Методическая статья

Одновременный сбор данных о мозге и сыворотке крови плода мыши для оценки влияния диеты матери на питание и развитие нервной системы при нейрофиброматозе 1 типа

1.5K просмотров

⸱

DOI:

10.3791/66226

⸱

17 мая 2024 г.

 ,  , 
1Department of Pediatrics, Washington University in St. Louis

В этой статье

Краткое содержание

В этом протоколе мы описываем метод одновременного сбора мозговой ткани плода, а также высококачественной негемолизированной сыворотки из одного и того же эмбриона мыши. Мы использовали этот метод для изучения того, как воздействие пищи на организм матери влияет на профили макронутриентов и развитие нервной системы плода у мышей, гетерозиготных по Nf1 (нейрофиброматоз 1 типа).

Аннотация

Было продемонстрировано, что ожирение, вызванное материнским питанием, изменяет развитие нервной системы у потомства, что может привести к снижению когнитивных способностей, гиперактивности и нарушениям в социальном поведении. Пациенты с клинически гетерогенным генетическим заболеванием нейрофиброматозом 1-го типа (НФ1) могут иметь аналогичные дефициты, но в настоящее время неясно, влияют ли факторы окружающей среды, такие как материнская диета, на развитие этих фенотипов, и если да, то с помощью какого механизма может произойти такой эффект. Чтобы дать возможность оценить, как воздействие диеты матери на ожирение влияет на системные факторы, связанные с развитием нервной системы при NF1, мы разработали метод одновременного сбора негемолизированной сыворотки и целого или регионально микрорасчлененного мозга от плода мышиных самок, получавших контрольную диету, в сравнении с диетой с высоким содержанием жиров и сахарозы. Мозг обрабатывали для криосекции или мгновенной заморозки для использования для последующего выделения РНК или белка; Качество собранной ткани было проверено с помощью иммуноокрашивания. Качество сыворотки было проверено путем анализа профилей макронутриентов. Используя эту методику, мы установили, что диета матери с ожирением повышает уровень холестерина в сыворотке крови плода аналогично между гетерозиготными детенышами WT и Nf1.

Введение

Нейрофиброматоз 1-го типа (NF1) считается RASopathy, группой расстройств, характеризующихся генетическими мутациями зародышевой линии, приводящими к активации сигнального пути RAS/MAPK (вирус саркомы RAt/митоген-активируемая протеинкиназа). Пациенты с NF1 RASopathy подвержены риску развития многих различных проявлений, включая как доброкачественные, так и злокачественные опухоли центральной (глиома зрительного пути 1,2, глиома высокой степенизлокачественности 3,4) и периферической (плексиформная нейрофиброма5,6, злокачественная опухоль оболочки периферических нервов 7,8) нервной системы, а также дисплазиикостей 9 и пигментные аномалии кожи10 (подмышечные веснушки, макулы café-au-lait). Влияние этого расстройства на когнитивные способности и развитие нервной системы признается все шире, при этом у пациентов с НФ1 наблюдается повышенная частота нарушений обучаемости, гиперактивности и расстройств аутистического спектра 11,12,13. Тем не менее, существует значительная гетерогенность в развитии этих фенотипов между пациентами 13,14,15,16,17, и неясно, почему некоторые пациенты демонстрируют значительные когнитивные нарушения, в то время как другие не страдают от них. Было показано, что ожирение, вызванное питанием матери, аналогичным образом влияет на обучение и поведение в общей популяции 18,19,20,21,22,23,24,25,26,27,28, предполагая, что дифференциальные пищевые воздействия матери на НФ1 могут быть одним из источников этой клинической гетерогенности. В частности, дети матерей с ожирением демонстрируют повышенный риск развития гиперактивности 18,19,20,23,25,26, аутизма 19,24,27, дефицита исполнительных функций 21,23, а также имеют более низкие показатели IQ по полной шкале22,28. Тем не менее, пациенты с НФ1 имеют измененные метаболические фенотипы по сравнению с общей популяцией, включая снижение заболеваемости ожирением и диабетом 29,30,31, что делает неясным, будут ли они реагировать одинаково на пищевые стимулы.

Чтобы ответить на эти вопросы, мы хотели определить, способствуют ли изменения профиля макронутриентов у потомства плода с Nf1 , вызванные обезогенной диетой, изменениям в развитии нервной системы. Ранее мы собрали высококачественную цельную и регионально микродиссекционированную ткань, подходящую для применения в развитии нервной системы, из мозга плода32. Тем не менее, забор крови плода затруднен из-за небольшого размера тела и малого объема крови33. Забор крови с помощью гравитационного дренажа после обезглавливания привел к низким объемам сбора и значительному гемолизу в наших образцах, что может повлиять на интерпретацию последующих применений. Забор путем аспирации из сердца плода или грудных сосудов, как сообщалосьранее33, был технически сложным и также приводил к частому гемолизу. Таким образом, мы разработали метод сбора фетальной сыворотки, в котором используются специальные капиллярные трубки, позволяющие собирать больший объем без значительного напряжения сдвига.

