Method Article

Генерация и последующий анализ одноклеточных и одноядерных транскриптомов в органоидах мозга

DOI:

10.3791/66225

⸱

March 29th, 2024

 ,  ,  ,  ,  , 
1Berlin Institute for Medical Systems Biology (BIMSB), Max Delbrück Center for Molecular Medicine (MDC), 2Institut für Biologie, Humboldt-Universität zu Berlin, 3Organoid platform, Berlin Institute for Medical Systems Biology (BIMSB), Max Delbrück Center for Molecular Medicine (MDC)

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

В этой статье мы представляем комплексный протокол для генерации и последующего анализа органоидов человеческого мозга с использованием секвенирования одиночных клеток и одноядерных РНК.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

За последнее десятилетие транскриптомика одиночных клеток значительно эволюционировала и стала стандартным лабораторным методом для одновременного анализа профилей экспрессии генов отдельных клеток, позволяющим улавливать клеточное разнообразие. Для преодоления ограничений, связанных с трудно изолируемыми типами клеток, для секвенирования может быть использован альтернативный подход, направленный на восстановление отдельных ядер вместо интактных клеток, что делает транскриптомное профилирование отдельных клеток универсально применимым. Эти методы стали краеугольным камнем в изучении органоидов мозга, установив их в качестве моделей развивающегося человеческого мозга. Используя потенциал одноклеточной и одноядерной транскриптомики в исследованиях органоидов мозга, этот протокол представляет собой пошаговое руководство, охватывающее ключевые процедуры, такие как диссоциация органоидов, выделение одиночных клеток или ядер, подготовка библиотеки и секвенирование. Реализуя эти альтернативные подходы, исследователи могут получить высококачественные наборы данных, позволяющие идентифицировать типы нейронных и ненейрональных клеток, профили экспрессии генов и траектории клеточной линии. Это способствует всестороннему исследованию клеточных процессов и молекулярных механизмов, формирующих развитие мозга.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

В последние годы органоидные технологии стали перспективным инструментом для культивирования органоподобных тканей 1,2,3. Особенно для органов, которые не могут быть легко доступны, таких как человеческий мозг, органоиды дают возможность получить представление о развитиии проявлении болезней. Таким образом, органоиды мозга широко используются в качестве экспериментальной модели для исследования различных расстройств мозга человека, включая заболевания развития, психиатрические или даже нейродегенеративныезаболевания.

С появлением технологий профилирования транскриптома одиночных клеток, первичные ткани человека и сложные модели in vitro стали изучаться с беспрецедентным уровнем детализации, что позволяет получить механистическое представление об изменениях экспрессии генов на уровне клеточных субпопуляций в норме и при заболеваниях и получить информацию о новых предполагаемых терапевтических мишенях 7,8,9. Развитие органоидной области было достигнуто за счет использования профилирования транскриптома одиночных клеток для оценки клеточного состава, воспроизводимости и точности технологий органоидов мозга 10,11,12. Секвенирование РНК одиночных клеток (scRNA-seq) позволило классифицировать клетки и выявить генетическую дисрегуляцию в больных органоидах13,14. Важно отметить, что именно сложность органоидных тканей обуславливает необходимость внедрения методов, позволяющих профилировать отдельные клетки. Характеристика органоидов с помощью таких методов, как объемное профилирование транскриптома (объемное секвенирование РНК), приводит к маскировке клеточной гетерогенности и профилям экспрессии генов, которые усредняются по всем типам клеток в сложной ткани, что в конечном итоге ограничивает наше понимание текущих процессов во время развития органоидов в здоровом и больномсостоянии 15,16,17. По мере того, как методы scRNA-seq продолжают развиваться, создается все большее число атласов, примером которых являются такие ресурсы, как Атлас мозга Аллена или Атлас органоидов человеческого мозга с одиночными клетками Uzquiano et al.18.

Успешное получение scRNA-seq из органоидов мозга зависит от эффективной изоляции и захвата интактных клеток. Поскольку диссоциация органоидов мозга с получением отдельных клеток основана на ферментативном пищеварении, она может влиять на паттерны экспрессии генов, вызывая стресси повреждение клеток. Следовательно, диссоциация ткани на отдельные клетки является наиболее важным шагом. Альтернативным подходом является одноядерное секвенирование РНК (snRNA-seq), которое способствует экстракции ядер без ферментов как из свежей, так и из замороженной ткани21,22. Однако выделение ядер из ткани сопряжено с другими проблемами, такими как обогащение представляющих интерес типов клеток и низкое содержание РНК в ядрах по сравнению с клетками.

Транскриптомные исследования органоидов головного мозга обычно проводятся с использованием scRNA-seq 10,18,23. Тем не менее, выделение одиночных ядер может обеспечить ортогональный и дополнительный метод для исследования транскриптомного профиля органоидов. В этой статье мы представляем набор инструментов для scRNA- и snRNA-seq для органоидов мозга и обсуждаем критические моменты для получения данных секвенирования наилучшего качества.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Описанный протокол выполнен в лаборатории уровня биобезопасности 1 Центра молекулярной медицины им. Макса Дельбрюка (номер одобрения: 138/08), в соответствии с требованиями и в соответствии с правилами ЕС и национальными правилами этики в исследованиях.

