Генерация и последующий анализ одноклеточных и одноядерных транскриптомов в органоидах мозга

В последние годы органоидные технологии стали перспективным инструментом для культивирования органоподобных тканей ^1,2,3. Особенно для органов, которые не могут быть легко доступны, таких как человеческий мозг, органоиды дают возможность получить представление о развитии^{и проявлении} болезней. Таким образом, органоиды мозга широко используются в качестве экспериментальной модели для исследования различных расстройств мозга человека, включая заболевания развития, психиатрические или даже нейродегенеративные^{заболевания.}

С появлением технологий профилирования транскриптома одиночных клеток, первичные ткани человека и сложные модели in vitro стали изучаться с беспрецедентным уровнем детализации, что позволяет получить механистическое представление об изменениях экспрессии генов на уровне клеточных субпопуляций в норме и при заболеваниях и получить информацию о новых предполагаемых терапевтических мишенях ^7,8,9. Развитие органоидной области было достигнуто за счет использования профилирования транскриптома одиночных клеток для оценки клеточного состава, воспроизводимости и точности технологий органоидов мозга 10,11,12. Секвенирование РНК одиночных клеток (scRNA-seq) позволило классифицировать клетки и выявить генетическую дисрегуляцию в больных органоидах^13,14. Важно отметить, что именно сложность органоидных тканей обуславливает необходимость внедрения методов, позволяющих профилировать отдельные клетки. Характеристика органоидов с помощью таких методов, как объемное профилирование транскриптома (объемное секвенирование РНК), приводит к маскировке клеточной гетерогенности и профилям экспрессии генов, которые усредняются по всем типам клеток в сложной ткани, что в конечном итоге ограничивает наше понимание текущих процессов во время развития органоидов в здоровом и больном^{состоянии 15,16,17}. По мере того, как методы scRNA-seq продолжают развиваться, создается все большее число атласов, примером которых являются такие ресурсы, как Атлас мозга Аллена или Атлас органоидов человеческого мозга с одиночными клетками Uzquiano et ^al.18.

Успешное получение scRNA-seq из органоидов мозга зависит от эффективной изоляции и захвата интактных клеток. Поскольку диссоциация органоидов мозга с получением отдельных клеток основана на ферментативном пищеварении, она может влиять на паттерны экспрессии генов, вызывая стресс^{и повреждение клеток.} Следовательно, диссоциация ткани на отдельные клетки является наиболее важным шагом. Альтернативным подходом является одноядерное секвенирование РНК (snRNA-seq), которое способствует экстракции ядер без ферментов как из свежей, так и из замороженной ткани^21,22. Однако выделение ядер из ткани сопряжено с другими проблемами, такими как обогащение представляющих интерес типов клеток и низкое содержание РНК в ядрах по сравнению с клетками.

Транскриптомные исследования органоидов головного мозга обычно проводятся с использованием scRNA-seq 10,18,23. Тем не менее, выделение одиночных ядер может обеспечить ортогональный и дополнительный метод для исследования транскриптомного профиля органоидов. В этой статье мы представляем набор инструментов для scRNA- и snRNA-seq для органоидов мозга и обсуждаем критические моменты для получения данных секвенирования наилучшего качества.

Описанный протокол выполнен в лаборатории уровня биобезопасности 1 Центра молекулярной медицины им. Макса Дельбрюка (номер одобрения: 138/08), в соответствии с требованиями и в соответствии с правилами ЕС и национальными правилами этики в исследованиях.

1. Получение органоидов переднего мозга из индуцированных плюрипотентных стволовых клеток (ИПСК)

Примечание: Этот протокол был протестирован для нескольких различных линий iPSC, культивируемых в различных средах стволовых клеток от разных компаний (Таблица 1). Генерация органоидов переднего мозга в значительной степени зависит от высокого качества иПСК и их конфлюации на 60-70% до начала протокола. Здесь мы использовали коммерчески доступную линию клеток (см. Таблицу материалов).