Здесь мы представляем этот метод для одновременного сбора эмбрионального мозга и сыворотки плода от Nf1-гетерозиготных щенков, подвергшихся воздействию диеты с высоким содержанием жиров и сахара, по сравнению с контрольной диетой внутриутробно (рис. 1 и дополнительная таблица S1). Мозг был криовстроен для последующего анализа с помощью иммунофлуоресценции или регионально микропрепарирован и мгновенно заморожен для последующего использования в приложениях молекулярной биологии. Была получена высококачественная сыворотка, пригодная для последующих применений, таких как профилирование макронутриентов. Используя этот метод, мы определили, что воздействие пищи с высоким содержанием жиров и сахарозы приводит к повышению уровня холестерина в сыворотке крови как у WT, так и у Nf1-гетерозиготных детенышей.

Протокол

Все процедуры на животных в этом исследовании соответствовали рекомендациям NIH и были одобрены Комитетом по уходу за животными и их использованию Вашингтонского университета в Сент-Луисе. Животные содержались со стандартным 12-часовым циклом «свет:темнота» и свободным доступом к еде и воде.

1. Материнский рацион

  1. Посадите самок мышей на контрольную диету (CD) или диету для ожирения (Ob) в возрасте 4 недель.
  2. В возрасте 8-12 недель организуйте спаривание по времени, наблюдая за слизистой пробкой матери ранним утром, чтобы определить правильный возраст сбора. Чтобы убедиться в ожирении, вызванном диетой, взвесьте самок во время спаривания.
    Примечание: Диапазон 8-12 недель использовался для первоначальной установки спаривания, чтобы убедиться, что самки, получавшие ожирение, имели избыточный вес по сравнению со своими собратьями, что не всегда происходило к 8-недельному возрасту. День пробки считается эмбриональным днем 1 (E1), и все животные, использованные в этом исследовании, были собраны в E19. Поздняя временная точка плода была выбрана из-за изменений в развитии нервной системы, ранее наблюдавшихся в это время у животных, подвергшихся воздействию диеты с ожирением (данные не показаны).

2. Удаление плода из плотины

  1. Во-первых, убедитесь, что плотина выглядит упругой (форма живота и полнота, пальпация живота или шевеления плода). Если вы сомневаетесь, взвесьте самку еще раз, чтобы измерить прибавку в весе.
    ПРИМЕЧАНИЕ: У беременных мышей на поздних сроках прибавка в весе должна составлять не менее 3-4 г. Чтобы увеличить вероятность зачатия в желаемые сроки, грязные (содержащие мочу и феромоны) опилки из клетки самца можно добавлять в клетку самки ежедневно в течение 3 дней до спаривания, чтобы вызвать течку.
  2. Усыпите дамбу, поместив ее в камеру с бумажным полотенцем, содержащим 3 мл изофлурана, стараясь избегать прямого контакта дамбы с бумажным полотенцем, смоченным анестетиком. После того, как животное будет успокоено, положите его на бумажное полотенце, держите за хвост, поместите ножницы для рассечения у шеи, а затем с силой потяните ножницы вверх к голове, чтобы выполнить шейный вывих. В качестве альтернативы проводят обезглавливание после седации изофлураном.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Сыворотка может быть собрана из плотины на этом этапе, используя методологию, аналогичную описанной ниже, но с более крупными капиллярными трубками. Если это необходимо, следует провести обезглавливание, а не вывих шейки матки. Следует позаботиться о том, чтобы фенотип интереса не изменялся при введении изофлурана непосредственно перед эвтаназией.
  3. Поместите дамбу подфюзеляжной стороной вверх в посуду диаметром 100 мм. Защипните кожу, покрывающую живот, и сделайте разрез по средней линии ножницами для рассечения. Сделайте дополнительные разрезы перпендикулярно разрезу по средней линии, чтобы создать лоскуты кожи, чтобы обнажить матку, содержащую эмбрионы.
  4. Вытащите матку из брюшной полости. С помощью ножниц отсоедините матку от плотины. Поместите неповрежденный эмбриональный мешок («жемчужины на нитке»), содержащий эмбрионы, в чашку с холодным стерильным 1x фосфатно-солевым буфером (PBS). Поставьте блюдо с плодами на лед.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Поскольку каждый помет обычно содержит 6-10 детенышей, которые будут собраны как для мозга, так и для сыворотки, плод держат на льду, чтобы избежать деградации тканей. Помещение щенков на лед дополнительно обеспечивает адекватную эвтаназию щенков, так как одной материнской эвтаназии не всегда может быть достаточно. Если требуется только сбор сыворотки, может быть предпочтительнее сбор при комнатной температуре.

