Использование визуализации живых клеток для измерения влияния патологических белков на аксональный транспорт в первичных нейронах гиппокампа

Краткое содержание

В этой статье мы демонстрируем, как сочетать трансфекцию первичных нейронов гиппокампа грызунов с конфокальной визуализацией живых клеток для анализа патологических белковых эффектов на аксональный транспорт и выявления механистических путей, опосредующих эти эффекты.

Аннотация

Двунаправленная транспортировка грузов по аксону имеет решающее значение для поддержания функциональных синапсов, нейронных связей и здоровых нейронов. При множественных нейродегенеративных заболеваниях аксональный транспорт нарушается, и проекционные нейроны особенно уязвимы из-за необходимости транспортировки клеточных материалов на большие расстояния и поддержания значительной аксональной массы. Патологические модификации нескольких белков, связанных с заболеванием, негативно влияют на транспорт, включая тау, амилоид-β, α-синуклеин, супероксиддисмутазу и хантингтин, обеспечивая потенциальный общий механизм, с помощью которого патологические белки оказывают токсичность при заболевании. Методы изучения этих токсических механизмов необходимы для понимания нейродегенеративных расстройств и определения потенциальных терапевтических вмешательств.

Здесь культивируемые первичные нейроны гиппокампа грызунов котрансфицируются с несколькими плазмидами для изучения влияния патологических белков на быстрый аксональный транспорт с использованием конфокальной визуализации живых клеток флуоресцентно меченных грузовых белков. Мы начнем с сбора, диссоциации и культивирования первичных нейронов гиппокампа у грызунов. Затем мы совместно трансфицируем нейроны с плазмидными конструкциями ДНК для экспрессии флуоресцентно меченного грузового белка и дикого типа или мутантного тау (используемого в качестве образца патологических белков). Аксоны идентифицируются в живых клетках с помощью антитела, которое связывается с внеклеточным доменом нейрофасцина, белком начального сегмента аксона, и визуализируется интересующая область аксона для измерения флуоресцентного транспорта груза.

Используя KymoAnalyzer, свободно доступный макрос ImageJ, мы подробно охарактеризовали скорость, частоту пауз и направленную плотность груза аксонального транспорта, на которые может влиять присутствие патологических белков. С помощью этого метода мы идентифицируем фенотип повышенной частоты паузы в грузе, связанный с экспрессией патологического тау-белка. Кроме того, в трансфекционную смесь могут быть добавлены конструкции shRNA, подавляющие подавление генов, чтобы проверить роль других белков в опосредовании нарушения транспорта. Этот протокол легко адаптируется для использования с другими белками, связанными с нейродегенеративными заболеваниями, и является воспроизводимым методом изучения механизмов того, как эти белки нарушают аксональный транспорт.

Введение

Нейроны зависят от двунаправленного транспорта груза вдоль аксона для поддержания функциональных синапсов и нейронных связей. Считается, что дефицит аксонального транспорта является важнейшим фактором патогенеза нескольких нейродегенеративных заболеваний, включая болезнь Альцгеймера (БА) и другие таупатии, болезнь Паркинсона, боковой амиотрофический склероз и болезнь Хантингтона ^1,2,3. Действительно, патологические модификации нескольких белков, связанных с заболеванием, негативно влияют на транспорт (рассмотрено в ^{пункте 4}). Разработка методов исследования механизмов, с помощью которых патологические белки оказывают токсичное воздействие на заболевание, необходима для понимания нейродегенеративных расстройств и определения потенциальных мишеней для терапевтического вмешательства.

Несколько важных открытий о транспорте аксонов, включая открытие обычного кинезина, киназо- и фосфатазозависимых путей, регулирующих моторные белки, и механизмов, с помощью которых патологические белки нарушают регуляцию транспорта аксонов, были сделаны с использованием модели изолированной аксоплазмы кальмара ^4,5. Перфузия аксоплазмы кальмара с патологическими формами тау-белка ингибирует антероградный быстрый аксональный транспорт (FAT), эффект, зависящий от экспозиции фосфатазоактивирующего домена тау, который активирует протеинфосфатазу 1 (PP1)^6,7,8. PP1 активирует гликогенсинтазукиназу 3 (GSK3), которая, в свою очередь, фосфорилирует легкие цепи кинезинов, вызывающие высвобождение груза. Еще одним патологическим белком при БА является амилоид-β. Олигомерные формы амилоид-β ингибируют двунаправленный FAT через казеинкиназу 2, которая фосфорилирует кинезиновые легкие цепи⁹. Кроме того, патологический белок гентингтин, содержащий полиглутаминовую экспансию, и семейный ALS-связанный мутант SOD1 нарушают аксональный транспорт в аксоплазме кальмара через активность c-Jun N-концевой киназы и митоген-активируемой протеинкиназы p38, соответственно^10,11.

