Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.

Методическая статья

CRISPR-Cas-опосредованный мультианалит синтетический биомаркер мочи для портативной диагностики

1.9K просмотров

⸱

DOI:

10.3791/66189

⸱

8 декабря 2023 г.

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Biomedical Engineering, Boston University, 2Institute for Medical Engineering and Science, Massachusetts Institute of Technology, 3Koch Institute for Integrative Cancer Research, Massachusetts Institute of Technology, 4Howard Hughes Medical Institute, 5Broad Institute of Massachusetts Institute of Technology and Harvard, 6Department of Electrical Engineering and Computer Science, Massachusetts Institute of Technology, 7Department of Electrical Engineering and Computer Science, Massachusetts Institute of Technology, 8Department of Medicine, Brigham and Women’s Hospital and Harvard Medical School

В этой статье

Краткое содержание

Этот протокол описывает CRISPR-Cas-опосредованный мультианалитный синтетический биомаркер мочи, который позволяет диагностировать рак в месте оказания медицинской помощи с помощью анализа активности опухоль-ассоциированной протеазы ex vivo.

Аннотация

Создание синтетических биомаркеров для разработки прецизионной диагностики позволило выявлять заболевания с помощью путей, выходящих за рамки тех, которые используются для традиционных измерений биожидкости. Синтетические биомаркеры, как правило, используют репортеры, которые обеспечивают читаемые сигналы в биожидкости, чтобы отразить биохимические изменения в локальном микроокружении болезни во время заболеваемости и прогрессирования заболевания. Фармакокинетическая концентрация репортеров и биохимическая амплификация сигнала заболевания имеют первостепенное значение для достижения высокой чувствительности и специфичности диагностического теста. Здесь платформа для диагностики рака построена с использованием одного из форматов синтетических биомаркеров: основанных на активности наносенсоров, несущих химически стабилизированную ДНК-репортеры, которые могут быть высвобождены аберрантными протеолитическими сигнатурами в микроокружении опухоли. Синтетическая ДНК в качестве источника информации о заболевании обеспечивает возможность мультиплексирования благодаря использованию в качестве штрих-кода, что позволяет считывать несколько протеолитических сигнатур одновременно. ДНК-репортеры, высвобождаемые в мочу, обнаруживаются с помощью нуклеаз CRISPR путем гибридизации с РНК CRISPR, которые, в свою очередь, производят флуоресцентный или колориметрический сигнал при активации фермента. В этом протоколе конструируются наносенсоры со штрих-кодом ДНК, основанные на активности, и их применение иллюстрируется на доклинической мышиной модели метастатического колоректального рака. Эта система легко модифицируется в соответствии с биологией заболевания и генерирует несколько сигналов заболевания одновременно, обеспечивая всестороннее понимание характеристик заболевания с помощью минимально инвазивного процесса, требующего только введения нанодатчиков, сбора мочи и бумажного теста, который позволяет проводить диагностику в месте оказания медицинской помощи.

Введение

Несмотря на значительные усилия по выявлению опухолевых биомаркеров, таких как выделенные белки и ДНК, область диагностики рака была напряжена из-за их низкой распространенности или быстрой деградации в кровообращении. В качестве дополнительной стратегии биоинженерные синтетические биомаркеры, которые избирательно реагируют на особенности заболевания для генерации усиленных сигналов, представляют собой новые возможности для точной и доступной диагностики 2,3. Чтобы облегчить обнаружение, эти синтетические биомаркеры используют опухолезависимые механизмы активации, такие как ферментативная амплификация, для получения аналитов с улучшенным отношением сигнал/шум4. При этом класс ферментов, связанных с раком, протеаз, используется для активации инъекционных наноразмерных сенсоров для высвобождения сигналов о заболевании, обнаруживаемых из биожидкостей, таких как кровь илимоча. В свете гетерогенности опухоли разработка панели сенсоров, активируемых протеазой, позволяет проводить мультианалитические тесты, которые объединяют различные события расщепления протеазы в «сигнатуру заболевания» для оценки заболеваемости и прогрессирования рака более специфичным, мультиплексным образом.