1. День 0: Формирование эмбриоидного тела
   1. Для обработки 96-луночного планшета плуроновым раствором добавьте 80 мкл стерильного фильтрованного 2% плуронового раствора на лунку 96-луночного U-образного планшета. Инкубировать не менее 15 минут при комнатной температуре (RT) или 37 °C.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Плуроновые обработанные пластины можно хранить при температуре 4 °C до 2 недель и использовать их непосредственно без каких-либо этапов промывки для формирования эмбриоидного тела.
   2. Удаляйте плуроновый раствор из каждой лунки с помощью аспиратора или многоканальной пипетки перед посевом клеток.
   3. Перед началом работы приготовьте следующие реагенты для одного 96-луночного планшета: центрифужная пробирка объемом 15 мл с 5 мл предварительно подогретой среды DMEM: F12; 11 мл среды стволовых клеток с добавлением 50 мкМ Y-27632, обработанная плуроновой пластиной (как описано выше).
   4. Аспиратная среда из одной лунки 6-луночного планшета с 60-70% конфлюентными иПСК. Один раз промойте камеры с помощью PBS. Добавьте 500 μл реагента на основе трипсина и инкубируйте в течение 2-6 минут при 37 °C.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Время инкубации для правильной отслойки клеток с реагентом на основе трипсина зависит от плотности клеток и адгезивных свойств клеточного матрикса каждой линии iPSC. Во избежание переваривания рекомендуется исследовать морфологию клеток после 2 минут инкубации с реагентом на основе трипсина с помощью микроскопа с использованием яркого поля.
   5. Отделите ячейки с помощью пипетки объемом 1000 мкл и перенесите в предварительно подготовленную центрифужную пробирку объемом 15 мл со средой DMEM:F12, чтобы остановить диссоциацию.
   6. Центрифужная суспензия ячеек в течение 3 мин при 300 x g. Аспиратируйте надосадочную жидкость и сохраняйте клеточную гранулу. Ресуспендируйте клетки в 1 мл среды для стволовых клеток с добавлением 50 мкМ Y-27632.
   7. Подсчитайте клетки с помощью счетчика клеток и добавьте желаемое количество клеток в среду для стволовых клеток с добавлением 50 μM Y-27632. Для создания одного эмбриоидного тела требуется 3000-12000 клеток в зависимости от клеточной линии.
   8. Перенесите клеточную суспензию в многоканальный резервуар для реагентов с помощью пипетки объемом 10 мл. С помощью многоканальной пипетки поместите 100 мкл/лунку клеточной суспензии в предварительно обработанный плюроником 96-луночный планшет.
   9. Поместите 96-луночный планшет в инкубатор при температуре 37 °C, 5%_O2 и 5%_CO2. Чтобы избежать каких-либо нарушений во время формирования эмбриоидного тела, воздержитесь от перемещения пластины.
2. День 2: Обследование эмбриоидного тела
   1. Исследуйте образование эмбриоидного тела с помощью объектива 10-кратного увеличения яркопольного микроскопа. Эмбриоидные тельца должны иметь четкие края и минимальную гибель клеток.
   2. Отсадите как можно больше среды и замените ее на 100 μл/лунку среды стволовых клеток. (Критический) Эмбриоидные тельца легко удаляются из лунки при обмене среды. Следите за тем, чтобы не удалять их, поэтому следите за средой после аспирации.