В то время как модель аксоплазмы кальмара продолжает оставаться ценным инструментом в понимании влияния патологических белков на аксональный транспорт, ограниченный доступ к оборудованию и образцам не позволяет ее более широко использовать. Мы разработали транспортный анализ с использованием конфокальной микроскопии живых клеток первичных нейронов первичных нейронов грызунов (мышей и крыс). Эта модель представляет собой легко адаптируемый и манипулируемый подход на основе нейронов млекопитающих с использованием широко доступных источников клеток и систем микроскопии. Например, различные патологические белки (например, содержащие модификации, связанные с заболеванием) экспрессируются для определения того, как специфические модификации этих белков влияют на транспорт в аксонах. Аналогичным образом, для изучения специфических для груза изменений можно использовать различные флуоресцентно помеченные грузовые белки. Более того, лежащие в основе молекулярные механизмы относительно легко изучаются путем нацеливания на экспрессию (т.е. нокдаун или сверхэкспрессию) выбранных белков, которые могут опосредуть эти эффекты. Этот метод также легко адаптируется для первичных нейронов, полученных из широкого спектра животных моделей.

Мы представляем подробный протокол, описывающий анализ транспорта аксонов живых клеток, который ранее использовался в первичных нейронах гиппокампа, чтобы показать, что мутантные тау-белки, связанные с лобно-височной деменцией (FTLD; P301L или R5L tau) увеличивают частоту пауз флуоресцентно меченных грузовых белков в двух направлениях¹². Кроме того, нокдаун изоформы PP1γ спас эффекты паузы¹². Это обеспечивает поддержку модели патологического тау-индуцированного разрушения, которое опосредовано аберрантной активацией сигнального пути, инициированного PP1, как описано выше ^6,7,12. В отдельном исследовании мы показали, что псевдофосфорилирование тау в S199/S202/T205 (патогенный фосфоэпитоп AT8, актуальный для таупатий) увеличивает частоту паузы в грузе и скорость антероградного сегмента. Эти эффекты зависели от N-концевого фосфатаза, активирующего домен^тау-13. Эти примеры подчеркивают полезность данной модели для определения механизмов того, как патологические белки нарушают транспорт аксонов в нейронах млекопитающих.

В этой статье представлено подробное описание метода, начиная с забора, диссоциации и культивирования первичных нейронов гиппокампа мыши, за которым следует трансфекция нейронов белками-грузами, слитыми с флуоресцентным белком, и, наконец, подход к визуализации живых клеток и анализу изображений. В качестве примера мы демонстрируем, как этот метод используется для изучения влияния модифицированного тау-белка на двунаправленный транспорт белка, связанного с везикулами, синаптофизина. Тем не менее, существует гибкость в интересующем патогенном белке и белке транспортного груза, что делает этот подход к изучению аксонального транспорта универсальным.

Протокол

Эти протоколы были одобрены Комитетом по институциональному уходу за животными и их использованию Мичиганского государственного университета. Этот протокол был успешно применен к мышам Tau Knockout в фоновом диапазоне C57BL/6J и крысам дикого типа Sprague Dawley. Другие штаммы также должны быть приемлемыми.