Были разработаны синтетические биомаркеры, активируемые протеазой, которые содержат пептидные субстраты, конъюгированные с поверхностью инертного носителя7. При введении in vivo эти пептиды переносятся в опухоль, после чего ферментативное расщепление опухолевыми протеазами высвобождает репортеров в кровь или мочу для обнаружения. Мультиплексное обнаружение с помощью синтетических биомаркеров, активируемых протеазой, требует, чтобы каждый синтетический биомаркер в составе коктейля был помечен уникальным молекулярным штрих-кодом. С этой целью были разработаны различные подходы, в том числе массовые штрих-коды и лиганд-кодированные репортеры 8,9,10. В отличие от этих методов мультиплексирования, которые могут быть ограничены несколькими различными сигнальными возможностями, штрих-кодирование ДНК позволяет получить гораздо больше комбинаций в соответствии с высокой сложностью и гетерогенностью болезненных состояний человека. Чтобы расширить мультиплексность синтетических биомаркеров, датчики получают штрих-код, помечая каждого репортера уникальной последовательностью ДНК для обнаружения с помощью нуклеазы CRISPR-Cas для усиления биофлюидного сигнала ex vivo. Эти штрих-коды одноцепочечной ДНК (ssDNA) предназначены для связывания с комплементарными направляющими РНК CRISPR (crRNAs), активируя активность коллатеральной нуклеазы CRISPR-Cas12a11. Эта нуклеазная активность может быть использована для расщепления репортерной цепи ДНК, обнаруженной с помощью кинетики флуоресценции или с помощью бумажных полосок.

В дополнение к молекулярной амплификации с помощью протеаз (in vivo) и CRISPR-Cas (ex vivo), еще одной ключевой особенностью конструкции синтетических биомаркеров, активируемых протеазой, является использование фармакокинетики наноматериалов для увеличения концентрации диагностических сигналов в биожидкостях10. Одним из подходов является использование носителя наночастиц для увеличения времени циркуляции поверхностно-конъюгированных пептидных субстратов. В качестве наноносителя с относительно небольшим гидродинамическим диаметром и мультивалентностью выбран дендример полиэтиленгликоля (ПЭГ) для увеличения доставки к опухолям. Несмотря на то, что он достаточно мал, чтобы способствовать доставке опухоли, размер носителя ПЭГ больше, чем граница размера ~5 нм барьера фильтрации клубочков почек, так что только расщепленные пептидные субстраты могут быть очищены в моче, используя преимущества фильтрации по размеру почками12. В этом протоколе описан многоступенчатый рабочий процесс для синтеза и применения наносенсоров, основанных на активности ДНК со штрих-кодом, в доклинической мышиной модели, подчеркивая настройку CRISPR-Cas-опосредованного, мультианализируемого синтетического биомаркера мочи, который был использован этой группой для классификации статуса заболевания в мышиных моделях нескольких типов рака13. Благодаря универсальному принципу конструкции все три функциональных компонента наносенсора - наноноситель (полимер ПЭГ), модуль, реагирующий на стимулы (субстрат, активируемый протеазой) и биофлюидный репортер (штрих-код ДНК) - могут быть точно взаимозаменяемы в соответствии с потребностями конкретного применения, что обеспечивает модульность за счет адаптации к мишени и особенностям выпуска.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

Все исследования на животных одобряются Комитетом по уходу за животными и их использованию (IACUC) в учреждении авторов. Для надлежащего проведения этих экспериментов требуются стандартные помещения по уходу за животными, включая камеры содержания, стерильные капюшоны, анестезию и этичную конечную эвтаназию. Все эксперименты проводятся в соответствии с институциональными и национальными рекомендациями и под наблюдением ветеринарного персонала учреждения. Самки мышей линии BALB/c, использованные для экспериментов, были получены из коммерческого источника (см. таблицу материалов) и имели возраст от 6 до 8 недель в начале исследования. Последовательности для специально синтезированных ДНК, крРНК, пептидных субстратных зондов на основе FRET и сенсорных пептидов представлены в дополнительной таблице 1.