1. Получение органоидов переднего мозга из индуцированных плюрипотентных стволовых клеток (ИПСК)

Примечание: Этот протокол был протестирован для нескольких различных линий iPSC, культивируемых в различных средах стволовых клеток от разных компаний (Таблица 1). Генерация органоидов переднего мозга в значительной степени зависит от высокого качества иПСК и их конфлюации на 60-70% до начала протокола. Здесь мы использовали коммерчески доступную линию клеток (см. Таблицу материалов).

  1. День 0: Формирование эмбриоидного тела
    1. Для обработки 96-луночного планшета плуроновым раствором добавьте 80 мкл стерильного фильтрованного 2% плуронового раствора на лунку 96-луночного U-образного планшета. Инкубировать не менее 15 минут при комнатной температуре (RT) или 37 °C.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Плуроновые обработанные пластины можно хранить при температуре 4 °C до 2 недель и использовать их непосредственно без каких-либо этапов промывки для формирования эмбриоидного тела.
    2. Удаляйте плуроновый раствор из каждой лунки с помощью аспиратора или многоканальной пипетки перед посевом клеток.
    3. Перед началом работы приготовьте следующие реагенты для одного 96-луночного планшета: центрифужная пробирка объемом 15 мл с 5 мл предварительно подогретой среды DMEM: F12; 11 мл среды стволовых клеток с добавлением 50 мкМ Y-27632, обработанная плуроновой пластиной (как описано выше).
    4. Аспиратная среда из одной лунки 6-луночного планшета с 60-70% конфлюентными иПСК. Один раз промойте камеры с помощью PBS. Добавьте 500 μл реагента на основе трипсина и инкубируйте в течение 2-6 минут при 37 °C.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Время инкубации для правильной отслойки клеток с реагентом на основе трипсина зависит от плотности клеток и адгезивных свойств клеточного матрикса каждой линии iPSC. Во избежание переваривания рекомендуется исследовать морфологию клеток после 2 минут инкубации с реагентом на основе трипсина с помощью микроскопа с использованием яркого поля.
    5. Отделите ячейки с помощью пипетки объемом 1000 мкл и перенесите в предварительно подготовленную центрифужную пробирку объемом 15 мл со средой DMEM:F12, чтобы остановить диссоциацию.
    6. Центрифужная суспензия ячеек в течение 3 мин при 300 x g. Аспиратируйте надосадочную жидкость и сохраняйте клеточную гранулу. Ресуспендируйте клетки в 1 мл среды для стволовых клеток с добавлением 50 мкМ Y-27632.
    7. Подсчитайте клетки с помощью счетчика клеток и добавьте желаемое количество клеток в среду для стволовых клеток с добавлением 50 μM Y-27632. Для создания одного эмбриоидного тела требуется 3000-12000 клеток в зависимости от клеточной линии.
    8. Перенесите клеточную суспензию в многоканальный резервуар для реагентов с помощью пипетки объемом 10 мл. С помощью многоканальной пипетки поместите 100 мкл/лунку клеточной суспензии в предварительно обработанный плюроником 96-луночный планшет.
    9. Поместите 96-луночный планшет в инкубатор при температуре 37 °C, 5%O2 и 5%CO2. Чтобы избежать каких-либо нарушений во время формирования эмбриоидного тела, воздержитесь от перемещения пластины.
  2. День 2: Обследование эмбриоидного тела
    1. Исследуйте образование эмбриоидного тела с помощью объектива 10-кратного увеличения яркопольного микроскопа. Эмбриоидные тельца должны иметь четкие края и минимальную гибель клеток.
    2. Отсадите как можно больше среды и замените ее на 100 μл/лунку среды стволовых клеток. (Критический) Эмбриоидные тельца легко удаляются из лунки при обмене среды. Следите за тем, чтобы не удалять их, поэтому следите за средой после аспирации.
  3. День 3: Индукция нейроэктодермы
    1. Отберите как можно больше среды и замените ее на 120 мкл/лунку индукционной среды и поместите пластину при температуре 37 °C, 20%O2 и 5%CO2.
  4. День 6: Встраивание
    1. В зависимости от линии iPSC, требуется 3 или 4 дня, чтобы вызвать появление нейроэктодермы. Регулярно контролируйте эмбриоидные тела. Как только края становятся яркими, эмбриоидные тела готовы к встраиванию. Используйте один из двух различных методов, которые могут быть использованы для встраивания эмбриоидного тела, как описано ниже24.
    2. Способ встраивания 1: Встраивание файлов cookie
      1. Разморозьте аликвоту неразбавленного геля внеклеточного матрикса на льду в течение 1-2 ч. (Критическое) Всегда держите гель внеклеточного матрикса на льду, чтобы предотвратить его затвердевание. Подготовьте аликвоты заранее, чтобы свести к минимуму время размораживания и повторные циклы размораживания.
      2. Разрежьте кончик пипетки объемом 200 мкл с помощью кусачек-когтей и соберите 16-32 эмбриоидных тела в одну микроцентрифужную пробирку объемом 1,5 мл.
      3. Перенесите эмбриоидные тельца в 67 мкл среды в новую микроцентрифужную пробирку объемом 1,5 мл. Добавьте 100 μL геля из внеклеточного матрикса с помощью разрезанного наконечника пипетки объемом 200 μL и аккуратно перемешайте.
      4. Равномерно распределите эмбриоидные тела в чашке диаметром 6 см и поставьте тарелку на 5-10 минут, чтобы гель внеклеточного матрикса застыл.
      5. Добавьте около 4 мл дифференцировочной среды и инкубируйте при 37 °C, 20%O2 и 5%CO2. На следующий день поставьте тарелку на орбитальный шейкер (84 оборота в минуту). Следите за тем, чтобы все эмбриоидные тела отделились от дна. Если нет, аккуратно отсоедините их с помощью отрезанного наконечника пипетки и фильтрующего материала.
    3. Метод встраивания 2: Встраивание жидкости
      1. Разморозьте аликвоту неразбавленного геля внеклеточного матрикса на льду в течение 1-2 ч и поместите на лед дифференцировочную среду. (Критический) При добавлении геля с внеклеточным матриксом среда должна быть ледяной.
      2. Как только среда остынет, добавьте гель с внеклеточным матриксом до конечной концентрации 2%. Разрежьте кончик пипетки объемом 200 мкл с помощью кулачковых кусачек и перенесите до 24 эмбриоидных тел в одну лунку 6-луночного планшета.
      3. Удалите все излишки среды и добавьте около 4 мл 2% геля/дифференцировочной среды внеклеточного матрикса в одну лунку 6-луночного планшета. Немедленно поместите пластину на орбитальный шейкер (84 об/мин).
  5. День 9-20: Проводите полный медиаобмен с использованием дифференцированных медиа каждые 3-4 дня.
  6. День 21-30: Перенесите органоиды в среды созревания и выполняйте полный обмен средами каждые 3-4 дня.
  7. Диссоциация органоидов: Для диссоциации отдельных ядер и клеток используйте органоиды высокого качества. Чтобы избежать чрезмерной гибели клеток, регулярно разрезайте органоиды, чтобы предотвратить накопление некротического ядра, и дайте им восстановиться в течение 2 недель, прежде чем диссоциировать их для дальнейшего анализа.