1. Забор первичных нейронов гиппокампа

1. Покройте предметное стекло 4-луночной нижней камеры фильтрованным 0,5 мг/мл поли-d-лизином (PDL) в боратном буфере (12,5 мМ декагидрата бората натрия и 50 мМ борной кислоты). Добавьте 750 μл/лунку и инкубируйте при комнатной температуре в течение ночи.
2. Промойте предметное стекло камеры 4 раза стерильной деионизированной водой. После последней стирки высушите на воздухе и храните при температуре 4 °C для кратковременного хранения (<1 неделя).
   ПРИМЕЧАНИЕ: Не позволяйте PDL высыхать на предметном стекле до и между стирками, так как это токсично для культур. Мы обнаружили, что длительное хранение предметных стекол с PDL-покрытием может повлиять на здоровье нейронов, и что поддержание постоянных интервалов между покрытием и покрытием снижает межпрогонную вариабельность жизнеспособности культуры.
3. Приобретите мышь или крысу с временной беременностью.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Беременные животные могут быть заказаны в различных компаниях или выращены на месте. Эмбриональный нулевой день относится к дню, когда вагинальная пробка найдена, и мы добились успеха в культивировании первичных нейронов гиппокампа и коры головного мозга мышей E16-18 с помощью этого подхода. Нейроны крыс также собирают на эмбриональный день 18 дня.
4. На Е18 усыпьте беременную самку утвержденным методом. Разрежьте брюшную стенку и удалите два маточных рога. Переложите их в чашку Петри, содержащую ледяной 0,9% физиологический раствор. Промойте до тех пор, пока солевой раствор не станет чистым.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Мы вводим передозировку пентобарбитала натрия (не менее 100 мг/кг) путем внутрибрюшинной инъекции.
5. Обезглавьте щенков. Начиная с большого затылочного отверстия (отверстия в задней части черепа), используйте ножницы для микродиссекции, чтобы разрезать кожу и череп по средней линии, наклоняя нижний кончик ножниц вверх к внутренней части черепа, чтобы избежать повреждения мозговой ткани.
6. Удалите вышележащую кожу и осторожно удалите череп, чтобы обнажить мозг.
7. С помощью щипцов удерживайте область рта/носа и поверните череп так, чтобы мозг был обращен вниз, над чашкой Петри, наполненной 0,9% физиологическим раствором. Выверните мозг из черепа и перережьте нервы и ствол мозга, чтобы выпустить мозг в физиологический раствор.
8. Поместите чашку Петри под препарирующий микроскоп для рассечения гиппокампа. Вставьте ножницы в среднюю линию мозга, наклоните ножницы так, чтобы верхнее лезвие выталкивало одно из полушарий мозга наружу, и разрежьте, чтобы отделить полушарие от подкорковых областей.
9. Сделайте вертикальный разрез в коре головного мозга так, чтобы лобная кора была спереди, а гиппокамп — позади места разреза. Вставьте нижний кончик ножниц в образовавшееся отверстие и аккуратно разрежьте вдоль верхушки коры, останавливаясь на заднем конце.
10. С помощью щипцов осторожно раскачайте кору головного мозга и завершите задний разрез. Гиппокамп должен напоминать форму полумесяца. Тщательно обрежьте оставшуюся кору головного мозга, чтобы гиппокамп сохранил свою округлую форму в форме полумесяца.
11. С помощью щипцов и ножниц аккуратно удалите мозговые оболочки из гиппокампа.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Важно удалить все мозговые оболочки из головного мозга, чтобы уменьшить количество ненейрональных клеток, которые собираются, при этом воздерживаясь от повреждения или разрыва ткани гиппокампа.
12. Разрежьте гиппокамп на четыре равные части и поместите ткань в коническую трубку объемом 15 мл, заполненную ледяным буфером без кальция и магния (CMF; PBS Дульбекко с 0,1% глюкозы, 2,5 мкг/мл амфотерицина B и 50 мкг/мл гентамицина).
    ПРИМЕЧАНИЕ: Для достижения наилучших результатов собирайте гиппокампы от 5-10 детенышей за одну диссоциацию. Каждый гиппокамп должен обеспечивать примерно 300 000 клеток для мышей и 500 000 клеток для крыс.