3. Забор фетальной сыворотки

  1. Извлеките плод из эмбрионального мешка, аккуратно рассекая щипцами #5. Перенесите эмбрион в чашку с помощью изогнутых щипцов со свежими холодными стерильными 1x PBS.
  2. Аккуратно промокните животное на бумажном полотенце, чтобы удалить остатки околоплодных вод и PBS с образца.
  3. Держите животное за живот. Частично обезглавьте животное микроножницами, сделав надрез на брюшной шее. Убедитесь, что кровеносные сосуды перерезаны, но кожа, удерживающая голову, все еще прикреплена.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Голова должна оставаться прикрепленной, чтобы кровь могла быть собрана из тела и головы одновременно.
  4. Держите тело под углом 45° разрезом вниз. Держите миниветту (капиллярную трубку) объемом 50 мкл параллельно месту разреза плотины, где кровь образует каплю. Осторожно дайте капиллярной трубке объемом 50 мкл наполниться кровью.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Капиллярная трубка x2 или капиллярная трубка объемом 100 мкл может быть использована для сбора до ~75 мкл крови.
  5. Поместите голову в свежую посуду диаметром 60 мм, содержащую холодный, стерильный 1x PBS для дальнейшего сбора тканей (раздел 4).
  6. После того как кровь окажется в капиллярной трубке, быстро вдавите поршень в пробирку объемом 1,5 мл. Переверните трубку или быстро поверните ее, чтобы убедиться, что кровь находится на дне пробирки.
  7. Повторите то же самое для остальной подстилки.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Держать щенков на льду и быстро перемещаться между ними необходимо для снижения риска посмертной коагуляции, которая ограничит объем сбора.
  8. Коагулируйте кровь при комнатной температуре в течение 30 минут.
  9. Центрифугируйте образцы крови при 4 °C, 16 000 × г в течение 20 минут.
  10. Перенесите сыворотку в свежие пробирки объемом 500 мкл с помощью пипетки объемом 200 мкл, не нарушая гранулу клеток крови на дне пробирки.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Сыворотка должна быть соломенного цвета без красных остатков. Каждый плод должен дать 15-30 μл сыворотки.
  11. Храните собранную сыворотку при температуре -80 °C.

4. Забор мозга плода

  1. Глядя в препарирующий микроскоп, придерживайте рыло с помощью изогнутых щипцов и с помощью щипцов #5 осторожно снимите кожу с черепной шапки, удерживая ее прикрепленной к морде для удобства удержания. Под углом #5 под углом 45° относительно черепной коробки, осторожно проколите прозрачную мембрану, которая является развивающимся черепом, сдвиньте щипцы параллельно черепной коробке, вставьте его под черепную крышку, а затем сожмите и снимите в сторону. После того, как одна сторона будет удалена, возьмитесь за оставшуюся сторону щипцами #5 и отклейте на другую сторону.
  2. Аккуратно вытащите мозг из черепа с помощью микроложки и перенесите мозг в свежую 60-миллиметровую чашку, содержащую холод 1x PBS.
    ПРИМЕЧАНИЕ: На этом этапе весь мозг может быть зафиксирован и встроен для иммуноокрашивания. См. ранее опубликованную методологию32.
  3. Если ткань необходимо заморозить для других молекулярных применений, подразделите интересующую область. Изоляция перивентрикулярной ткани вокруг латерального, третьего и четвертого желудочков описана ниже.
    1. С помощью изогнутых щипцов удерживайте мозг на стыке заднего и переднего мозга недоминантной рукой. Доминирующей рукой держите скальпель лезвием параллельно поверхности мозга. Сильно надавите на среднюю корковую область (Рисунок 1).
    2. Все еще удерживая задний мозг, сделайте второй разрез перед задним мозгом, чтобы отделить его от переднего мозга (рисунок 1). В самом переднем отделе ищите два небольших полукруглых пространства, расположенных в горизонтальной плоскости, которые являются боковыми желудочками. Используйте изогнутые щипцы, размещенные в центре каждого желудочка, чтобы удержать мозг на месте, осторожно рассеките слизистую оболочку с помощью щипцов #5 и извлеките в свежую чистую микроцентрифужную пробирку объемом 1,5 мл.
    3. В среднем отделе ищите небольшое линейное пространство на вентральной поверхности, которое является третьим желудочком. С помощью щипцов #5 осторожно отщипните слизистую оболочку с обеих сторон поверхности желудочка, затем извлеките в свежую чистую микроцентрифужную пробирку объемом 1,5 мл.
    4. В самом заднем отделе найдите небольшое линейное пространство в центре заднего мозга, которое является четвертым желудочком. Рассеките слизистую оболочку с обеих сторон с помощью щипцов #5, затем извлеките в свежую чистую микроцентрифужную пробирку объемом 1,5 мл.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Если разрез заднего мозга не является чистым разрезом, ткань четвертого желудочка может быть затемнена и/или разрушена.
    5. Для этапов 4.3.2-4.3.4, сразу после помещения ткани в микроцентрифужные пробирки, быстро поместите пробирки в криобезопасный контейнер, содержащий жидкий азот.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Пробирки можно держать в жидком азоте до тех пор, пока не будут препарированы оставшиеся образцы. ВНИМАНИЕ: Жидкий азот может вызвать сильное обморожение. Не погружайте руки непосредственно в жидкий азот и избегайте брызг.
    6. Поместите замороженную пробирку (пробирки) на сухой лед и переложите замороженную ткань в морозильную камеру при температуре -80 °C до использования.