2. Получение одиночной клетки из органоидов

Примечание: Диссоциация одиночных клеток выполняется с помощью набора для диссоциации нервной ткани (Таблица 2), в котором используется механическая и ферментативная диссоциация. Здесь мы опишем ручную механическую диссоциацию. В качестве альтернативы можно использовать машину для диссоциации.

  1. Приготовьте раствор СТОП и 0,04% БСА на льду. Приготовьте смесь ферментов 1 и 2 и 0,04% BSA в PBS и положите на лед.
  2. Соберите до 5 органоидов в одну лунку 6-луночного планшета, отсадите излишки среды и промойте один раз PBS для удаления питательных сред. Поместите органоиды в середину лунки и с помощью скальпеля тщательно измельчите органоиды.
  3. Добавьте смесь ферментов 1 и поместите при температуре 37 °C, 20%O2 и 5% CO2, встряхивая при 90 об/мин в течение 10-15 минут.
  4. С помощью наконечника для дозатора объемом 1000 мкл ресуспендируйте органоиды путем пипетирования до 10 раз. Добавьте смесь ферментов 2 и хорошо перемешайте ее с помощью пипетирования с помощью наконечника для дозатора объемом 1000 мкл. Поместите при 37 °C, 20%O2 и 5% CO2, встряхивая при 90 об/мин в течение 10-15 минут.
  5. Остановите процесс диссоциации, повторно суспендировав раствор клетки в 10 мл холодного раствора STOP. Решение фильтрующей ячейки с использованием сетчатого фильтра 70 μM. Центрифугируйте отфильтрованный раствор в течение 10 минут при 300 x g при 4 °C до образования гранулы.
  6. Аспиратуйте среды, оставляя клеточную гранулу и ресуспендируя клетки в 4 мл холода 0,04% БСА. Решение фильтрующей ячейки с помощью сетчатого фильтра для клеток 40 мкМ и подсчет ячеек с помощью счетчика ячеек.
  7. Центрифугируйте раствор ячейки в течение 10 мин при 300 x g при 4 °C. Аспират раствор БСА, оставляя клеточную гранулу. Ресуспензируйте клетки в соответствии с инструкцией по набору snRNA-seq на основе микрофлюидики в среде NSB+.