3. День 3: Индукция нейроэктодермы
   1. Отберите как можно больше среды и замените ее на 120 мкл/лунку индукционной среды и поместите пластину при температуре 37 °C, 20%_O2 и 5%_CO2.
4. День 6: Встраивание
   1. В зависимости от линии iPSC, требуется 3 или 4 дня, чтобы вызвать появление нейроэктодермы. Регулярно контролируйте эмбриоидные тела. Как только края становятся яркими, эмбриоидные тела готовы к встраиванию. Используйте один из двух различных методов, которые могут быть использованы для встраивания эмбриоидного тела, как описано ниже²⁴.
   2. Способ встраивания 1: Встраивание файлов cookie
      1. Разморозьте аликвоту неразбавленного геля внеклеточного матрикса на льду в течение 1-2 ч. (Критическое) Всегда держите гель внеклеточного матрикса на льду, чтобы предотвратить его затвердевание. Подготовьте аликвоты заранее, чтобы свести к минимуму время размораживания и повторные циклы размораживания.
      2. Разрежьте кончик пипетки объемом 200 мкл с помощью кусачек-когтей и соберите 16-32 эмбриоидных тела в одну микроцентрифужную пробирку объемом 1,5 мл.
      3. Перенесите эмбриоидные тельца в 67 мкл среды в новую микроцентрифужную пробирку объемом 1,5 мл. Добавьте 100 μL геля из внеклеточного матрикса с помощью разрезанного наконечника пипетки объемом 200 μL и аккуратно перемешайте.
      4. Равномерно распределите эмбриоидные тела в чашке диаметром 6 см и поставьте тарелку на 5-10 минут, чтобы гель внеклеточного матрикса застыл.
      5. Добавьте около 4 мл дифференцировочной среды и инкубируйте при 37 °C, 20%_O2 и 5%_CO2. На следующий день поставьте тарелку на орбитальный шейкер (84 оборота в минуту). Следите за тем, чтобы все эмбриоидные тела отделились от дна. Если нет, аккуратно отсоедините их с помощью отрезанного наконечника пипетки и фильтрующего материала.
   3. Метод встраивания 2: Встраивание жидкости
      1. Разморозьте аликвоту неразбавленного геля внеклеточного матрикса на льду в течение 1-2 ч и поместите на лед дифференцировочную среду. (Критический) При добавлении геля с внеклеточным матриксом среда должна быть ледяной.
      2. Как только среда остынет, добавьте гель с внеклеточным матриксом до конечной концентрации 2%. Разрежьте кончик пипетки объемом 200 мкл с помощью кулачковых кусачек и перенесите до 24 эмбриоидных тел в одну лунку 6-луночного планшета.
      3. Удалите все излишки среды и добавьте около 4 мл 2% геля/дифференцировочной среды внеклеточного матрикса в одну лунку 6-луночного планшета. Немедленно поместите пластину на орбитальный шейкер (84 об/мин).
5. День 9-20: Проводите полный медиаобмен с использованием дифференцированных медиа каждые 3-4 дня.
6. День 21-30: Перенесите органоиды в среды созревания и выполняйте полный обмен средами каждые 3-4 дня.
7. Диссоциация органоидов: Для диссоциации отдельных ядер и клеток используйте органоиды высокого качества. Чтобы избежать чрезмерной гибели клеток, регулярно разрезайте органоиды, чтобы предотвратить накопление некротического ядра, и дайте им восстановиться в течение 2 недель, прежде чем диссоциировать их для дальнейшего анализа.