Результаты

Чтобы проиллюстрировать качество мозговой ткани, полученной с помощью этого метода, мы показали образцы эмбрионального мозга мышей Nestin-CFPnuc35, иммуноокрашенных на GFAP в соответствии с ранее описанной методикой32. Клетки Nestin+ выстилают боковой желудочек (рис. 2A), а филаменты GFAP+ отходят от поверхности. Мы не наблюдали различий между экспрессией Nestin или GFAP в боковом желудочке CD по сравнению с мышами, подвергшимися воздействию Ob, в гетерозиготных штаммах WT или Nf1 (рис. 2A, B). Затем мы оценили качество микродиссектированной ткани. Сначала мы выполнили вестерн-блоттинг36 для белка хозяйствования β-актина на микродиссекционированной ткани, выделенной из боковых желудочков БК по сравнению с мышами, подвергшимися воздействию Ob. Все образцы показали сильную экспрессию β-актина (рис. 2C), как и ожидалось. Затем мы выделили РНК из микродиссекированной ткани в соответствии с ранее описанной методикой32. Выделенная РНК продемонстрировала как высокую чистоту (260/280 ≥ 2), так и целостность (значения RIN ≥ 9), что указывает на высокую чистоту, недеградированную РНК (рис. 2D).

Затем мы сравнили различные методы выделения сыворотки. Используя наш метод minivette, мы обычно собирали большие объемы негемолизированной сыворотки, в то время как гравитационный дренаж и торакальная пункция приводили к очень вариабельному объему сбора и гемолизу во многих образцах (рис. 3A, B). Чтобы проиллюстрировать качество сыворотки, полученной с помощью этой методики, мы измерили уровень общего холестерина в сыворотке крови с помощью реагента для общего холестерина в соответствии с инструкциями производителя. Уровни холестерина в организме плода были в пределах ожидаемого диапазона для щенков на поздних сроках беременности на основании предыдущих исследований на человеческих плодах37. Уровни были повышены у мышей, подвергшихся воздействию Ob, по сравнению с мышами, подвергшимися воздействию CD, как для дикого типа (рисунок 3C, слева), так и для Nf1-гетерозиготных щенков (рисунок 3C, справа). Обратите внимание, что на правой панели представлены объединенные данные двух различных гетерозиготных штаммов Nf1 с идентифицированными пациентом мутациями зародышевой линии (R681X, C383X)32,38,39, поскольку аналогичные профили были обнаружены у обоих штаммов.

figure-results-1
Рисунок 1: Графическая аннотация рабочего процесса. Детенышей сначала изолируют от беременных матерей. Затем у щенков собирают сыворотку. Наконец, цельный мозг изолируется от щенков и, при желании, микропрепарируется для областей, представляющих интерес. Графика создана с помощью BioRender.com. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этой цифры.

figure-results-2
Рисунок 2: Иллюстративные результаты, ткань мозга. (A) Криосекционный мозг мышей с Nestin-CFPnuc, экспрессирующий ядерно-локализованный голубой флуоресцентный белок под контролем промотора Nestin, был собран с помощью этого метода и иммуноокрашен на GFAP (красный) в соответствии с ранее описанной методологией. Нестин-положительные клетки визуализируются с помощью эндогенной экспрессии Nestin-CFPnuc (зеленый цвет). Ядра противостоправляли бис-бензимидом (синим). Не было существенных различий между мозгом WT, подверженным воздействию БК и Ob. Масштабная линейка = 100 мкм. (B) Nestin-CFPnuc; Аналогичным образом оценивались щенки Nf1mut/+. Распределение GFAP и Nestin-CFP оказалось сходным с WT и не изменялось в зависимости от диетических условий. Масштабная линейка = 100 мкм. (C) Белок был выделен из микродиссектированной ткани из ЛЖ. Вестерн-блоттинг проводили по ранее описанной методике36 с загрузкой 20 мкг белка на линию. Сильная экспрессия β-актина была обнаружена во всех образцах. (D) РНК выделяли из микродиссектированной ткани в соответствии с ранее описанной методологией32. Качество РНК оценивали с помощью соотношений 260/280 и значений РИН. Все образцы показали отличные соотношения 260/280 (≥2) и значения RIN (≥9), что указывает на хорошую изоляцию недеградированной РНК. Сокращения: CFP = голубой флуоресцентный белок; GFAP = глиальный фибриллярный кислый белок; WT = дикий тип; ЛЖ = боковой желудочек; RIN = Число целостности РНК. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этой цифры.