3. Выделение одиночных ядер из органоидов

  1. Переложите органоиды в охлажденный PBS и разрежьте каждый органоид на 4 части. Промойте органоиды 2 раза охлажденным PBS.
  2. Разрежьте ножницами кончик пипетки объемом 1000 мкл и перенесите кусочки органоида в дончик объемом 2 мл. Полностью отсадите PBS и добавьте 1 мл буфера для лизиса NP40.
  3. Переложите суспензию 3 раза с помощью пестика А и 3 раза с помощью пестика В. Перенесите суспензию в пробирку для центрифуги объемом 15 мл. Промойте выдувку еще 1 мл буфера для лизиса NP40 и переложите в центрифужную пробирку объемом 15 мл. Инкубировать в течение 5 мин при РТ, а затем центрифугировать суспензию в течение 5 мин при 500 x g.
  4. Асасируйте надосадочную жидкость, оставляя 50 μл надосадочной жидкости. Добавьте 1 мл NSB+, не потревожив гранулы. Восстановите суспензию через 5 минут инкубации.
  5. Слой суспензии поверх градиента Percoll (нижний слой: 1 мл NSB+ и 250 μL Percoll, средний слой: 1 мл NSB+ и 188 μL Percoll, верхний слой: 1 мл NSB+ и 125 μL Percoll). (Критический) Выполняйте наслоение очень осторожно, чтобы избежать смешивания слоев.
  6. Центрифугировать в течение 5 мин при 500 x g при 4 °C, отсадить надосадочную жидкость и ресуспендировать в NSB+. Отфильтруйте раствор ядер с помощью клеточного фильтра 40 μM.
  7. Окрашивание и подсчет ядер с помощью DAPI и камеры Нейбауэра. Ресуспендируйте ядра в соответствии с руководством по набору scRNA-seq на основе микрофлюидики.

4. Подготовка библиотеки и секвенирование

  1. Загрузите 10 000 клеток и ядер в микрофлюидную систему и сгенерируйте библиотеку в соответствии с руководством по набору scRNA-seq на основе микрофлюидики (Table of Materials).
  2. Секвенирование библиотек с расчетным количеством 6 x 108 прочтений на библиотеку snRNA-seq и 1,6 x 108 прочтений на библиотеку scRNA-seq, что приведет к насыщению секвенирования на уровне 87% для набора данных snRNA-seq и 36% насыщения секвенирования для набора данных scRNA-seq.

5. Анализ

  1. Проведите анализ секвенирования с помощью конвейера анализа данных для scRNA-seq и snRNA-seq и сопоставьте их с геномом человека GRCh38. Подвергните матрицу счетчиков, сгенерированную этим конвейером, дальнейшему анализу с помощью R-пакета Seurat (Version 4.1.1)25.
  2. Создайте объект Сёра, рассмотрев гены, которые были представлены не менее чем в 5 клетках, и включив в него клетки, содержащие не менее 300 генов. Выполняйте дополнительную фильтрацию контроля качества, сохраняя клетки, которые содержали более 1000 генов, но менее 4000 генов для набора данных scRNA-seq и более 800, но менее 4000 генов на ядро для набора данных snRNA-seq. Исключите наборы данных, клетки и ядра, превышающие 5% митохондриальных прочтений.
  3. Чтобы смягчить пакетные эффекты между обоими методами, интегрируйте оба отфильтрованных набора данных, нормализуйте и визуализируйте с помощью равномерной аппроксимации и проекции многообразия (UMAP). Исключите кластер 1, который показывает низкий уникальный молекулярный идентификатор (UMI) и количество генов. Впоследствии, для кластеров присваиваются идентичности клеток на основе известных маркерных генов и набора органоидов 30-дневной давности от Ana Uzquiano et. al. (Файл дополнительного кодирования 1)18.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Для исследования клеточного состава органоидов головного мозга с использованием scRNA-seq и snRNA-seq органоиды мозга были собраны после 30 дней культивирования, поскольку органоиды на этой стадии уже демонстрируют нейроэпителиальные петли, состоящие из предшественников, окруженных промежуточными предшественниками и нейронами ранних стадий 4,18. Мониторинг качества органоидов на протяжении всего роста и культивирования имеет важное значение для получения надежных данных об отдельных клетках и одноядерных веществах.

Органоиды образуются путем агрегации ИПСК в эмбриоидные тельца (рис. 1B, C). Ожидается, что после сборки эти эмбриоидные тельца будут демонстрировать четкие края с минимальным количеством клеточного мусора (рис. 1C). После индукции нейроэктодермы эмбриоидные тельца демонстрируют заметное осветление вокруг поверхности со сравнительно более темной внутренней областью, что указывает на успешную нейронную индукцию (рис. 1D). В последующие недели органоиды развивают так называемые петли, нейронные розеткообразные структуры, в основном состоящие из нейроэпителиальных клеток (рис. Хотя эти органоиды могут сохраняться в культуре в течение нескольких месяцев, следует отметить, что с увеличением их размера происходит соответствующее увеличение гибели клеток во внутренней части органоидов из-за недостатка питательных веществ и доступности кислорода, что в конечном итоге приводит к развитию некротического ядра.