2. Получение одиночной клетки из органоидов

Примечание: Диссоциация одиночных клеток выполняется с помощью набора для диссоциации нервной ткани (Таблица 2), в котором используется механическая и ферментативная диссоциация. Здесь мы опишем ручную механическую диссоциацию. В качестве альтернативы можно использовать машину для диссоциации.

1. Приготовьте раствор СТОП и 0,04% БСА на льду. Приготовьте смесь ферментов 1 и 2 и 0,04% BSA в PBS и положите на лед.
2. Соберите до 5 органоидов в одну лунку 6-луночного планшета, отсадите излишки среды и промойте один раз PBS для удаления питательных сред. Поместите органоиды в середину лунки и с помощью скальпеля тщательно измельчите органоиды.
3. Добавьте смесь ферментов 1 и поместите при температуре 37 °C, 20%_O2 и 5% CO₂, встряхивая при 90 об/мин в течение 10-15 минут.
4. С помощью наконечника для дозатора объемом 1000 мкл ресуспендируйте органоиды путем пипетирования до 10 раз. Добавьте смесь ферментов 2 и хорошо перемешайте ее с помощью пипетирования с помощью наконечника для дозатора объемом 1000 мкл. Поместите при 37 °C, 20%_O2 и 5% CO₂, встряхивая при 90 об/мин в течение 10-15 минут.
5. Остановите процесс диссоциации, повторно суспендировав раствор клетки в 10 мл холодного раствора STOP. Решение фильтрующей ячейки с использованием сетчатого фильтра 70 μM. Центрифугируйте отфильтрованный раствор в течение 10 минут при 300 x g при 4 °C до образования гранулы.
6. Аспиратуйте среды, оставляя клеточную гранулу и ресуспендируя клетки в 4 мл холода 0,04% БСА. Решение фильтрующей ячейки с помощью сетчатого фильтра для клеток 40 мкМ и подсчет ячеек с помощью счетчика ячеек.
7. Центрифугируйте раствор ячейки в течение 10 мин при 300 x g при 4 °C. Аспират раствор БСА, оставляя клеточную гранулу. Ресуспензируйте клетки в соответствии с инструкцией по набору snRNA-seq на основе микрофлюидики в среде NSB+.

3. Выделение одиночных ядер из органоидов

1. Переложите органоиды в охлажденный PBS и разрежьте каждый органоид на 4 части. Промойте органоиды 2 раза охлажденным PBS.
2. Разрежьте ножницами кончик пипетки объемом 1000 мкл и перенесите кусочки органоида в дончик объемом 2 мл. Полностью отсадите PBS и добавьте 1 мл буфера для лизиса NP40.
3. Переложите суспензию 3 раза с помощью пестика А и 3 раза с помощью пестика В. Перенесите суспензию в пробирку для центрифуги объемом 15 мл. Промойте выдувку еще 1 мл буфера для лизиса NP40 и переложите в центрифужную пробирку объемом 15 мл. Инкубировать в течение 5 мин при РТ, а затем центрифугировать суспензию в течение 5 мин при 500 x g.
4. Асасируйте надосадочную жидкость, оставляя 50 μл надосадочной жидкости. Добавьте 1 мл NSB+, не потревожив гранулы. Восстановите суспензию через 5 минут инкубации.
5. Слой суспензии поверх градиента Percoll (нижний слой: 1 мл NSB+ и 250 μL Percoll, средний слой: 1 мл NSB+ и 188 μL Percoll, верхний слой: 1 мл NSB+ и 125 μL Percoll). (Критический) Выполняйте наслоение очень осторожно, чтобы избежать смешивания слоев.
6. Центрифугировать в течение 5 мин при 500 x g при 4 °C, отсадить надосадочную жидкость и ресуспендировать в NSB+. Отфильтруйте раствор ядер с помощью клеточного фильтра 40 μM.
7. Окрашивание и подсчет ядер с помощью DAPI и камеры Нейбауэра. Ресуспендируйте ядра в соответствии с руководством по набору scRNA-seq на основе микрофлюидики.

4. Подготовка библиотеки и секвенирование

1. Загрузите 10 000 клеток и ядер в микрофлюидную систему и сгенерируйте библиотеку в соответствии с руководством по набору scRNA-seq на основе микрофлюидики (Table of Materials).
2. Секвенирование библиотек с расчетным количеством 6 x 10⁸ прочтений на библиотеку snRNA-seq и 1,6 x 10⁸ прочтений на библиотеку scRNA-seq, что приведет к насыщению секвенирования на уровне 87% для набора данных snRNA-seq и 36% насыщения секвенирования для набора данных scRNA-seq.