figure-results-3
Рисунок 3: Иллюстративные результаты и сыворотка. (A) Сыворотка была собрана с помощью каждого из описанных методов. Сбор с помощью миниветта позволил рутинно собирать негемолизированную сыворотку по сравнению с гравитационным дренированием и торакальной пункцией. (B) Показаны типичные объемы сбора сыворотки. Коллекция Minivette позволила более воспроизводимый сбор больших объемов сыворотки. Статистическая значимость определяется с помощью одностороннего ANOVA с множественными сравнениями. (C) Общий уровень холестерина в сыворотке крови измеряли по сравнению с WT, подвергшейся воздействию Ob (слева) и Nf1-гетерозиготной (справа) объединенной фетальной сывороткой; Животные, подвергшиеся воздействию Ob, показали более высокий уровень холестерина в сыворотке крови в обоих генотипах. Статистическая значимость определяется по t-критерию. Погрешности: SEM. Сокращения: WT = дикий тип; CD = контрольная диета; Ob = диета для ожирения. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этой цифры.

Дополнительная таблица S1: Диетические составы. Показан состав контрольной и ожиренной диет, используемых в данной рукописи. ПРИМЕЧАНИЕ: Для диеты с низким содержанием жиров и сахарозы, которая лучше контролирует отдельные пищевые компоненты D12331, может быть предпочтительной диета D12328 (researchdiets.com). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить этот файл.

Обсуждение

Традиционные методы сбора крови у мышей включают ретробульбарную, хвостовую вену, подкожную вену, лицевую вену и кровотечение из яремной вены 40,41,42. К сожалению, эти методы не идеальны для забора эмбриональной крови из-за размеров животного и маленькой, нежной сосудистой сети. Забор крови с помощью гравитационного дренажа после обезглавливания привел как к малым объемам забора, так и к значительному гемолизу в наших образцах. В предыдущих протоколах сообщалось об увеличении объемов за счет использования модифицированной иглы 20 G для отвода крови из грудных кровеносных сосудов33; Тем не менее, мы сочли этот метод технически сложным и обнаружили высокую скорость гемолиза, что сделало его непригодным для многих последующих применений. Преимущество нашего метода заключается в том, что он собирает кровь с помощью пассивного кровотока, снижая риск гемолиза от стресса, вызванного аспирацией. Поршень на капиллярной трубке также обеспечивает быстрый и эффективный способ доставки крови в сборную трубку, сводя к минимуму воздействие воздуха и ограничивая фрагментацию тромбов. Важно отметить, что целая или регионально микрорасчлененная ткань мозга может быть впоследствии собрана у того же животного, что снижает общую потребность экспериментальных животных.

Этот протокол не лишен корректировок для оптимизации качества и эффективности сбора. Для сбора сыворотки крови крайне важно аккуратно удалить эмбриональную жидкость и лишнюю PBS у животного перед забором крови, так как избыток жидкости может сделать животное скользким и увеличить вероятность плохого или нестабильного положения, негативно влияющего на качество забора крови. Кроме того, положение пальцев во время удержания эмбриона имеет решающее значение, так как кровь будет прилипать к пальцу в перчатке во время сбора, если палец прилегает к капиллярной трубке. Также важно, чтобы отверстие капиллярной трубки находилось рядом с протекающей кровью, а не погружалось в нее; Накопление капилляров будет нарушено, если трубка будет погружена в воду. Наконец, необходимо тщательно рассмотреть последующее применение для оптимизации сбора сыворотки. Например, глюкоза со временем разлагается в необработанных пробирках при комнатной температуре, поэтому для точного количественного определения уровня глюкозы43,44 может потребоваться сбор в пробирки, содержащие фторид натрия или ЭДТА.

Для забора мозговой ткани тщательное удаление кожи и прозрачного черепа с обеих сторон головы имеет решающее значение для чистой экстракции. Если рассекать только одну сторону, мозг может прилипнуть к черепу при попытке удаления, что приведет к разрыву и деформации ткани. Для разделения мозга важно делать одиночные чистые срезы, чтобы отделить переднюю часть от средней коры и среднюю кору от заднего мозга. Множественные разрезы могут нарушить структурную целостность ткани или скрыть точку отсчета для последующей микродиссекции. Наконец, хранение образцов на льду до фиксации или мгновенной заморозки имеет решающее значение для предотвращения деградации образца.