Чтобы исследовать клеточное разнообразие в корковых органоидах с помощью анализа секвенирования, мы выделили как отдельные клетки, так и ядра из органоидов. Чтобы сбалансировать присущую гетерогенность в пределах одной партии органоидов мозга, мы провели секвенирование четырех объединенных органоидов из одной партии. Кроме того, для сравнения процессов выделения и устранения пакетных эффектов между snRNA-seq и библиотекой scRNA-seq, эти органоиды были разделены на половины (всего восемь половин; Рисунок 2). После ферментативного выделения отдельных клеток крайне важно убедиться, что жизнеспособность клеток остается выше 80%, при этом наблюдая, что клетки сохраняют круглую морфологию (рис. 3A, B). Аналогичным образом, механическая изоляция отдельных ядер должна давать неповрежденные ядра различных размеров с минимальным или отсутствующим обломком (рис. 3C, D).

Анализ секвенирования показал, что было захвачено и секвенировано больше клеток, чем ядер. Оба набора данных показали хорошее качество, оцениваемое по высокому количеству генов и UMI на клетку и ядро, а также низкому проценту митохондриальных прочтений (рис. 4A-C). Как и ожидалось, митохондриальные, а также рибосомные чтения составляют более высокую долю от общего числа прочтений, восстановленных в наборе данных scRNA-seq, по сравнению с набором данных snRNA-seq. В наборе данных scRNA-seq большинство клеток содержали менее 30% рибосомных прочтений, тогда как в наборе данных snRNA-seq большинство ядер содержали менее 5% рибосомных прочтений. Кроме того, большинство клеток, захваченных в наборе данных scRNA-seq, содержат менее 5% митохондриальных прочтений. После фильтрации митохондриальных прочтений около 10 000 клеток и 3 000 ядер преодолели порог качества.

Интегративный анализ обоих наборов данных показал, что все кластеры представлены в обоих наборах данных, что указывает на то, что оба метода восстанавливают одни и те же типы ячеек (рис. 5A, C). Аннотация набора данных показывает, что основные клеточные популяции включают радиальную глию, промежуточные предшественники, подкорковые предшественники и нейроны, а также нейроны глубокого слоя новорожденных и менее представленные типы клеток, такие как клетки Кахаля-Ретциуса, коркового края и сосудистого сплетения (рисунок 5B). В целом, scRNA-seq и snRNA-seq могут восстанавливать все типы клеток, которые, как ожидается, присутствуют в 30-дневноморганоиде мозга.

От формирования эмбриоидного тела до сроков созревания; микроскопические изображения; Стадии дифференцировки клеток.
Рисунок 1: Генерация органоидов мозга из ИПСК Временной ход генерации органоидов мозга (А). Примеры успешной корковой дифференцировки от ИПСК (В), которые образуют эмбриоидные тельца (через 72 ч после посева) (С) и демонстрируют успешную нейронную индукцию после 7 дней культивирования (D). Органоид изображает отдельные петли на 15-й день (E) и 30-й день (F). Масштабная линейка: B-D 200 μм, E 400 μм, F 800 μм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Диаграмма секвенирования РНК отдельных клеток и ядра; ферментативная диссоциация, метод градиента Перколла.
Рисунок 2: Рабочий процесс получения отдельных клеток и отдельных ядер из органоидов мозга. Диссоциация органоидов на отдельные клетки проводится путем измельчения органоидов скальпелем с последующим ферментативным расщеплением (вверху). Выделение ядер осуществляется путем механической диссоциации с последующей очисткой с помощью градиента Перколля (дно). Одиночная клетка и суспензия ядер фильтруются и загружаются в микрофлюидную систему для создания библиотеки и секвенирования. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этой цифры.

Изображения клеточной микроскопии, показывающие различную плотность клеток и характер окрашивания; Метод включает в себя окрашивание.
Рисунок 3: Репрезентативные результаты выделенных клеток и ядер из органоидов возрастом 30 дней. (А) Примерное изображение окрашенных в синий цвет трипановых клеток, полученное с помощью клеточного счетчика, и (В) соответствующий крупный план. (C) Наложение светлого поля и флуоресцентного изображения окрашенных ядер DAPI и (D) соответствующий крупный план. Масштабная линейка: 100 μM Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Графики Скрипки, показывающие изменчивость данных по идентичности; Результаты статистического анализа.
Рисунок 4: Контроль качества scRNA- и snRNA-seq. Графики Скрипки иллюстрируют абсолютное количество UMI (A), количество генов (B), митохондриальное (C) и рибосомное чтение (D) клеток (синий) и ядер (розово-фиолетовый). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этой цифры.

