Измерение бактериальной колонизации корнями Arabidopsis thaliana в гидропонном состоянии

Существуют количественные и качественные методы выявления колонизации ризосферы одним штаммом бактерий. Для качественного метода следует использовать штамм, который конститутивно экспрессирует флуоресценцию, а распределение и интенсивность флуоресценции следует исследовать с помощью флуоресцентной микроскопии или лазерных конфокальных инструментов ^1,2. Эти стратегии могут хорошо отражать бактериальную колонизацию in situ³, но они не так точны, как традиционные методы подсчета планшетов при количественной оценке. Кроме того, из-за ограничения отображения под микроскопом только частичных корневых зон, иногда на него может влиять субъективная систематическая ошибка.

Здесь мы опишем количественный метод, который включает в себя сбор колонизированных бактериальных клеток и подсчет бактериальных КОЕ на планшете. Этот метод основан на разбавлении и покрытии, с помощью которых можно подсчитать колонизированные штаммы, которые были удалены из корней растений, и можно вычислить общее количество колонизированных бактерий на корне ^4,5.

Сначала A. thaliana культивировали в гидропонных условиях, а затем бактериальные клетки инокулировали в ризосферу в конечной концентрации 0,01 OD₆₀₀. Инфицированные корневые ткани собирали через 2 дня после инокуляции и промывали в стерильной воде для удаления неколонизированных бактериальных клеток. Далее бактериальные клетки, колонизированные на корню, собирали, разбавляли в буфере с фосфатно-солевым буфером (PBS) и помещали на агаровую среду Лурии-Бертани (LB). После инкубации при 37 °С в течение 10 ч подсчитывали и нормализовали единичные колонии на ЛБ-планшетах для определения бактериальных клеток, колонизированных на корнях.

Этот метод очень применим, имеет хорошую повторяемость и больше подходит для точного определения ризосферной колонизации бактерий.

1. Стерильное гидропонное выращивание A. thaliana

1. Подготовьте рассаду A. thaliana .
   1. Приготовьте проросток культуры A. thaliana в среде, которая состоит из 1/2 среды МС (Мурасиге и Скуг) с 2% (масс./об.) сахарозы и 0,9% (масс./об.) агара.
   2. Подготовленную стерилизационную среду вылить в стерильные квадратные чашки Петри (13 см х 13 см) до застывания. Избегайте сушки воздуха для поддержания влажности.
   3. Погрузите семена A. thaliana в микроцентрифужную пробирку объемом 2 мл, заполненную 1 мл стерильной воды при температуре 4 °C, на более чем 12 ч, а затем стерилизуйте семена 1 мл 2% (об/об.) NaClO в течение 2 мин.
   4. Тщательно промойте семена стерильной водой шесть раз, чтобы удалить раствор NaClO. Высевают семена на чашки Петри средой МС агар со стерильным кончиком 1 мл.
   5. Заклейте чашки Петри дышащим медицинским скотчем и поместите их вертикально в легкий инкубатор для выращивания в течение 1 недели. Установите соотношение светового дня и ночи в инкубаторе на 16 ч/8 ч, поддерживайте температуру 23 °C и влажность 40%-60%.
2. Пересадка A. thaliana.
   1. Вырежьте отверстия 5 мм на 40 μм для окрашивания клеток размером поры и стерилизуйте их.
   2. Пересадите три 7-дневных растения A. thaliana через отверстия клеточного ситечка и поместите их в 6-луночный планшет, содержащий 3 мл стерильной жидкой среды 1/2 MS с 0,5% сахарозой.
   3. Поместите 6-луночные планшеты в легкий инкубатор (рисунок 1A) и инкубируйте в течение 10 дней.

2. Культивирование и инокуляция бактерий

1. Приготовьте бактериальную суспензию для посева.
   1. Для Bacillus velezensis инокулируют бактериальные клетки в стерильную среду LB и инкубируют при 37 °C с встряхиванием при 170 об/мин до достижения наружного диаметра₆₀₀ 0,8-1,2.
   2. Соберите бактериальные клетки центрифугированием при 6000 x g в течение 2 мин и ресуспендируйте клетки в PBS-буфере (2 мМ KH₂PO₄, 8 мМ Na₂HPO₄, 136 мМ NaCl, 2,6 мМ KCl). Повторите этапы центрифугирования и ресуспендирования 3 раза, чтобы удалить среду LB и бактериальные метаболиты.
   3. Суспендировать клетки бактерий в свежей среде с 1/2 МС при конечной концентрации наружного диаметра₆₀₀ 0,01. Инокулируйте бактериальные суспензии в 6-луночные планшеты, на которых растут саженцы A. thaliana , поместите 6-луночные планшеты в легкий инкубатор и культивируйте их в течение 2 дней.

3. Измерение бактерий, колонизированных на корнях

1. Соберите корневую ткань и наложите колонизированные клетки.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Все этапы должны проводиться в условиях гнотобиотиков
   1. Взвесьте 2 мл пробирок и запишите вес как W₀.
   2. Соберите ткани корня A. thaliana и промойте их в стерильной воде 3 раза. Поместите корень на фильтровальную бумагу, чтобы удалить лишнюю воду.
   3. Поместите корень в взвешенную микроцентрифужную пробирку, взвесьте корни вместе с пробиркой и запишите как W₁.
   4. Добавьте 1 мл PBS в каждую пробирку и закрутите пробирки в течение 8 мин на максимальной скорости.
   5. Разбавляют суспензии собранными колонизированными корнями бактериальными клетками до 1 х ^10-1-1 х ^10-4 (в зависимости от способности бактерий к колонизации). Разбавленные бактериальные суспензии распределить по планшетам, содержащим среду LB-агара, и инкубировать при 37 °С в течение 10 ч.
2. Подсчитайте колонии и нормализуйте данные.
   1. Подсчитайте колонии бактерий на LB-планшетах.
   2. Рассчитайте КОЕ в соответствии с соответствующим разбавлением и нормализуйте данные по сырой массе корня (W_{1-W 0}). Окончательные результаты показывают количество колонизированных бактериальных клеток на грамм корня через 2 дня после инокуляции (рис. 1B).

Чтобы проверить точность способности бактерий к колонизации, обнаруженной этим методом в ризосфере A. thaliana, мы инокулировали Bacillus velezensis SQR9 WT и полученный мутантный Δ8mcp в ризосферу A. thaliana отдельно. Δ8mcp является мутантом, в котором отсутствуют все гены, кодирующие хеморецепторы, и у него значительно снижена колонизация6. Мы измерили их колонизацию через 2 дня после инокуляции с помощью настоящего анализа колонизации корня. Результаты показали значительное снижение колонизации корней Δ8mcp, что указывает на то, что это условие и метод эффективно измеряют колонизацию бактерий (рис. 1C).

Рисунок 1: Выращивание A. thaliana и колонизация корней Bacillus velezensis SQR9 и Δ8mcp. (A) Вид сверху на 7-дневную A. thaliana, растущую в 6-луночных планшетах с клеточным красителем в гидропонном состоянии. (B) Вид сбоку на 7-дневную A. thaliana, растущую в 6-луночных планшетах, каждая лунка содержит 3 сеянца. (C) Колонизация B. velezensis дикого типа SQR9 и Δ8mcp , измеренная с помощью представленного анализа. Было включено шесть повторений, и данные представлены в виде среднего значения ± SEM. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Авторы заявляют, что у них нет конфликта интересов с содержанием этой статьи.