5. Анализ

1. Проведите анализ секвенирования с помощью конвейера анализа данных для scRNA-seq и snRNA-seq и сопоставьте их с геномом человека GRCh38. Подвергните матрицу счетчиков, сгенерированную этим конвейером, дальнейшему анализу с помощью R-пакета Seurat (Version 4.1.1)²⁵.
2. Создайте объект Сёра, рассмотрев гены, которые были представлены не менее чем в 5 клетках, и включив в него клетки, содержащие не менее 300 генов. Выполняйте дополнительную фильтрацию контроля качества, сохраняя клетки, которые содержали более 1000 генов, но менее 4000 генов для набора данных scRNA-seq и более 800, но менее 4000 генов на ядро для набора данных snRNA-seq. Исключите наборы данных, клетки и ядра, превышающие 5% митохондриальных прочтений.
3. Чтобы смягчить пакетные эффекты между обоими методами, интегрируйте оба отфильтрованных набора данных, нормализуйте и визуализируйте с помощью равномерной аппроксимации и проекции многообразия (UMAP). Исключите кластер 1, который показывает низкий уникальный молекулярный идентификатор (UMI) и количество генов. Впоследствии, для кластеров присваиваются идентичности клеток на основе известных маркерных генов и набора органоидов 30-дневной давности от Ana Uzquiano et. al. (Файл дополнительного кодирования 1)¹⁸.

Для исследования клеточного состава органоидов головного мозга с использованием scRNA-seq и snRNA-seq органоиды мозга были собраны после 30 дней культивирования, поскольку органоиды на этой стадии уже демонстрируют нейроэпителиальные петли, состоящие из предшественников, окруженных промежуточными предшественниками и нейронами ранних стадий 4,18. Мониторинг качества органоидов на протяжении всего роста и культивирования имеет важное значение для получения надежных данных об отдельных клетках и одноядерных веществах.

Органоиды образуются путем агрегации ИПСК в эмбриоидные тельца (рис. 1B, C). Ожидается, что после сборки эти эмбриоидные тельца будут демонстрировать четкие края с минимальным количеством клеточного мусора (рис. 1C). После индукции нейроэктодермы эмбриоидные тельца демонстрируют заметное осветление вокруг поверхности со сравнительно более темной внутренней областью, что указывает на успешную нейронную индукцию (рис. 1D). В последующие недели органоиды развивают так называемые петли, нейронные розеткообразные структуры, в основном состоящие из нейроэпителиальных клеток (рис. Хотя эти органоиды могут сохраняться в культуре в течение нескольких месяцев, следует отметить, что с увеличением их размера происходит соответствующее увеличение гибели клеток во внутренней части органоидов из-за недостатка питательных веществ и доступности кислорода, что в конечном итоге приводит к развитию некротического ядра.

Чтобы исследовать клеточное разнообразие в корковых органоидах с помощью анализа секвенирования, мы выделили как отдельные клетки, так и ядра из органоидов. Чтобы сбалансировать присущую гетерогенность в пределах одной партии органоидов мозга, мы провели секвенирование четырех объединенных органоидов из одной партии. Кроме того, для сравнения процессов выделения и устранения пакетных эффектов между snRNA-seq и библиотекой scRNA-seq, эти органоиды были разделены на половины (всего восемь половин; Рисунок 2). После ферментативного выделения отдельных клеток крайне важно убедиться, что жизнеспособность клеток остается выше 80%, при этом наблюдая, что клетки сохраняют круглую морфологию (рис. 3A, B). Аналогичным образом, механическая изоляция отдельных ядер должна давать неповрежденные ядра различных размеров с минимальным или отсутствующим обломком (рис. 3C, D).