Диаграмма UMAP, показывающая кластеры scRNAseq и snRNAseq, анализ экспрессии генов в нейрональных клетках.
Рисунок 5: scRNA-seq и snRNA-seq извлекают сходные клеточные популяции в органоидах 30-дневной давности. Интегрированный встроенный UMAP органоидов 30-дневной давности, показывающий результаты scRNA-seq (синий) и snRNA-seq (розово-фиолетовый) (A), интегрированные и аннотированные и индивидуальные профили scRNA-seq и snRNA-seq (B,C). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этой цифры.

Таблица 1: Среды для клеточных культур и компоненты покрытий Нажмите здесь, чтобы загрузить эту таблицу.

Таблица 2: Буферы диссоциации для scRNA и snRNA-seq. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы скачать эту таблицу.

Файл дополнительного кодирования 1: Файл кодирования, используемый для анализа данных scRNA-seq и snRNA-seq. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить этот файл.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Транскриптомный анализ отдельных клеток и отдельных ядер стал ключевым инструментом для понимания механизмов регуляции генов в сложных тканях. Оба метода позволяют проводить транскриптомные исследования органоидов мозга. Для обеспечения общего успеха эксперимента большое значение имеет качество исходного материала. Поэтому необходимо регулярно резать органоиды, чтобы не допустить образования некротического ядра26. Эту проблему также можно устранить с помощью культуры раздела воздух-жидкость27. Чтобы уменьшить периодические эффекты из-за гетерогенности органоидов, мы рекомендуем использовать не менее четырех органоидов на одну экстракцию. В качестве альтернативы можно провести несколько прогонов секвенирования отдельных органоидов, что дополнительно позволяет изучить изменчивость в пределах одной и той же партии17. При использовании обоих методов, scRNA-seq и snRNA-seq, параллельно, разрезание органоидов на две части и их разделение для каждого метода может еще больше уменьшить различия, вызванные гетерогенностью органоидов.

Для получения высококачественного транскриптомного профиля отдельной клетки или ядра крайне важно, чтобы клеточная или ядерная мембрана оставалась неповрежденной в течение всей процедуры. Поэтому крайне важно оптимизировать как концентрацию ферментов, так и время ферментативного переваривания, которые должны быть скорректированы в соответствии с возрастом и размером органоида. Кроме того, важно использовать правильную температуру и скорость центрифугирования, а также избегать жесткого пипетирования. В случае низкой жизнеспособности можно использовать набор для удаления мертвых клеток после диссоциации органоидов на отдельные клетки. В дополнение к этому, для выделения ядер жизненно важно тщательно промыть органоид с помощью PBS и адаптировать количество ударов с помощью шезлонга к размеру органоида. Также важно тщательно наслаивать градиент Перколла, чтобы избежать нарушений в наслоении. Если после выделения остаются поврежденные ядра, рекомендуется провести этап сортировки с помощью сортировки клеток, активируемых флуоресценцией22. В целом, использование ингибиторов РНКазы жизненно важно для всех этапов от диссоциации образца до создания библиотеки для сохранения высокого качества РНК каждой клетки или ядра.

В этом исследовании scRNA-seq дал больше клеток, что позволило получить более широкий обзор клеточных популяций. Кроме того, клетки содержат больше РНК и легче обогащаются для определенных типов клеток с помощью поверхностных маркеров по сравнению с ядрами. Тем не менее, диссоциация одиночных клеток основана на ферментативном процессе, который может индуцировать транскрипцию РНК, связанных со стрессом19,28. Особенно при заболеваниях, которые связаны с повышенной реакцией на стресс, это может привести к артефактам, вызваннымдиссоциацией20. Кроме того, было показано, что выделение одиночных клеток приводит к потере чувствительных клеточных популяций 3,29. Хотя это может быть не очевидно в данном исследовании, это возможный результат при использовании более старых органоидов мозга, которые характеризуются более высоким клеточным разнообразием.

Поскольку оба набора данных извлекают одни и те же популяции клеток, выбор метода изоляции в значительной степени зависит от исследовательских вопросов, получения тканей и управления временем. В то время как после диссоциации фиксация и хранение одиночных клеток из органоидов мозга в метаноле хорошо установлены30, выделение одиночных ядер из замороженных органоидов мозга все еще требует оптимизации.