2. Первичная диссоциация и пластинирование нейронов гиппокампа

1. Удалите CMF с помощью пастеровской пипетки и промойте салфетку свежим холодным CMF 4x, аккуратно взбивая между полосканиями.
2. Удалите CMF и добавьте 3 мл фильтрованного 0,125% раствора трипсина (разведите 2,5% трипсин в предварительно подогретом [37 °C] CMF). Инкубируйте ткань ровно 15 минут при 37 °C; Аккуратно поворачивайте каждые 5 минут.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Приготовьте раствор трипсина непосредственно перед применением.
3. Приготовьте 5 мл раствора для инактивации трипсина (TIS; Сбалансированный солевой раствор Хэнкса, 20% сыворотка крови новорожденных телят и 1x раствор ДНКазы I [10x запас: 5 мМ ацетата натрия, 1 мкМ хлорида кальция, 0,5 мг/мл ДНКазы I]).
4. Удалите раствор трипсина и промойте 2 раза холодной CMF. Добавьте 3 мл холодного ТИС.
5. Диссоциируйте клетки путем растирания с помощью шприца объемом 3 мл с иглами все меньшего диаметра: растирайте 30 раз с помощью иглы 14 G, 30 раз с помощью иглы 15 G, 20 раз с помощью иглы 16 G, 20 раз с помощью иглы 18 G и 15 раз с помощью иглы 21 G. Используйте 2 с вытягивания первыми четырьмя иглами и 3 с с помощью иглы 21 G.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Также могут быть использованы другие методы растирания (например, стеклянные пипетки^14,15, отполированные огнем). Мы обнаружили, что использование стандартизированных металлических игл для шприцев существенно снижает вариабельность в комковании клеток и жизнеспособность.
6. С помощью иглы 21 G поместите каплю клеточной суспензии на предметное стекло микроскопа и проверьте наличие клеточных скоплений. Если наблюдается несколько комочков, разотрите еще три раза через иглу 22 G и повторите проверку. Повторяйте этот процесс до получения однородной одноклеточной суспензии, стараясь осторожно растирать на протяжении всего процесса.
7. Отфильтруйте 5 мл фетальной бычьей сыворотки (FBS) с помощью шприцевого фильтра 0,22 мкм. Аккуратно нанесите клеточную суспензию на FBS в коническую пробирку объемом 15 мл. Центрифугируйте ячейки (200 × г при 4 °C) в течение 5 минут.
8. Удалите как можно больше FBS, не нарушая гранулы. Ресуспендируйте в 1 мл теплой (37 °C) нейробазальной среды, не содержащей антибиотиков (NBM; с добавлением 1x заменителя глютамина и 1x B-27).
9. Разведите клеточную суспензию в трипановом синем (0,4%) и получите количество клеток.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Разведение 1:1 хорошо подходит для автоматического счетчика клеток и использует разведение 1:60 для ручного подсчета с помощью гемацитометра. Чтобы продолжить нанесение клеточного покрытия, жизнеспособность нейронов должна быть выше 90% на этом этапе. Это значительно повышает вероятность формирования здоровой культуры нейронов после диссоциации.
10. Пластинируйте клетки с плотностью 175 000 клеток/лунку (70 000 клеток/^мм2) в предварительно подогретую четырехлуночную камеру с покрытием PDL в 750 мкл NBM, не содержащей антибиотиков. Кроме того, наведите 200 000 клеток/лунку в четыре лунки 24-луночного планшета с покрытием PDL в 1,5 мл НБМ, не содержащего антибиотиков, для использования в качестве кондиционированной среды при трансфекции, описанной в разделе 3. Инкубируйте клетки в камере с контролируемой влажностью, 37 °C и 5%_CO2 .
    ПРИМЕЧАНИЕ: Плотность ячеек может быть отрегулирована в зависимости от результатов. Высокая плотность может затруднить визуализацию нейронов, в то время как низкая плотность может негативно повлиять на здоровье культуры и выживание нейронов. По нашему опыту, нейроны крыс могут быть покрыты с меньшей плотностью по сравнению с нейронами мыши.

3. Трансфекция нейронов

ПРИМЕЧАНИЕ: Нейроны могут быть трансфицированы на DIV 7 или DIV 8 без заметных изменений в эффективности трансфекции или результатах транспортировки. Эти объемы рассчитаны на четыре лунки четырехлуночного предметного стекла со стеклянным дном в объеме 750 мкл на лунку. Этот протокол описывает трансфекцию с использованием реагентов для трансфекции липидов. Перед использованием дайте средам и реагентам для трансфекции нагреться до комнатной температуры.