1. Выбор пептидного субстрата, активируемого протеазой

  1. Сбор и подготовка образцов тканей из здоровых легких или легочной ткани с опухолевыми узелками в соответствии с ранее опубликованным отчетом13.
    1. Гомогенизируйте ткани в предварительно охлажденном фосфатно-солевом буфере (PBS, pH 7,4) (200 мг ткани/мл PBS) с помощью тканевых диссоциационных трубок для автоматической диссоциации тканей на одноклеточные суспензии.
    2. Центрифуга гомогенирует ткани при 6 000 x g в течение 5 мин при 4 °C. Задержите надосадочную жидкость в новой пробирке.
    3. Центрифугу надосадочной жидкости при 14 000 x g в течение 25 мин при 4 °C.
    4. Измерьте концентрацию белка с помощью набора для анализа белков бисинхониновой кислоты (BCA) (см. таблицу материалов).
    5. Добавьте PBS в образец для приготовления раствора 0,33 мг/мл.
  2. Оцените протеолитическую активность, выполнив следующие действия.
    1. В 384-луночном планшете добавьте 5 мкл, 6 мкМ пептидных субстратов на основе FRET в каждую лунку. Для каждого зонда выполните реакцию в трех экземплярах.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Пептидный субстратный зонд на основе FRET содержит короткую пептидную последовательность (6-8 аминокислот, специфичных для целевой протеазы или группы протеаз), оканчивающуюся парой флуорофор и гаситель. В качестве примера в Дополнительной таблице 1 описаны два FRET-зонда. Полную библиотеку зондов можно найти в Hao et al.13. См.
    2. Центрифугируйте луночный планшет в течение 10 секунд при комнатной температуре при 180 x g , чтобы убедиться, что зонды находятся на дне планшета.
    3. Добавьте 25 мкл 0,33 мг/мл образца ткани или 40 мкМ рекомбинантной протеазы13 в каждую лунку.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Окончательная концентрация образца ткани или рекомбинантной протеазы может быть оптимизирована в соответствии с их собственной протеолитической активностью. Например, высокопротеолитические ткани, такие как кишечник, могут требовать более высоких коэффициентов разбавления, чтобы обеспечить мониторинг начального ферментативного расщепления.
    4. Кратковременно центрифугируйте луночный планшет при 180 x g (при комнатной температуре), чтобы смешать зонды и тканевые лизаты.
    5. Немедленно приступайте к обнаружению расщепления зонда, измеряя флуоресценцию с помощью планшетного ридера при 37 °C каждые 2 минуты в течение 1 ч (λex: 485 нм; λem: 535 нм) для контроля спайности.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Используйте соответствующие длины волн возбуждения и излучения для определенных пар флуорофора и гасителя. В данном исследовании для флуорофора FAM задаются параметры (λex: 485 нм и λem: 535 нм).
    6. Для анализа данных флуоресцентных измерений используйте пакет Python (см. Таблицу материалов) для анализа кинетики ферментов, доступный в https://github.com/nharzallah/NNanotech-Kinetic. Этот скрипт вычисляет начальную скорость реакции (V0), используя наклон линейной аппроксимации первых 8-10 начальных временных точек.