В целом, наши протоколы обеспечивают универсальную и адаптируемую платформу для исследования транскриптомного профиля отдельных клеток и ядер в органоидах мозга, прокладывая путь к углубленным исследованиям вопросов, связанных с развитием и заболеваниями, в моделях человеческого мозга in vitro.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Авторы заявляют об отсутствии конкурирующих финансовых интересов.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Благодарим Валерию Фернандес-Валлоне за оригинальную инструкцию к набору Miltenyi Neural Dissociation. Мы также благодарим технологическую платформу геномики Центра Макса Дельбрюка за предоставленный рецепт буфера для лизиса NP40 и ценные советы по настройке этого протокола. Мы также благодарим Маргарету Херцог и Александру Чернычев за организационную поддержку лаборатории.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
1,4-DITHIO-DL-THREIT-LSG., F. D. MOL.-BIOL., ~1 М В H2O (DTT)Sigma  43816-10ML
1,5 мл ДНК пробирки с низким связыванием VWR525-0130микроцентрифужная трубка
10x Cellranger pipeline Пробирка для анализа
15 мл FalconFalcon Центрифуга
2-меркаптоэтанол (BME)Life Technologies21985023
50 мл FalconFalcon Центрифуга пробирка
A83-01Bio Technologies379762
Антибиотик/Антимикотический раствор (100X)Life Technologies15240062
Добавка B-27 Plus LifeTechnologies17504044
Добавка B-27 без витамина АLife Technologies12587010
Бычий сывороточный альбумин, без жирных кислот (BSA)Sigma AldrichA8806-5G 
cAMPBiogems6099240
cAMPBiogems6099240
C-CHIP NEUBAUER IMPROVEDVWRDHC-N01
Cell sither 40 µ mNeolab352340
Клеточный фильтр 70 & микро; m (белый) НейлоновыйSigmaCLS431751-50EA
Chromium и Next GEM Accessory Kit10X Genomics1000204
Chromium Next GEM Chip G Single Cell Kit, 16 rxns10X Genomics1000127
Chromium Next GEM Single Cell 3' Kit v3.110X Genomics1000268
complete,  Ингибитор протеазы без ЭДТА Cocktaill Roche11873580001
DAPIMERCK Chemicals0000001722
DMEM/F12Life Technologies11320074
набор тканевых шлифовальных машин Dounce 2 мл в сбореSigma Aldrich10536355
Essential E8 Flex MediumLife TechnologiesA2858501
EVE Cell Count СлайдыVWREVS-050 ( 734-2676)
Фетальная бычья сыворотка без тетрациклина (FBS)PAN BiotechP30-3602
Geltrex LDEV-Free (покрытие)Life TechnologiesA1413302 
gentleMACSMiltenyi Biotecдиссоциативная маска
GlutaMAX добавкиLife Technologies35050038
гепарин натрия клеточная культура протестированаSigmaH3149-10KU
человеческий рекомбинантный BDNFStemCell Technologies78005.3
человеческий рекомбинантный GDNFStemCell Technologies78058.3
Раствор инсулинаСигма Олдрич Сигма ОлдричI2643-25MG
Замена сыворотки с нокаутомLife Technologies10828028
LDN193189 Гидрохлорид 98%Сигма Олдрич130-106-540
МЭМ заменимая аминокислота (100x)Сигма ОлдричM7145-100мл
MgCl2 Хлорид магния (1M) РНКаза без РНКТермо НаучнаяAM9530G
mTeSR PlusStemCell Technologies100-0276среда стволовых клеток
mTeSR1StemCell Technologies85850среда стволовых клеток
N2 Supplement StemCell Technologies17502048
набор для диссоциации нервной тканиMiltenyi Biotec B.V. & Co. KG130-092-628
Neurobasal PlusLife TechnologiesA3582901
система NextSeq500СеквенсорIllumina
NP-40 Surfact-Amps Моющий растворLife Technologies28324
PBS Дульбекко sInvitrogen14190169
PenStrep (Пенициллин - Стрептомицин)Life Technologies15140122
PercollTh. Geyer10668276
Pluronic (R) F-127Sigma AldrichP2443-1KG
RiboLock RNase InhibitorLife Technologies EO0382
Ингибитор горных пород (Y-27632 дигидрохлорид) SBBiomolCay10005583-10
SB 431542 Biogems3014193
Sodium chloride NaCl (5M), РНКаза-free-100 млInvitrogenAM9760G
StemFlex MediumThermo ScientificA3349401среда стволовых клеток
StemMACS iPS-Brew XFMiltenyi Biotec130-104-368среда стволовых клеток
TC-Platte 96 Well, круглое дноSarstedt83.3925.500
TISSUi006-ATissUse GmbHhttps://hpscreg.eu/cell-line/TISSUi006-A
Трипановый синийT8154-20млSigma
TrypLE Express Enzyme, без фенола красногоLife Technologies12604013реагент на основе трипсина
UltraPure 1M Tris-HCl Buffer, pH 7,5Life Technologies15567027
XAV939Enzo Life sciencesБМЛ-ВН100-0005
контроллер