1. Приготовьте реагент для трансфекции, добавив 4,4 мкл реагента для трансфекции к 127,6 мкл среды с восстановленной сывороткой. Осторожно покачивайте руками, чтобы перемешать и инкубировать при комнатной температуре в течение 30 минут.
2. Подготовьте запасы ДНК во время инкубации липидной трансфекции. Добавьте 200 г флуоресцентной ДНК (pFIN mApple-синаптофизин; 12 112 пар оснований) и 200 г ДНК для экспрессии интересующего белка (тау-плазмиды были построены pCMV tau-Flag; 5 036 пар оснований) в восстановленную сыворотку или бессывороточную среду до конечного объема 32 μL¹². Добавьте 0,8 мкл реагента-энфаксионного усилителя (2 мкл на мкг ДНК). Хорошо перемешайте вручную.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Мы считаем, что лучше всего работает производная от RFP (mApple или mCherry), но также можно использовать GFP. Кроме того, конструкция ДНК для экспрессии малой шпильковой РНК (шРНК), подавляющей подавление экспрессии генов, может быть включена для тестирования механизмов фенотипов, наблюдаемых при экспрессии представляющего интерес белка. Для этого нужно включить по 150 нг каждой из трех конструкций ДНК в смесь ДНК и соответствующим образом отрегулировать количество реагента-усилителя трансфекции. Изменение параметров ДНК или реагента для липофекции может повлиять на эффективность трансфекции и может быть скорректировано в зависимости от потребности в более или менее эффективных трансфекциях.
3. Добавьте 32 мкл смеси для трансфекции липидов в каждую пробирку ДНК. Осторожно покачивайте рукой, чтобы перемешать. Выдерживать при комнатной температуре в течение 30 минут.
4. Медленно добавьте 64 мкл смеси ДНК/трансфективных реагентов в клетки, поместив кончик пипетки чуть ниже поверхности среды и перемещаясь в змеевидном движении по всей лунке. Аккуратно покачиваем камерную горку вручную 3 раза, после добавления во все лунки перемешиваем дальше и помещаем камерную горку в инкубатор. Инкубировать при 37 °C и 5%_CO2 в течение 2 ч.
   Примечание: Сведите к минимуму время, в течение которого нейроны находятся вне инкубатора, так как они очень чувствительны к изменениям температуры и pH, которые могут произойти быстро.
5. Половину средней замены проводят через 2 ч после трансфекции кондиционированной средой + антитело к нейрофасцину. Непосредственно перед сменой среды собирают 1,5 мл кондиционированного безантибиотикового НБМ из клеток, культивируемых на 24-луночном планшете. Добавьте 0,75 мкл антитела к Нейрофасцину 186 (NF-186) (500 нг/мл) в кондиционированную среду.
   Антитело NF-186 обнаруживает внеклеточный домен нейрофасцина, обогащенный в начальном сегменте аксона (AIS), чтобы окончательно идентифицировать аксон для визуализации.
6. Проводят полную смену среды через 18 ч после трансфекции кондиционированной средой, содержащей вторичное антитело. Добавьте 1 мкл вторичного антитела козы против кролика, конъюгированного с AlexaFluor 647, к 3 мл кондиционированного NBM (без антибиотиков), собранного из 24-луночного планшета. Хорошо перемешайте.