2. Формулировка и определение характеристик датчика

  1. Синтезируют конъюгат ДНК и пептида, активируемого протеазой (PAP).
    1. Инкубируют 20-мерные фосфоротиационные репортеры ДНК с 3'-DBCO группой (1,1 экв., см. таблицу материалов) с азид-концевыми ПАП с С-концевым цистеиновым концом в 100 мМ фосфатном буфере (рН 7,0) при комнатной температуре в течение >4 ч. Если оставить на ночь, инкубируйте при 4 °C.
    2. Очистите продукт с помощью высокоэффективной системы жидкостной хроматографии (ВЭЖХ), оснащенной колонкой, идеально подходящей для биомолекул (см. Таблицу материалов). Установите градиент ВЭЖХ так, чтобы он начинался с 5% буфера А (0,05% ТЖК в H2O), выдерживали изократический в течение 20 мин и достигали буфера 80% B (0,05% ТЖК, 99,95% ацетонитрила) через 65 мин с расходом 0,3 мл мин-1 и собирали сопряженный продукт со временем удержания при ~31 мин.
    3. Валидация очищенных конъюгатов с помощью масс-спектрометрии с матричной лазерной десорбцией/ионизацией во время пролета (MALDI-TOF) с использованием α-циано-4-гидроксикоричной кислоты в качестве матрицы14 (см. таблицу материалов).
  2. Синтез ДНК-кодируемых наносенсоров на основе активности.
    1. Растворяют 2 мг поливалентного ПЭГ (40 кДа, 8-плечо, см. таблицу материалов) с малеимидно-реактивной группой в 1 мл 100 мМ фосфатного буфера (рН 7,0) и фильтра (отсечка: 0,2 мкм).
    2. Добавьте концевые конъюгаты ДНК-пептидов (2 экв., см. таблицу материалов) к ПЭГ и реагируйте при комнатной температуре в течение >4 ч. Если оставить на ночь, инкубируйте при 4 °C.
    3. Удаляют неконъюгированные материалы с помощью эксклюзионной хроматографии с коммерчески доступной композитной матричной колонкой декстрана-агарозы на жидкостной хроматографии быстрого белка (FPLC) (см. таблицу материалов). Запускайте образцы в PBS и контролируйте поглощение на длине волны 260 нм для ДНК и 280 нм для пептида.
    4. Сконцентрировать синтезированные наносенсоры центробежными фильтрующими трубками (MWCO = 10 кДа) в соответствии с рекомендуемой производителем скоростью (см. таблицу материалов).
    5. Количественно определите концентрацию ДНК с помощью набора для анализа ssDNA (см. таблицу материалов) и планшетного ридера при λex: 485 нм и λem: 535 нм. Храните наносенсоры при температуре 4 °C.
  3. Охарактеризовать ДНК-кодируемые наносенсоры, основанные на активности.
    1. Измерение гидродинамического размера частиц наносенсоров, кодируемых в ДНК, с помощью динамического рассеяния света (DLS).
      ПРИМЕЧАНИЕ: Ожидаемый диапазон размеров наносенсоров составляет 15-50 нм, со средним размером 20-30 нм. Если требуется ограниченный диапазон размеров, FPLC (на этапе 2.3) можно использовать для выделения более узких фракций с различной молекулярной массой.
    2. Концентрируют наносенсоры до 0,5 мг/мл (по концентрации ДНК) с помощью центробежных фильтрующих трубок (MWCO = 10 кДа) и загружают образцы на медную сетку с углеродным покрытием, установленную на криодержателе. Наблюдение морфологии с помощью криогенной просвечивающей электронной микроскопии (200 кВ, увеличение 10 000–60 000)14.