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Finkbeiner, S. R., et al. Stem cell-derived human intestinal organoids as an infection model for Rotaviruses. mBio. 3 (4), e00159-e00212 (2012).
  2. Freedman, B. S., et al. Modelling kidney disease with CRISPR-mutant kidney organoids derived from human pluripotent epiblast spheroids. Nat Commun. 6, 8715(2015).
  3. Guan, Y., et al. Human hepatic organoids for the analysis of human genetic diseases. JCI Insight. 2 (17), e94954(2017).
  4. Lancaster, M. A., et al. Cerebral organoids model human brain development and microcephaly. Nature. 501 (7467), 373-379 (2013).
  5. Dang, J., et al. Zika virus depletes neural progenitors in human cerebral organoids through activation of the innate immune receptor TLR3. Cell Stem Cell. 19 (2), 258-265 (2016).
  6. Inak, G., et al. Defective metabolic programming impairs early neuronal morphogenesis in neural cultures and an organoid model of Leigh syndrome. Nat Commun. 12 (1), 1929(2021).
  7. Karlsson, M., et al. A single-cell type transcriptomics map of human tissues. Sci Adv. 7 (31), eabh2169(2021).
  8. Piwecka, M., Rajewsky, N., Rybak-Wolf, A. Single-cell and spatial transcriptomics: deciphering brain complexity in health and disease. Nat Rev Neurol. 19 (6), 346-362 (2023).
  9. Lim, B., Lin, Y., Navin, N. Advancing cancer research and medicine with single-cell genomics. Cancer Cell. 37 (4), 456-470 (2020).
  10. Camp, J. G., et al. Human cerebral organoids recapitulate gene expression programs of fetal neocortex development. Proc Natl Acad Sci U S A. 112 (51), 15672-15677 (2015).
  11. Fiorenzano, A., et al. Single-cell transcriptomics captures features of human midbrain development and dopamine neuron diversity in brain organoids. Nat Commun. 13 (1), 3312(2022).
  12. Kanton, S., et al. Organoid single-cell genomic atlas uncovers human-specific features of brain development. Nature. 574 (7778), 418-422 (2019).
  13. Notaras, M., et al. Schizophrenia is defined by cell-specific neuropathology and multiple neurodevelopmental mechanisms in patient-derived cerebral organoids. Mol Psychiatry. 27 (3), 1416-1434 (2022).
  14. Rybak-Wolf, A., et al. Modelling viral encephalitis caused by herpes simplex virus 1 infection in cerebral organoids. Nat Microbiol. 8 (7), 1252-1266 (2023).
  15. Bock, C., et al. The organoid cell atlas. Nat Biotechnol. 39 (1), 13-17 (2021).
  16. Brazovskaja, A., Treutlein, B., Camp, J. G. High-throughput single-cell transcriptomics on organoids. Cur Opinion Biotechnol. 55, 167-171 (2019).
  17. Velasco, S., et al. Individual brain organoids reproducibly form cell diversity of the human cerebral cortex. Nature. 570, 523-527 (2019).
  18. Uzquiano, A., et al. Proper acquisition of cell class identity in organoids allows definition of fate specification programs of the human cerebral cortex. Cell. 185 (20), 3770-3788.e27 (2022).
  19. Mattei, D., et al. Enzymatic dissociation induces transcriptional and proteotype bias in brain cell populations. Int J Mol Sci. 21 (21), 7944(2020).
  20. Van Den Brink, S. C., et al. Single-cell sequencing reveals dissociation-induced gene expression in tissue subpopulations. Nat Methods. 14 (10), 935-936 (2017).
  21. Slyper, M., et al. A single-cell and single-nucleus RNA-Seq toolbox for fresh and frozen human tumors. Nat Med. 26 (5), 792-802 (2020).
  22. Santos, M. D., et al. Extraction and sequencing of single nuclei from murine skeletal muscles. STAR Protoc. 2 (3), 100694(2021).
  23. Fleck, J. S., et al. Inferring and perturbing cell fate regulomes in human cerebral organoids. Nature. 621 (7978), 365-372 (2021).
  24. Martins-Costa, C., et al. Morphogenesis and development of human telencephalic organoids in the absence and presence of exogenous extracellular matrix. EMBO J. 42 (22), e113213(2023).
  25. Hao, Y., et al. Integrated analysis of multimodal single-cell data. Cell. 184 (13), 3573-3587.e29 (2021).
  26. Choe, M. S., et al. A simple method to improve the quality and yield of human pluripotent stem cell-derived cerebral organoids. Heliyon. 7 (6), e07350(2021).
  27. Giandomenico, S. L., et al. Cerebral organoids at the air-liquid interface generate diverse nerve tracts with functional output. Nat Neurosci. 22 (4), 669-679 (2019).
  28. Denisenko, E., et al. Systematic assessment of tissue dissociation and storage biases in single-cell and single-nucleus RNA-seq workflows. Genome Biol. 21 (1), 130(2020).
  29. Wen, F., Tang, X., Xu, L., Qu, H. Comparison of single-nucleus and single-cell transcriptomes in hepatocellular carcinoma tissue. Mol Med Rep. 26 (5), 339(2022).
  30. Alles, J., et al. Cell fixation and preservation for droplet-based single-cell transcriptomics. BMC Biol. 15 (1), 44(2017).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Single Cell TranscriptomicsSingle Nuclei TranscriptomicsBrain OrganoidsOrganoid DissociationNuclei IsolationLibrary PreparationRNA SequencingSpatial TranscriptomicsCell Type RecoveryGene Expression Profiles

Related Articles