Несмотря на то, что мы предпочитаем этот метод из-за регулярного сбора сыворотки большего объема, он не лишен недостатков. Хотя гемолиз снижен по сравнению с другими методами, этот метод не устраняет риск. Капиллярная трубка также может быть закупорена сгустком крови, как только кровь перестает течь, поэтому важно работать быстро после обезглавливания, чтобы снизить риск неудачного сбора крови из-за коагуляции. Хранение образцов на льду, которое делается для сохранения целостности образца в соответствии с этим протоколом, также может отрицательно повлиять на некоторые фенотипы и может не подходить для всех применений.

В заключение следует отметить, что эта методология может быть использована для одновременной изоляции сывороточного, а также цельного или регионально микрорасчлененного мозга от одного и того же плода. Этот метод может быть использован для изучения того, как системные факторы, такие как изменение профиля макронутриентов, вызванное питанием матери, могут повлиять на развитие нервной системы при NF1 или других расстройствах.

Раскрытие информации

У авторов нет конфликта интересов.

Благодарности

Н. Броссье поддерживается Программой стипендиатов Фрэнсиса С. Коллинза в области клинических и трансляционных исследований нейрофиброматоза, финансируемой Программой терапевтического ускорения нейрофиброматоза (NTAP, грант # 210112). Эта публикация была частично поддержана финансированием NTAP в Медицинской школе Университета Джона Хопкинса. Его содержание является исключительной ответственностью авторов и не обязательно отражает официальную точку зрения Медицинской школы Университета Джонса Хопкинса. Дополнительная поддержка со стороны Детской больницы Сент-Луиса (FDN-2022-1082 to NMB) и Исследовательского центра диабета Вашингтонского университета в Сент-Луисе (NIH P30 DK020579). Микроскопия проводилась с использованием Центра клеточной визуализации Вашингтонского университета (WUCCI) при поддержке Медицинской школы Вашингтонского университета, Института детских открытий Вашингтонского университета и Детской больницы Сент-Луиса (CDI-CORE-2015-505 и CDI-CORE-2019-813) и Фонда Барнс-Еврейской больницы (3770 и 4642). Мыши Nestin-CFPnuc35 были любезно предоставлены Григорием Ениколоповым (Renaissance School of Medicine, Университет Стоуни-Брук, Нью-Йорк), а мыши Nf1, гетерозиготные по мутации зародышевой линии R681X или C383X 32,38,39, были любезно предоставлены Дэвидом Гутманом (Вашингтонская университетская школа медицины, Сент-Луис, Миссури). Рисунок 1 был создан с помощью BioRender.com.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
#5/45 ЩипцыDumont 11251-35Форма наконечника: угловой 45&�;
4200 TapestationAgilentG2991BAПроверка целостности и качества РНК, измерение значений RIN
Настольный контейнер для жидкого азотаThermo Fisher2122или другой криобезопасный контейнер
Control ChowPicoLab5053Исследовательские диеты D12328 (с низким содержанием жира, с низким содержанием сахара).
Изогнутые щипцыCole ParmerUX-10818-25Форма наконечника: изогнутый 90°
Рукоятка для препарирования лезвияCole-Parmer Essentials10822-20SS Siegel-Type, #10 - #15 лезвия
EMS SuperCut Dissection Ножницыдля электронного микроскопанауки 72996-015½ " (139,7 мм), Прямое
антитело GFAPAbcamab7260разбавить 1:350. Блок с 10% сывороткой, содержащей 0,3 М Глицина.
Хирургические лезвия Glassvan из углеродистой стали, размер 11MYCO medical2001T-11#11 лезвия позволяют прямой, плоский срез
микролабораторной ложкиAz ScilabA2Z-VL001нержавеющая сталь, автоклавируемые
микроножницыRubis78180-1C3модель 1C300
Minivette  POCT нейтральныйSarstedt17.2111.050номинальный объем: 50 & микро; L, без препарата
NanoropThermo Fisher13-400-519Измерять концентрацию РНК, соотношение 260/280
Диета для ожиренияResearchdiets.comD12331с высоким содержанием жиров и сахарозы
Thermo FisherTR13421колориметрическое обнаружение
бета;-актиновых антителCell Signaling8457Разбавлять 1:1,000.
Реагент общего холестерина