4. Визуализация нейронов

1. Подготовьтесь к визуализации через 2 дня после трансфекции. Нагрейте насадку камеры с живыми клетками для конфокального микроскопа до 37 °C (включая 60-кратный объектив и масло для линз) и уравновесьте камеру до 5%_CO2.
2. Используйте объектив с большим увеличением и камеру живых клеток для получения изображений клеток.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Мы используем объектив 60x 1,40 NA на лазерном сканирующем конфокальном микроскопе, но можно использовать и другие конфокальные (например, вращающиеся диски) или широкопольные системы флуоресцентной микроскопии, если они способны обеспечить высокую частоту кадров изображения.
3. Визуальная идентификация трансфицированных нейронов в канале, содержащем карго-белок, с помощью окуляров. Затем визуализируйте нейроны, чтобы идентифицировать AIS в канале Cy5 (рис. 1).
4. Установите поле зрения на прямоугольное поле 32 на 128 пикселей и переместите его, чтобы отобразить область аксона на расстоянии ~50-150 мкм дистальнее AIS. Отмечайте и записывайте направленность грузового транспорта и направленность ROI. Точки на коробке будут отображаться как верх и справа, соответственно, любых последующих изображений и фильмов. Запишите, какая сторона изображения находится ближе всего к телу клетки, а какая ближе всего к концу аксона, чтобы полилиния кимографа на шаге 5.1 могла быть построена в правильной ориентации.
   ПРИМЕЧАНИЕ: При выборе области интереса отображаемая область изолированного аксона должна быть относительно прямой и пересекать поле зрения на каждом конце. Весь отрезок должен находиться в пределах одной фокальной плоскости. На площадке должен четко отображаться активный транспорт груза. Чрезмерно яркие нейроны обычно экспрессируют интересующий их белок и белки на уровнях, которые могут быть токсичными для нейронов и их следует избегать.
5. Установите мощность лазера 561 на 1.40, отверстие для отверстия на 7.8, Размер на 128 пикселей² и Скорость на 32 кадра/с. Отрегулируйте усиление , чтобы визуализировать транспортировку отдельных грузовых везикул, не загораживая его фоновым сигналом (обычно от 10 до 50 результатов в высококачественных кимографах).
   ПРИМЕЧАНИЕ: Чрезвычайно низкая мощность лазера достижима благодаря высокочувствительным детекторам GaAsP и предотвращает потенциальное фототоксическое воздействие и фотообесцвечивание движущегося груза. Размер точечного отверстия устанавливается как можно шире, чтобы увеличить глубину фокуса и гарантировать отображение всей рентабельности инвестиций, поскольку аксон может не лежать идеально ровно на поверхности предметного стекла.
6. Установите ROI , выбрав Draw Rectangular ROI... в раскрывающемся меню ROI . Нарисуйте ROI так, чтобы он охватывал все поле зрения. Щелкните правой кнопкой мыши по ROI и выберите «Использовать как ROI для стимуляции: S1».
7. Подготовьте настройку ND, включив в нее следующие шаги на вкладке «Настройка ND».
   ПРИМЕЧАНИЕ: Это пятиступенчатый протокол сбора, который настраивается один раз и затем будет выполняться программным обеспечением каждый раз, когда собираются фильмы.
   1. Получите изображение , чтобы получить эталонное изображение для предварительной стимуляции.
   2. Стимуляция; ROI: S1; Интервал: NoDelay; Продолжительность 1,64 с, Циклы: 7. На этом этапе фоновая флуоресценция обесцвечивается несколькими импульсами лазера.
   3. Приобретите изображение. На этом этапе собирается эталонное изображение после стимуляции.
   4. Ожидание; No Action; 2 мин. Этот шаг обеспечивает период восстановления флуоресцентного груза для повторного заполнения окупаемой окупаемости инвестиций.
   5. Приобретение; Интервал: NoDelay; Продолжительность 5 мин, Петли: 8,615. На этом этапе изображения собираются с максимальной скоростью в течение 5-минутного периода визуализации.
8. После настройки протокола ND нажмите кнопку «Применить настройки стимуляции » на вкладке «Настройка ND ». Нажмите кнопку Run Now , когда будете готовы к изображению грузового транспорта. Это запустит протокол сбора данных ND с шага 4.7.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Хотя частота кадров установлена на 32 кадра/с, практическая частота кадров может быть ниже (~28,7 кадров/с). Это значение должно быть записано для точного анализа кимографа в разделе 5. В идеале визуализация при транспортировке живых клеток должна выполняться с максимально возможной частотой кадров (например, >25 кадров/с) для лучшей расшифровки перемещений груза.
9. Сбросьте поле зрения на все изображение; затем соберите и сохраните изображение всего нейрона в каналах 561 и 647 с включенным блоком ROI. Запишите координаты XY, в которых был сделан снимок, для постфиксации подтверждения экспрессии интересующего белка.
10. Соберите транспортные видео как минимум с двух нейронов для анализа. Убедитесь, что каждая независимая репликация происходит из средних переменных, измеренных на основе сбора отдельных первичных нейронов (т.е. а не отдельных нейронов).
    ПРИМЕЧАНИЕ: Для сбора данных первичных нейронов мы собираем видео с 2-4 нейронов в каждом состоянии.
11. Зафиксируйте клетки, удалив среду и инкубируя с предварительно подогретым 4% параформальдегидом в течение 20 минут при комнатной температуре. Снимите буфер и промойте ячейки на 3 x 5 минут каждая в TBS.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Для фиксации параформальдегида мы используем цитоскелетный буфер, общий буфер, который поддерживает цитоскелетную структуру (10 мМ 2-(N-морфолино)этансульфоновой кислоты [MES], 138 мМ KCl, 3 мМ MgCl₂ и 4 мМ EGTA, pH 6,1). Другие буферы (например, TBS, PBS) также могут быть использованы для фиксации.
12. Подтвердите, что анализируемые нейроны экспрессируют как интересующий белок, так и флуоресцентно помеченный грузовой белок посредством иммуноцитофлуоресцентного окрашивания. Окрашивание человеческого тау-белка (Tau12) для подтверждения экспрессии экзогенного тау-белка и тубулина β-III (Tuj1) для подтверждения того, что нейроны оставались здоровыми на протяжении всего процесса визуализации.
    Примечание: Мы наблюдаем совместную экспрессию обеих конструкций ДНК почти во всех трансфицированных клетках с использованием этих методов.