3. Инъекция датчика и сбор мочи

  1. Соберите мочу для базового измерения.
    1. Поместите мышь в специальную камеру корпуса (см. дополнительный рисунок 1) с 96-луночной пластиной в качестве основания.
    2. Удерживайте мышь и слегка надавите на мочевой пузырь, чтобы опорожнить оставшуюся мочу на тарелку.
    3. Скопив собранную мочу (~100-200 мкл) из 96-луночного планшета в пробирку объемом 1,5 мл после замены мыши на нормальный корпус.
  2. Создание доклинической модели мышиной опухоли.
    1. Инокуляцию 6-8-недельным самкам мышей BALB/c путем внутривенной инъекции клеточной линии MC26-Fluc, экспрессирующей люциферазу (100 тыс. клеток на мышь) (см. таблицу материалов). Еженедельно контролируйте прогрессирование опухоли с помощью системы флуоресцентной визуализации in vivo .
      ПРИМЕЧАНИЕ: Видимая опухолевая нагрузка, на которую указывает люминесцентный сигнал, возникает примерно на 2-й неделе после инъекции этой конкретной клеточной линии. Тщательно осматривайте животных с опухолью во время прогрессирования опухоли на регулярной основе.
  3. Вводите наносенсоры в разные моменты времени после имплантации опухоли.
    1. Приготовьте раствор для инъекций (максимальный объем 200 мкл), содержащий наносенсоры в концентрации 1 нмоль по штрих-коду ДНК в стерильном PBS.
    2. Введите 200 мкл раствора сенсора в PBS каждой экспериментальной мыши внутривенно.
  4. Соберите образцы мочи у здоровых контрольных мышей и мышей с опухолью через 1 ч после введения датчика, как описано в шагах 1.1-1.3.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Свежие образцы мочи могут быть обработаны для анализа штрих-кода ДНК напрямую или сразу же заморожены на льду.

4. CRISPR-детектирование штрих-кодов ДНК: на основе флуоресценции

  1. Используйте свежие образцы мочи или размораживайте замороженные образцы на льду. Центрифужные образцы мочи при 800 х г в течение 5 мин при комнатной температуре.
  2. Смешайте реагенты, указанные в дополнительной таблице 2, добавьте фермент Cas12a (см. таблицу материалов) в последнюю очередь и осторожно перемешайте реакцию путем пипетирования вверх и вниз. Инкубируют реакцию при 37 °C в течение 30 мин.
  3. Запустите реакцию репортера, как показано в дополнительной таблице 3, в трех экземплярах, используя произведение шага 2. Добавьте реакцию из шага 2 в последнюю очередь и быстро поднесите к считывающему устройству.
  4. Обнаруживайте активацию LbaCas12a, измеряя флуоресценцию с помощью планшетного ридера при 37 °C каждые 2 минуты в течение 3 ч (λex: 485 нм и λem: 535 нм) для мониторинга кинетики расщепления ДНК-репортера.
  5. Для анализа данных флуоресцентных измерений используйте пакет Python для анализа кинетики ферментов, доступный в https://github.com/nharzallah/NNanotech-Kinetic. Этот скрипт вычисляет начальную скорость реакции (V0), используя наклон линейной аппроксимации первых 8-10 начальных временных точек.

5. CRISPR-детектирование штрих-кодов ДНК: на бумажной основе

  1. Центрифужные образцы мочи при 800 х г в течение 5 мин при комнатной температуре.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Параллельно запускайте образцы мочи для обнаружения CRISPR на основе флуоресценции и на бумаге.
  2. Комбинируйте реагенты, указанные в дополнительной таблице 2. Инкубировать при 37 °C в течение 30 мин.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Этот этап инкубации идентичен этапу обнаружения CRISPR на основе флуоресценции.
  3. Запустите репортерную реакцию с использованием ДНК-репортера, меченного FAM-биотином, для анализа бокового потока на бумажной полоске (см. таблицу материалов). Объедините реагенты, указанные в дополнительной таблице 4 , в 96-луночный планшет, используя произведение шага 2. Накрыть алюминиевой фольгой и инкубировать при 37 °C в течение 1 ч.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Выберите оптимальное время инкубации в соответствии с мониторингом кинетики в режиме реального времени в флуоресцентном анализе обнаружения CRISPR, описанном выше.
  4. В свежую лунку 96-луночного планшета добавьте 80 мкл PBS. Добавьте в эту лунку 20 мкл образца с этапа 3.
  5. Поместите по одной бумажной полоске бокового потока в каждую лунку и подождите, пока жидкость не достигнет верхней части полоски (<5 минут). Обратите внимание на внешний вид контрольной полосы и/или полосы (полос) для образцов на бумажной полоске.
  6. Сфотографируйте полосу бокового потока и количественно оцените интенсивность полосы с помощью ImageJ.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

