Method Article

Оценка структурной чувствительности внутренне неупорядоченных участков в ответ на гиперосмотический стресс в живых клетках с помощью FRET

DOI:

10.3791/66275

⸱

January 12th, 2024

 ,  , 
1Departamento de Bioquímica, Facultad de Química, Universidad Nacional Autónoma de México

* These authors contributed equally

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Внутренне неупорядоченные области (IDR) представляют собой гибкие белковые домены, которые изменяют свою конформацию в ответ на изменения окружающей среды. Ансамблевый флуоресцентный резонансный перенос энергии (FRET) позволяет оценивать размеры белка в различных условиях. Мы представляем подход FRET для оценки структурной чувствительности РДЭ в живых клетках Saccharomyces cerevisiae в условиях гиперосмотического стресса.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Внутренне неупорядоченные области (IDR) — это белковые домены, которые участвуют в важнейших клеточных процессах. В стрессовых условиях изменяются физико-химические свойства клеточной среды, что напрямую влияет на конформационный ансамбль РДЭ. РДЭ по своей природе чувствительны к возмущениям окружающей среды. Изучение того, как физико-химические свойства клетки регулируют конформационный ансамбль РДЭ, имеет важное значение для понимания экологического контроля их функции. В данной статье мы опишем пошаговый метод измерения структурной чувствительности РДЭ в живых клетках Saccharomyces cerevisiae в ответ на гиперосмотические стрессовые условия. Мы представляем использование ансамбля флуоресцентного резонансного переноса энергии (FRET) для оценки того, как изменяются глобальные размеры РДЭ при прогрессирующем увеличении гиперосмотического стресса, наложенного на клетки с любым осмолитом. Кроме того, мы предоставляем скрипт для обработки флуоресцентных измерений и сравнения структурной чувствительности для разных РДЭ. Следуя этому методу, исследователи могут получить ценную информацию о конформационных изменениях, которые претерпевают IDR в сложной внутриклеточной среде при изменении окружающей среды.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Внутренне неупорядоченные области (РДЭ) являются важнейшими компонентами клеточных процессов1. В сочетании со структурированными доменами IDR имеют важное значение для белковых функций. Аминокислотный состав РДЭ смещен, представлен в основном заряженными, гидрофильными и мелкими остатками. Из-за этого свойства IDR считаются доменами низкой сложности 2,3. Многочисленные РДЭ привлекли к себе внимание, в первую очередь потому, что эти регионы играют решающую роль в патологических состояниях, особенно нейродегенеративных заболеваниях. Такие заболевания характеризуются самосборкой и последующим внеклеточным или внутриклеточным отложением РДЭ в нейронах4. Примерами таких РДЭ являются амилоид-β (Aβ) при болезни Альцгеймера, гентингтин (HTT) при болезни Хантингтона, а также TAR-ДНК-связывающий белок-43 (TDP-43) и слитый при саркоме (FUS) при боковом амиотрофическом склерозе и лобно-височной деменции4. Изучение структурных перестроек РДЭ в контексте заболевания было значительно расширено спектроскопическими методами, в том числе флуоресцентно-резонансным переносом энергии (FRET).

Гидрофильная и расширенная природа РДЭ делает их чрезвычайно чувствительными к изменениям физико-химических свойств растворной среды5. Степень, в которой конформационный ансамбль РДЭ модифицируется окружающей средой, называется структурной чувствительностью 5,6,7. Для изучения конформации и динамики РДЭ можно использовать различные методы, включая круговой дихроизм (КД) и малоугловое рассеяние рентгеновского излучения (SAXS)8,9. К сожалению, CD и SAXS требуют большого количества очищенных белков, поэтому они не подходят для исследований в клетках. В отличие от этого, FRET представляет собой метод, который измеряет интенсивность флуоресценции двух флуоресцентных молекул, которые специфически маркируют одну IDR, что означает, что их можно контролировать в сложных смесях, таких как живые клетки10. Динамическое измерение структурной чувствительности РДЭ в живых клетках необходимо для понимания того, как окружающая среда регулирует конформацию и функцию неупорядоченного протеома.

FRET является мощным методом количественной оценки структурной чувствительности IDR, а также глобулярных и мультидоменных белков в живых клетках. Для этого метода требуется конструкция, состоящая из интересующего IDR, зажатого между двумя флуоресцентными белками (FP), известных как пара FRET. Для этого протокола мы предлагаем использовать mCerulean3 в качестве донорного FP и Citrine в качестве акцепторного FP из-за их большого динамического диапазона по сравнению с другими FP, о которых сообщалось в предыдущем исследовании чувствительности IDR6. Ранее FRET использовался для измерения структурной чувствительности РДК растений в различных клеточных контекстах6. Кроме того, этот метод был использован для характеристики общих размеров белка IDR различными исследовательскими группами как in vitro, так и in vivo 5,11.