5. Генерация и анализ кимографов

ПРИМЕЧАНИЕ: Кимографы могут быть созданы и проанализированы с помощью различных программ. Кратко опишем свободно доступное программное обеспечение KymoAnalyzer (v. 1.01) с использованием шести плагинов ImageJ (v. 1.51n)¹⁶. Эти плагины можно скачать у разработчиков на веб-сайте лаборатории Encalada (https://www.encalada.scripps.edu/kymoanalyzer). Более подробную инструкцию по использованию данного программного обеспечения можно найти на этом сайте.

1. Сгруппируйте видеоролики, созданные на шаге 4.9 на основе экспериментальных условий, и повторите. Запустите макрос BatchKymographGeneration и выберите соответствующую папку. Нарисуйте полилинию кимографа, чтобы обвести аксон, начиная с проксимального конца на этом конкретном изображении. Полученные кимографы хранятся в выбранной папке (рисунок 2).
2. Чтобы назначить дорожки вручную, запустите макрос «Дорожки», выберите отдельную папку с фильмом, нажмите « Да », чтобы добавить дорожку, а затем щелкните, чтобы отслеживать траекторию каждой частицы. Выполните первоначальный щелчок в верхней части дорожки и щелкните еще раз в каждой точке, где частица изменяет скорость или направление, чтобы полилиния накладывала траекторию частицы на кимограф. После того как полилиния будет наложена на всю дорожку, нажмите OK. Повторяйте до тех пор, пока не будут назначены все дорожки.
3. Запустите оставшиеся макросы, назначив частоту кадров и размер пикселей на основе параметров изображения. Сначала запустите CargoPopulation, затем NetCargoPopulation, а затем Segments. Введите размер пикселя и частоту кадров фильмов при появлении запроса (0,22 мкм и 28,7 кадра/с соответственно с этими настройками). Наконец, запустите макрос poolData для вычисления и объединения данных о параметрах транспорта со всех кимографов в выбранной папке.
4. Построение графиков результатов из файлов данных и сравнение различных условий с независимыми репликациями, представленными средними значениями всех проанализированных нейронов в экспериментальных условиях для отдельного сбора нейронов.

Результаты

Используя эти методы, мы охарактеризовали аксональный транспорт в присутствии дикого типа или связанных с заболеванием форм тау-белка для изучения потенциальных механизмов патологической нейротоксичности, вызванной тау-индуцированием при^{заболевании 12,13}. Программное обеспечение KymoAnalyzer рассчитывает и объединяет множество различных параметров из всех кимографов в заданной папке. Транспортные ставки рассчитываются только тогда, когда груз находится в движении...

Обсуждение

Появляется все больше доказательств того, что множественные патологические белки, связанные с различными нейродегенеративными расстройствами, нарушают быстрый аксональный транспорт в нейронах. Это представляет собой потенциальный общий механизм нейротоксичности при этих заболеваниях. Чтобы лучше понять процесс, с помощью которого эти белки нарушают транспорт, нам нужны инструменты и модели, которые позволят нам ответить на конкретные вопросы. Описанный здесь метод позволяет изучить механ...