Анализ секвенирования показал, что было захвачено и секвенировано больше клеток, чем ядер. Оба набора данных показали хорошее качество, оцениваемое по высокому количеству генов и UMI на клетку и ядро, а также низкому проценту митохондриальных прочтений (рис. 4A-C). Как и ожидалось, митохондриальные, а также рибосомные чтения составляют более высокую долю от общего числа прочтений, восстановленных в наборе данных scRNA-seq, по сравнению с набором данных snRNA-seq. В наборе данных scRNA-seq большинство клеток содержали менее 30% рибосомных прочтений, тогда как в наборе данных snRNA-seq большинство ядер содержали менее 5% рибосомных прочтений. Кроме того, большинство клеток, захваченных в наборе данных scRNA-seq, содержат менее 5% митохондриальных прочтений. После фильтрации митохондриальных прочтений около 10 000 клеток и 3 000 ядер преодолели порог качества.

Интегративный анализ обоих наборов данных показал, что все кластеры представлены в обоих наборах данных, что указывает на то, что оба метода восстанавливают одни и те же типы ячеек (рис. 5A, C). Аннотация набора данных показывает, что основные клеточные популяции включают радиальную глию, промежуточные предшественники, подкорковые предшественники и нейроны, а также нейроны глубокого слоя новорожденных и менее представленные типы клеток, такие как клетки Кахаля-Ретциуса, коркового края и сосудистого сплетения (рисунок 5B). В целом, scRNA-seq и snRNA-seq могут восстанавливать все типы клеток, которые, как ожидается, присутствуют в 30-дневноморганоиде мозга.

Рисунок 1: Генерация органоидов мозга из ИПСК Временной ход генерации органоидов мозга (А). Примеры успешной корковой дифференцировки от ИПСК (В), которые образуют эмбриоидные тельца (через 72 ч после посева) (С) и демонстрируют успешную нейронную индукцию после 7 дней культивирования (D). Органоид изображает отдельные петли на 15-й день (E) и 30-й день (F). Масштабная линейка: B-D 200 μм, E 400 μм, F 800 μм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Рисунок 2: Рабочий процесс получения отдельных клеток и отдельных ядер из органоидов мозга. Диссоциация органоидов на отдельные клетки проводится путем измельчения органоидов скальпелем с последующим ферментативным расщеплением (вверху). Выделение ядер осуществляется путем механической диссоциации с последующей очисткой с помощью градиента Перколля (дно). Одиночная клетка и суспензия ядер фильтруются и загружаются в микрофлюидную систему для создания библиотеки и секвенирования. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этой цифры.

Рисунок 3: Репрезентативные результаты выделенных клеток и ядер из органоидов возрастом 30 дней. (А) Примерное изображение окрашенных в синий цвет трипановых клеток, полученное с помощью клеточного счетчика, и (В) соответствующий крупный план. (C) Наложение светлого поля и флуоресцентного изображения окрашенных ядер DAPI и (D) соответствующий крупный план. Масштабная линейка: 100 μM Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Рисунок 4: Контроль качества scRNA- и snRNA-seq. Графики Скрипки иллюстрируют абсолютное количество UMI (A), количество генов (B), митохондриальное (C) и рибосомное чтение (D) клеток (синий) и ядер (розово-фиолетовый). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этой цифры.

Рисунок 5: scRNA-seq и snRNA-seq извлекают сходные клеточные популяции в органоидах 30-дневной давности. Интегрированный встроенный UMAP органоидов 30-дневной давности, показывающий результаты scRNA-seq (синий) и snRNA-seq (розово-фиолетовый) (A), интегрированные и аннотированные и индивидуальные профили scRNA-seq и snRNA-seq (B,C). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этой цифры.

Таблица 1: Среды для клеточных культур и компоненты покрытий Нажмите здесь, чтобы загрузить эту таблицу.

Таблица 2: Буферы диссоциации для scRNA и snRNA-seq. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы скачать эту таблицу.

Файл дополнительного кодирования 1: Файл кодирования, используемый для анализа данных scRNA-seq и snRNA-seq. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить этот файл.

Авторы заявляют об отсутствии конкурирующих финансовых интересов.