Номинирование пептидных субстратов, активируемых протеазой
Для разработки сенсоров, которые будут отражать изменения протеолитической активности ткани, активность протеазы в ткани сначала характеризуют с помощью библиотеки пептидных зондов13 (рис. 1). Свежие и замороженные образцы тканей могут дать существенную информацию о протеолитической активности микроокружения опухоли путем объединения образцов тканей с зондами FRET, предназначенными для обна...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

Здесь представлена платформа с широкими возможностями настройки для мультиплексного обнаружения рака с портативным анализом мочи, который оценивает протеолитическую активность, связанную с заболеванием, с помощью минимально инвазивного инъекционного датчика. При активации опухолевыми протеазами расщепление пептидного субстрата усиливается путем высвобождения штрих-кода ДНК в мочу. Синтетические ДНК-репортеры в образце мочи могут быть прочитаны с помощью вторичной ферментативной амплификации, опосредованной CRISP...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

S.N.B., L.H. и R.T.Z. указаны в качестве изобретателей в патентной заявке, связанной с содержанием этой работы. S.N.B. владеет долями в Glympse Bio, Satellite Bio, Lisata Therapeutics, Port Therapeutics, Intergalactic Therapeutics, Matrisome Bio, а также является директором Vertex; консультирует Moderna и получает спонсируемое финансирование исследований от Johnson & Johnson, Revitope и Owlstone.

Благодарности

Это исследование было частично поддержано грантом Института Коха No P30-CA14051 от Национального института рака (Биотехнологический центр Свенсона), грантом Основного центра P30-ES002109 от Национального института наук об окружающей среде, Мраморным центром наномедицины рака Института Коха, Программой передовых исследований Института Коха через Фонд исследования рака Кэти и Курта Марбл. и Фонд Вирджинии и Д. К. Людвига по исследованию рака. A.E.V.H. поддерживается стипендией для подготовки к докторантуре (T32GM130546), финансируемой NIH. С.Н.Б. является следователем Медицинского института Говарда Хьюза. L.H. поддерживается премией K99/R00 Pathway to Independence Award от Национального института рака и финансированием стартапа от Бостонского университета.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
10x NEB Buffer 2.1New England BiolabsB6002SVIAL
20-мерные фосфоротиоированные ДНК-репортеры с 3'-DBCO group IDTCustom DNA Agilent
1100 Высокопроизводительная система жидкостной хроматографии с колонкой Vydac 214TP510 C4  Agilentдля ВЭЖХ
Ä Быстрая белковая жидкостная хроматография KTA (FPLC)FPLC
Amicon (MWCO = 10 кДа)EMD Доступные миллипорыРазличные объемы
Azide-концевые ПАП с C-концевым цистеиномCPC Научныйпользовательский пептид
crRNAs Смотрите дополнительную таблицу 1
Криогенная просвечивающая электронная микроскопияJEM-2100FJEOLcyroTEM
Цистеиновые концированные ДНК-пептидные конъюгатыCPC ScientificCustom пептид
Динамическое рассеяние света (DLS)DLS
EnGen LbaCas12a (Cpf1), 100 µ MБиолаборатории Новой АнглииM0653T
Экспериментальные животныеTaconic BiosciencesBALB/cAnNTac6– 8  недель
бережныйMACS C трубкиMiltenyi Biotec130-093-237гомогенизация тканей
HybriDetect Универсальный набор для анализа бокового потокаMiltenyi BiotecMGHD 1
Матриксная лазерная десорбция/ионизация– время полета (MALDI– TOF) масс-спектрометрия BrukerMicroflex MALDI– Клеточная
MC26-FlucЛаборатория Кеннета К. Танабе, Массачусетская больница общего профиля
многовалентная ПЭГ (40 кДа, 8 рук) с малеимидом-реакционноспособной группойJenKemA10020-1 / 8ARM(TP)-MAL-40K,1 г
Python, версия 3.9https://www.python.org/
набор для анализа ssDNA Quant-iT OliGreen и реагент Quant-iT OliGreen ssDNAInvitrogenO11492набор для анализа
ssDNA ssDNA FAM-T10-Quencher и  FAM-T10-Biotin репортерные субстратыIDTCustom DNA
Superdex 200 Increase 10/300 GL колонкаGE HealthcareGE28-9909-44Для FPLC
Tecan Infinite Pro M200 планшетный ридерTecan
ThermoFisher Pierce BCA Protein Anasay KitThermoFisher Scientific23225
Ультрацентрифужные пробирки GE Healthcare линия TOF