Ссылки

  1. Listernick, R., Darling, C., Greenwald, M., Strauss, L., Charrow, J. Optic pathway tumors in children: the effect of neurofibromatosis type 1 on clinical manifestations and natural history. J Pediatr. 127 (5), 718-722 (1995).
  2. Fisher, M. J., et al. Integrated molecular and clinical analysis of low-grade gliomas in children with neurofibromatosis type 1 (NF1). Acta Neuropathol. 141 (4), 605-617 (2021).
  3. Cimino, P. J., et al. Expanded analysis of high-grade astrocytoma with piloid features identifies an epigenetically and clinically distinct subtype associated with neurofibromatosis type 1. Acta Neuropathol. 145 (1), 71-82 (2023).
  4. Lucas, C. -H. G., et al. Multiplatform molecular analyses refine classification of gliomas arising in patients with neurofibromatosis type 1. Acta Neuropathol. 144 (4), 747-765 (2022).
  5. Fisher, M. J., et al. Management of neurofibromatosis type 1-associated plexiform neurofibromas. Neuro-Oncol. 24 (11), 1827-1844 (2022).
  6. Packer, R. J., et al. Plexiform neurofibromas in NF1. Neurology. 58 (10), 1461-1470 (2002).
  7. Evans, D. G. R., et al. Malignant peripheral nerve sheath tumours in neurofibromatosis 1. J Med Genet. 39 (5), 311(2002).
  8. Prudner, B. C., Ball, T., Rathore, R., Hirbe, A. C. Diagnosis and management of malignant peripheral nerve sheath tumors: Current practice and future perspectives. Neurooncol Adv. 2, Suppl 1 i40-i49 (2020).
  9. Ma, Y., et al. A molecular basis for neurofibroma-associated skeletal manifestations in NF1. Genet Med. 22 (11), 1786-1793 (2020).
  10. Ozarslan, B., Russo, T., Argenziano, G., Santoro, C., Piccolo, V. Cutaneous findings in neurofibromatosis Type 1. Cancers. 13 (3), 463(2021).
  11. Hyman, S. L., Shores, A., North, K. N. The nature and frequency of cognitive deficits in children with neurofibromatosis type 1. Neurology. 65 (7), 1037-1044 (2005).
  12. Morris, S. M., et al. Disease burden and symptom structure of autism in neurofibromatosis type 1: a study of the International NF1-ASD Consortium Team (INFACT). JAMA Psychiatry. 73 (12), 1276-1284 (2016).
  13. Geoffray, M. -M., et al. Predictors of cognitive, behavioural and academic difficulties in NF1. J Psychiatr Res. 140, 545-550 (2021).
  14. Monroe, C. L., Dahiya, S., Gutmann, D. H. Dissecting clinical heterogeneity in neurofibromatosis type 1. Ann Rev Pathol. 12 (1), 53-74 (2017).
  15. Kehrer-Sawatzki, H., Mautner, V. -F., Cooper, D. N. Emerging genotype-phenotype relationships in patients with large NF1 deletions. Hum Genet. 136 (4), 349-376 (2017).
  16. Hou, Y., et al. Predictors of cognitive development in children with neurofibromatosis type 1 and plexiform neurofibromas. Dev Med Child Neurol. 62 (8), 977-984 (2020).
  17. Biotteau, M., et al. Sporadic and familial variants in NF1: an explanation of the wide variability in neurocognitive phenotype. Front Neurol. 11, 368(2020).
  18. Rodriguez, A., et al. Maternal adiposity prior to pregnancy is associated with ADHD symptoms in offspring: evidence from three prospective pregnancy cohorts. Int J Obes (Lond). 32 (3), 550-557 (2008).
  19. Andersen, C. H., Thomsen, P. H., Nohr, E. A., Lemcke, S. Maternal body mass index before pregnancy as a risk factor for ADHD and autism in children). Eur Child Adolesc Psychiatry. 27 (2), 139-148 (2018).
  20. Pugh, S. J., et al. Gestational weight gain, prepregnancy body mass index and offspring attention-deficit hyperactivity disorder symptoms and behaviour at age 10. Bjog. 123 (13), 2094-2103 (2016).
  21. Mina, T. H., et al. Prenatal exposure to maternal very severe obesity is associated with impaired neurodevelopment and executive functioning in children. Pediatr Res. 82 (1), 47-54 (2017).
  22. Oken, E., et al. Analysis of maternal prenatal weight and offspring cognition and behavior: Results from the Promotion of Breastfeeding Intervention Trial (PROBIT) Cohort. JAMA Netw Open. 4 (8), e2121429-e2121429 (2021).
  23. Buss, C., et al. Impaired executive function mediates the association between maternal pre-pregnancy body mass index and child ADHD symptoms. PLOS ONE. 7 (6), e37758(2012).
  24. Li, Y. -M., et al. Association between maternal obesity and autism spectrum disorder in offspring: a meta-analysis. J Autism Dev Disord. 46 (1), 95-102 (2016).
