В этой статье мы представляем комплексный протокол для генерации и последующего анализа органоидов человеческого мозга с использованием секвенирования одиночных клеток и одноядерных РНК.
Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.
Методическая статья
Генерация и последующий анализ одноклеточных и одноядерных транскриптомов в органоидах мозга
* These authors contributed equally
В этой статье
Краткое содержание
Аннотация
За последнее десятилетие транскриптомика одиночных клеток значительно эволюционировала и стала стандартным лабораторным методом для одновременного анализа профилей экспрессии генов отдельных клеток, позволяющим улавливать клеточное разнообразие. Для преодоления ограничений, связанных с трудно изолируемыми типами клеток, для секвенирования может быть использован альтернативный подход, направленный на восстановление отдельных ядер вместо интактных клеток, что делает транскриптомное профилирование отдельных клеток универсально применимым. Эти методы стали краеугольным камнем в изучении органоидов мозга, установив их в качестве моделей развивающегося человеческого мозга. Используя потенциал одноклеточной и одноядерной транскриптомики в исследованиях органоидов мозга, этот протокол представляет собой пошаговое руководство, охватывающее ключевые процедуры, такие как диссоциация органоидов, выделение одиночных клеток или ядер, подготовка библиотеки и секвенирование. Реализуя эти альтернативные подходы, исследователи могут получить высококачественные наборы данных, позволяющие идентифицировать типы нейронных и ненейрональных клеток, профили экспрессии генов и траектории клеточной линии. Это способствует всестороннему исследованию клеточных процессов и молекулярных механизмов, формирующих развитие мозга.
Введение
В последние годы органоидные технологии стали перспективным инструментом для культивирования органоподобных тканей 1,2,3. Особенно для органов, которые не могут быть легко доступны, таких как человеческий мозг, органоиды дают возможность получить представление о развитиии проявлении болезней. Таким образом, органоиды мозга широко используются в качестве экспериментальной модели для исследования различных расстройств мозга человека, включая заболевания развития, психиатрические или даже
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Протокол
Описанный протокол выполнен в лаборатории уровня биобезопасности 1 Центра молекулярной медицины им. Макса Дельбрюка (номер одобрения: 138/08), в соответствии с требованиями и в соответствии с правилами ЕС и национальными правилами этики в исследованиях.
1. Получение органоидов переднего мозга из индуцированных плюрипотентных стволовых клеток (ИПСК)
Примечание: Этот протокол был протестирован для нескольких различных линий iPSC, культивируемых в различных средах стволовых клеток от разных компаний (Таблица 1). Генерация органоидов переднего мозга в значительной степени зависит от вы....
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Результаты
Для исследования клеточного состава органоидов головного мозга с использованием scRNA-seq и snRNA-seq органоиды мозга были собраны после 30 дней культивирования, поскольку органоиды на этой стадии уже демонстрируют нейроэпителиальные петли, состоящие из предшественников, окруженных промежуточными предшественниками и нейронами ранних стадий 4,18. Мониторинг качества органоидов на протяжении всего роста и культивирования имеет важное значение для получения надежных.......
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Обсуждение
Транскриптомный анализ отдельных клеток и отдельных ядер стал ключевым инструментом для понимания механизмов регуляции генов в сложных тканях. Оба метода позволяют проводить транскриптомные исследования органоидов мозга. Для обеспечения общего успеха эксперимента большое значение имеет качество исходного материала. Поэтому необходимо регулярно резать органоиды, чтобы не допустить образования некротического ядра26. Эту проблему также можно устранить с помощью культуры раздела воздух-жидкость
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Раскрытие информации
Авторы заявляют об отсутствии конкурирующих финансовых интересов.
Благодарности
Благодарим Валерию Фернандес-Валлоне за оригинальную инструкцию к набору Miltenyi Neural Dissociation. Мы также благодарим технологическую платформу геномики Центра Макса Дельбрюка за предоставленный рецепт буфера для лизиса NP40 и ценные советы по настройке этого протокола. Мы также благодарим Маргарету Херцог и Александру Чернычев за организационную поддержку лаборатории.
....Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Материалы
| Имя | Компания | Каталожный номер | Комментарии |
|---|---|---|---|
| 1,4-DITHIO-DL-THREIT-LSG., F. D. MOL.-BIOL., ~1 М В H2O (DTT) | Sigma | 43816-10ML | |
| 1,5 мл ДНК пробирки с низким связыванием | VWR | 525-0130 | микроцентрифужная трубка |
| 10x Cellranger pipeline | Пробирка для анализа | ||
| 15 мл Falcon | Falcon Центрифуга | ||
| 2-меркаптоэтанол (BME) | Life Technologies | 21985023 | |
| 50 мл Falcon | Falcon Центрифуга пробирка | ||
| A83-01 | Bio Technologies | 379762 | |
| Антибиотик/Антимикотический раствор (100X) | Life Technologies | 15240062 | |
| Добавка B-27 Plus Life | Technologies | 17504044 | |
| Добавка B-27 без витамина А | Life Technologies | 12587010 | |
| Бычий сывороточный альбумин, без жирных кислот (BSA) | Sigma Aldrich | A8806-5G | |
| cAMP | Biogems | 6099240 | |
| cAMP | Biogems | 6099240 | |
| C-CHIP NEUBAUER IMPROVED | VWR | DHC-N01 | |
| Cell sither 40 µ m | Neolab | 352340 | |
| Клеточный фильтр 70 & микро; m (белый) Нейлоновый | Sigma | CLS431751-50EA | |
| Chromium и Next GEM Accessory Kit | 10X Genomics | 1000204 | |
| Chromium Next GEM Chip G Single Cell Kit, 16 rxns | 10X Genomics | 1000127 | |
| Chromium Next GEM Single Cell 3' Kit v3.1 | 10X Genomics | 1000268 | |
| complete, Ингибитор протеазы без ЭДТА Cocktaill Roche | 11873580001 | ||
| DAPI | MERCK Chemicals | 0000001722 | |
| DMEM/F12 | Life Technologies | 11320074 | |
| набор тканевых шлифовальных машин Dounce 2 мл в сборе | Sigma Aldrich | 10536355 | |
| Essential E8 Flex Medium | Life Technologies | A2858501 | |
| EVE Cell Count Слайды | VWR | EVS-050 ( 734-2676) | |
| Фетальная бычья сыворотка без тетрациклина (FBS) | PAN Biotech | P30-3602 | |
| Geltrex LDEV-Free (покрытие) | Life Technologies | A1413302 | |
| gentleMACS | Miltenyi Biotec | диссоциативная маска | |
| GlutaMAX добавки | Life Technologies | 35050038 | |
| гепарин натрия клеточная культура протестирована | Sigma | H3149-10KU | |
| человеческий рекомбинантный BDNF | StemCell Technologies | 78005.3 | |
| человеческий рекомбинантный GDNF | StemCell Technologies | 78058.3 | |
| Раствор инсулина | Сигма Олдрич Сигма Олдрич | I2643-25MG | |
| Замена сыворотки с нокаутом | Life Technologies | 10828028 | |
| LDN193189 Гидрохлорид 98% | Сигма Олдрич | 130-106-540 | |
| МЭМ заменимая аминокислота (100x) | Сигма Олдрич | M7145-100мл | |
| MgCl2 Хлорид магния (1M) РНКаза без РНК | Термо Научная | AM9530G | |
| mTeSR Plus | StemCell Technologies | 100-0276 | среда стволовых клеток |
| mTeSR1 | StemCell Technologies | 85850 | среда стволовых клеток |
| N2 Supplement | StemCell Technologies | 17502048 | |
| набор для диссоциации нервной ткани | Miltenyi Biotec B.V. & Co. KG | 130-092-628 | |
| Neurobasal Plus | Life Technologies | A3582901 | |
| система NextSeq500 | Секвенсор | Illumina | |
| NP-40 Surfact-Amps Моющий раствор | Life Technologies | 28324 | |
| PBS Дульбекко s | Invitrogen | 14190169 | |
| PenStrep (Пенициллин - Стрептомицин) | Life Technologies | 15140122 | |
| Percoll | Th. Geyer | 10668276 | |
| Pluronic (R) F-127 | Sigma Aldrich | P2443-1KG | |
| RiboLock RNase Inhibitor | Life Technologies | EO0382 | |
| Ингибитор горных пород (Y-27632 дигидрохлорид) SB | Biomol | Cay10005583-10 | |
| SB 431542 | Biogems | 3014193 | |
| Sodium chloride NaCl (5M), РНКаза-free-100 мл | Invitrogen | AM9760G | |
| StemFlex Medium | Thermo Scientific | A3349401 | среда стволовых клеток |
| StemMACS iPS-Brew XF | Miltenyi Biotec | 130-104-368 | среда стволовых клеток |
| TC-Platte 96 Well, круглое дно | Sarstedt | 83.3925.500 | |
| TISSUi006-A | TissUse GmbH | https://hpscreg.eu/cell-line/TISSUi006-A | |
| Трипановый синий | T8154-20мл | Sigma | |
| TrypLE Express Enzyme, без фенола красного | Life Technologies | 12604013 | реагент на основе трипсина |
| UltraPure 1M Tris-HCl Buffer, pH 7,5 | Life Technologies | 15567027 | |
| XAV939 | Enzo Life sciences | БМЛ-ВН100-0005 |
Ссылки
- Finkbeiner, S. R., et al. Stem cell-derived human intestinal organoids as an infection model for Rotaviruses. mBio. 3 (4), e00159-e00212 (2012).
- Freedman, B. S., et al. Modelling kidney disease with CRISPR-mutant kidn....
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Перепечатки и разрешения