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье

Имя	Компания	Каталожный номер	Комментарии
0,4% трипановый синий	Gibco	15250-061
1,7 мл микроцентрифужные пробирки	DOT	RN1700-GMT
2,5% трипсин	Gibco	15090-046
3 мл шприц с иглой 21 г	Fisher	14-826-84
10 мл пластиковый шприц	Fisher	14-823-2A
14 г игла	Fisher	14-817-203
Игла 15 G Medline		SWD200029Z
16 G игла	Fisher	14-817-104
18 G игла	Fisher	14-840-97
22 G игла	Fisher	14-840-90
32% параформальдегид	Fisher	50-980-495
AlexaFluor 647 козий антикролиацкий IgG (H+L)	Invitrogen	A21244	RRID:AB_2535813
Амфотерицин B	Gibco	15290-026
Микроэмбриональные капсульные щипцы Arruga, изогнутые; 4"	Roboz	RS-5163	автоклав
B-27 Добавка (50x), без сыворотки	Gibco	A3582801
BioCoat 24-луночные Poly D лизиновые пластины	Fisher	08-774-124
борная кислота	Sigma	B6768-1KG
Хлорид кальция	Sigma	C7902
Castroviejo 3 1/2" Длина 8 x 0,15 мм Угол Острые ножницы	Roboz	RS-5658	автоклав
		для подсчета клеток	автоматический или ручной
Конфокальный микроскоп с насадкой	камеры живых клеток
Программное обеспечение
D-(+)-глюкоза	Sigma	G7528
ДНКаза I (Worthington)	Fisher	NC9185812
Dulbecco's Phosphate Buffered Salt	Gibco	14200-075
EGTA	Fisher	O2783-100
Fatal-Plus Solution	Vortech Pharmaceuticals, LTD	NDC 0298-9373-68	натрия пентобарбитал; могут быть использованы другие одобренные методы эвтаназии;
Фетальная бычья сыворотка	Инвитроген	16000044
раствор реагента гентамицина	Gibco	15710-072
GlutaMAX	Gibco	35050-061	заменитель глютамина
Сбалансированный солевой раствор Хэнкса	Gibco	24020-117
ImageJ версия 1.51n	ImageJ		Life-Line версия 2017 30 мая: https://imagej.net/software/fiji/downloads
KymoAnalyzer (версия 1.01)	Пакет Encalada Lab		включает в себя все 6 макросов: https://www.encalada.scripps.edu/kymoanalyzer
Lipofectamine 3000	Invitrogen	100022050	Использование с реагентом усилителем трансфекции P3000
Хлорид магния	Fisher	AC223211000
MES-гидрат	Sigma	M8250
Микроножницы для препарирования 3,5 дюйма Прямой Острый/Острый	Roboz	RS-5910	автоклав
Neurobasal Plus средний	Gibco	A3582901
Neurofascin (A12/18) Мышь IgG2a	UC Davis/NIH NeuroMab	75-172	RRID:AB_2282826; 250 нг/мл; Работает на нейронах крыс, НЕ на нейронах мыши
Neurofascin 186 (D6G60) Rabbit IgG	Cell Signaling	15034	RRID:AB_2773024; 500 нг/мл; Работает на нейронах мыши, мы не тестировали на нейронах новорожденных
телят сыворотку	Gibco	16010-167
Opti-MEM	Gibco	31985-062
P3000	Invitrogen	100022057
чашкой Петри, 100 x 10 мм стекло	Fisher	08-748B	Для вскрытия; автоклав
чашка Петри, 100 x 20 мм стекло	Fisher	08-748D	Поместить в него рога матки; автоклав
Поли-Д-лизин	Sigma	P7886-100MG
Полипропиленовые конические центрифужные пробирки (15 мл)	Fisher	14-955-238
Полипропиленовые конические центрифужные пробирки (50 мл)	Fisher	14-955-238
Хлорид калия	Fisher	P217-500
Ацетат натрия	Sigma	S5636
борат натрия декагидрат	VWR	MK745706
Операционные ножницы с прямым лезвием Тупой/острый	Fisher	13-810-2	автоклавные
шприцевые фильтры, 0,22 &; m	VWR	514-1263
Щипцы для повязки большого пальца, зубчатые, 4,5"	Roboz	RS-8100	автоклав
&микро-слайд 4 лунки со стеклянным дном	там же	80427