  25. Dow, C., Galera, C., Charles, M. -A., Heude, B. Maternal pre-pregnancy BMI and offspring hyperactivity-inattention trajectories from 3 to 8 years in the EDEN birth cohort study. Eur Child Adolesc Psychiatry. 32 (10), 2057-2065 (2023).
  26. Fast, K., et al. Prevalence of attention-deficit/hyperactivity disorder and autism in 12-year-old children: A population-based cohort. Devl Med Child Neurol. 66 (4), 493-500 (2023).
  27. Carter, S. A., et al. Maternal obesity and diabetes during pregnancy and early autism screening score at well-child visits in standard clinical practice. Autism. 28 (4), 975-984 (2023).
  28. West, Z., et al. Relationships between maternal body mass index and child cognitive outcomes at 3 years of age are buffered by specific early environments in a prospective Canadian birth cohort. J Dev Orig Health Dis. 14 (1), 42-52 (2023).
  29. Gutmann, D. H., et al. Neurofibromatosis type 1. Nat Rev Dis Primers. 3, 17004(2017).
  30. Martins, A. S., et al. Lower fasting blood glucose in neurofibromatosis type 1. Endocr Connect. 5 (1), 28-33 (2016).
  31. Martins, A. S., et al. Increased insulin sensitivity in individuals with neurofibromatosis type 1. Arch Endocrinol Metab. 62 (1), 41-46 (2018).
  32. Brossier, N. M., Thondapu, S., Cobb, O. M., Dahiya, S., Gutmann, D. H. Temporal, spatial, and genetic constraints contribute to the patterning and penetrance of murine Neurofibromatosis-1 optic glioma. Neuro Oncol. 23 (4), 625-637 (2020).
  33. de Lurdes Pinto, M., et al. Technical Report: Mouse fetal blood collection taking the best out of the old needle-syringe method. Scandinavian Journal of Laboratory Animal Science. 35 (1), 5(2008).
  34. Musillo, C., et al. Bdnf-Nrf-2 crosstalk and emotional behavior are disrupted in a sex-dependent fashion in adolescent mice exposed to maternal stress or maternal obesity. Transl Psychiatry. 13 (1), 399(2023).
  35. Encinas, J. M., Vaahtokari, A., Enikolopov, G. Fluoxetine targets early progenitor cells in the adult brain. Proc Natl Acad Sci U S A. 103 (21), 8233-8238 (2006).
  36. Anastasaki, C., et al. Human induced pluripotent stem cell engineering establishes a humanized mouse platform for pediatric low-grade glioma modeling. Acta Neuropathol Commun. 10 (1), 120(2022).
  37. Cai, H. -J., Xie, C. -L., Chen, Q., Chen, X. -Y., Chen, Y. -H. The relationship between hepatic low-density lipoprotein receptor activity and serum cholesterol level in the human fetus. Hepatology. 13 (5), 852-857 (1991).
  38. Toonen, J. A., et al. NF1 germline mutation differentially dictates optic glioma formation and growth in neurofibromatosis-1. Hum Mol Genet. 25 (9), 1703-1713 (2016).
  39. Guo, X., Pan, Y., Gutmann, D. H. Genetic and genomic alterations differentially dictate low-grade glioma growth through cancer stem cell-specific chemokine recruitment of T cells and microglia. Neuro Oncol. 21 (10), 1250-1262 (2019).
  40. Parasuraman, S., Raveendran, R., Kesavan, R. Blood sample collection in small laboratory animals. J Pharmacol Pharmacother. 1 (2), 87-93 (2010).
  41. Meyer, N., et al. Impact of three commonly used blood sampling techniques on the welfare of laboratory mice: Taking the animal's perspective. PLOS ONE. 15 (9), e0238895(2020).
  42. Diehl, K. H., et al. A good practice guide to the administration of substances and removal of blood, including routes and volumes. J Appl Toxicol. 21 (1), 15-23 (2001).
  43. Jung, J., Garnett, E., Rector, K., Jariwala, P., Devaraj, S. Effect of collection tube type on glucose stability in whole blood. Ann Clin Lab Sci. 50 (4), 557-559 (2020).
  44. Bonetti, G., et al. Which sample tube should be used for routine glucose determination. Prim Care Diabetes. 10 (3), 227-232 (2016).

Перепечатки и разрешения

Теги

Сбор тканей плодного мозгазабор сыворотки кровимышиная модельобesoгенная диетадиссекция мозгаанализ макронутриентовглиома зрительного пути
Одновременный сбор данных о мозге и сыворотке крови плода мыши для оценки влияния диеты матери на питание и развитие нервной системы при нейрофиброматозе 1 типа
Связаться с нами
Порекомендовать библиотеке

Конфиденциальность

Условия использования

Политики

© 2026 MyJoVE Corporation. Все права защищены.