Ссылки

  1. Soleimany, A. P., Bhatia, S. N. Activity-based diagnostics: an emerging paradigm for disease detection and monitoring. Trends Mol Med. 26 (5), 450-468 (2020).
  2. Muir, R. K., Guerra, M., Bogyo, M. M. Activity-based diagnostics: recent advances in the development of probes for use with diverse detection modalities. ACS Chem Biol. 17 (2), 281-291 (2022).
  3. Heitzer, E., Haque, I. S., Roberts, C. E. S., Speicher, M. R. Current and future perspectives of liquid biopsies in genomics-driven oncology. Nat Rev Genet. 20 (2), 71-88 (2019).
  4. Dudani, J. S., Warren, A. D., Bhatia, S. N. Harnessing protease activity to improve cancer care. Annu Rev Canc Biol. 2, 353-376 (2018).
  5. Hanahan, D. Hallmarks of cancer: new dimensions. Cancer Discov. 12 (1), 31-46 (2022).
  6. Quail, D. F., Joyce, J. A. Microenvironmental regulation of tumor progression and metastasis. Nat Med. 19 (11), 1423-1437 (2013).
  7. Kwong, G. A., et al. Synthetic biomarkers: a twenty-first century path to early cancer detection. Nat Rev Cancer. 21 (10), 655-668 (2021).
  8. Kirkpatrick, J. D., et al. Urinary detection of lung cancer in mice via noninvasive pulmonary protease profiling. Sci Transl Med. 12 (537), eaaw0262(2020).
  9. Warren, A. D., et al. Disease detection by ultrasensitive quantification of microdosed synthetic urinary biomarkers. J Am Chem Soc. 136 (39), 13709-13714 (2014).
  10. Kwong, G. A., et al. Mass-encoded synthetic biomarkers for multiplexed urinary monitoring of disease. Nat Biotechnol. 31 (1), 63-70 (2013).
  11. Chen, J. S., et al. CRISPR-Cas12a target binding unleashes indiscriminate single-stranded DNase activity. Science. 360 (6387), 436-439 (2018).
  12. Choi, H. S., et al. Renal clearance of quantum dots. Nat Biotechnol. 25 (10), 1165-1170 (2007).
  13. Hao, L., et al. CRISPR-Cas-amplified urinary biomarkers for multiplexed and portable cancer diagnostics. Nat Nanotechnol. 18 (7), 798-807 (2023).
  14. Hao, L., et al. Microenvironment-triggered multimodal precision diagnostics. Nat Mater. 20 (10), 1440-1448 (2021).
  15. Ghanta, K. S., et al. 5'-Modifications improve potency and efficacy of DNA donors for precision genome editing. Elife. 10, e72216(2021).
  16. Bekkevold, C. M., Robertson, K. L., Reinhard, M. K., Battles, A. H., Rowland, N. E. Dehydration parameters and standards for laboratory mice. J Am Assoc Lab Anim Sci. 52 (3), 233-239 (2013).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Больше статей

Синтетические биомаркерыдиагностика на основе CRISPRДНК-штрихкодыактивные наносенсорыпротеолитические сигнатурымультиплексное детектированиедиагностика ракатест на бумажной основе
CRISPR-Cas-опосредованный мультианалит синтетический биомаркер мочи для портативной диагностики
Связаться с нами
Порекомендовать библиотеке

Конфиденциальность

Условия использования

Политики

© 2026 MyJoVE Corporation. Все права защищены.