Physiology. 325 (2), G158-G173 (2023).
- Busslinger, G. A., et al. Human gastrointestinal epithelia of the esophagus, stomach, and duodenum resolved at single-cell resolution. Cell Reports. 34 (10), 108819(2021).
- Yang, R., et al. A quick and reliable image-based AI algorithm for evaluating cellular senescence of gastric organoids. Cancer Biology & Medicine. 20 (7), 519(2023).
- Skubleny, D., et al. Murine and Human gastric tissue establishes organoids after 48 hours of cold ischemia time during shipment. Biomedicines. 11 (1), 151(2023).
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Перепечатки и разрешения