В данной работе мы описываем метод ансамбля FRET для изучения структурной чувствительности РДЭ в клетках живых дрожжей (Saccharomyces cerevisiae). Мы показываем репрезентативные результаты, основанные на РДЭ растений под названием AtLEA4-5. AtLEA4-5 неупорядочен в растворе, но сворачивается в α-спираль, когда макромолекулярная скученность индуцируется in vitro12. AtLEA4-5 является хорошей эталонной моделью для этого метода, поскольку он относительно мал (158 остатков), неупорядочен и чувствителен к возмущениям окружающей среды, о чем сообщалось in silico и in vitro 6,12. Представленный здесь метод может быть масштабирован для высокопроизводительных подходов, поскольку дрожжевые клетки легко выращивать, а обработка применяется в небольших объемах. Кроме того, небольшие модификации протокола могут быть применены к другим клеточным системам, таким как бактерии и растительные клетки6. Протокол может быть выполнен в любой молекулярно-биологической лаборатории, имеющей доступ к микропланшетному ридеру с режимом флуоресценции, оборудованию, имеющемуся в большинстве научно-исследовательских учреждений.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Плазмидная конструкция

  1. С помощью полимеразной цепной реакции (ПЦР) усилите открытую рамку считывания (ORF), которая кодирует желаемый IDR. Не включайте стоп-кодон, так как ORF будет окружен генами, кодирующими флуоресцентные белки. Для усиления разработайте праймеры с сайтами ограничения SacI (5') и BglII (3').
    ПРИМЕЧАНИЕ: Для раздела репрезентативных результатов мы использовали AtLEA4-5 в качестве выбранного IDR. Мы амплифицировали КИН AtLEA4-5 из плазмиды pTrc99A-AtLEA4-512.
  2. Расщепление продукта ПЦР ORF путем последовательного ограничения ферментами SacI и BglII13.
  3. Получение коммерческой плазмиды pDRFLIP38-AtLEA4-5 (#178189) из Addgene (https://www.addgene.org/178189/).
  4. Проводят последовательное ограничение с использованием ферментов SacI и BglII для удаления ORF AtLEA4-5 из плазмиды pDRFLIP38-AtLEA4-5, оставляя открытую плазмиду, содержащую пару FRET13.
  5. Очищают расщепленные фрагменты ДНК с помощью гелевого восстановления из электрофореза в агарозном геле14. Лигируют ограниченные фрагменты с помощью ДНК-лигазы15.
  6. Трансформируют реакцию клонирования в компетентные клетки Escherichia coli (DH5α или родственные штаммы) и отбирают в планшетах Лурии-Бертани (LB), содержащих 50 мкг/мл ампициллина16. Выращивайте в течение ночи (ON) при 37 °C.
  7. Изолируйте и вырастите не менее пяти трансформированных колоний в новой пластине и генотипе с помощью ПЦР17. Очищают плазмидную ДНК от положительно трансформированной колонии с помощью стандартных методов miniprep18.
  8. Проверяют экстракцию и целостность плазмидной ДНК с помощью электрофореза в агарозном геле19. Проверьте правильность клонирования конструкции с помощью секвенирования по Сэнгеру20.

2. Экспрессия плазмид в клетках дрожжей

ПРИМЕЧАНИЕ: Используйте стандартные асептические методы для выполнения следующих шагов. Используйте культуральный ламинарный колпак или зажигалку.

  1. Инокуляцию штамма S. cerevisiae BJ5465 (ATCC: 208289) в 3 мл среды дрожжевой пептон-декстрозы (YPD) и выращивают при 30 °C и 200 об/мин.
    ПРИМЕЧАНИЕ: BJ5465 - это штамм с дефицитом протеазы (CH1), рекомендованный для работы с IDR. Другие штаммы S. cerevisiae могут быть протестированы и использованы.
  2. Центрифуга 1 мл ночной насыщенной (OD600 ~ 3-4) культуры дрожжей при 14 000 x g в течение 1 мин. Осторожно удалите надосадочную жидкость пипетированием.
  3. Повторно суспендируйте гранулу в 1 мл буфера Tris-EDTA (TE) (pH 7,5), осторожно щелкнув пробиркой. Центрифугу при 14 000 x g в течение 1 мин и осторожно удалите надосадочную жидкость.
  4. Ресуспендант гранулы в 500 мкл буфера Lazy Bones (40% с ПЭГ 3,350; 100 мМ ацетата лития; 10 мМ Tris-HCl; 1 мМ ЭДТА; pH 7,5) путем пипетирования. Добавьте 25 мкл кипяченой (100 °C в течение 5 мин с последующим охлаждением на льду в течение 5 мин) ДНК сперматозоидов лосося (2 мг/мл) к ресуспендированным дрожжевым клеткам.
  5. Добавьте в смесь 100 нг плазмидной ДНК и перемешайте смесь в течение 1 минуты, чтобы обеспечить тщательное перемешивание. Дайте смеси постоять при комнатной температуре в течение 1-2 часов.
  6. Дрожжевая смесь нагревается при температуре 42 °C в течение 12 минут, затем охлаждается на льду еще 12 минут. Центрифугируют пробирку при 14 000 x g в течение 1 мин и осторожно удаляют надосадочную жидкость.
  7. Ресуспендируйте гранулу в 1 мл буфера TE (pH 7,5). Планшет 100 мкл трансформированных клеток на дрожжевой синтетической отсеточной среде без урацила (SD-ura) с добавлением 15 г/л агара.
  8. Инкубируют планшеты при 30 °C в течение 2-3 дней (рисунок 1). Процедите не менее пяти дрожжевых трансформантов в новую пластину и выращивайте дальше.

3. Валидация дрожжевых трансформантов

  1. Выберите небольшую порцию каждого кандидата-трансформанта, осторожно соскабливая и ресуспендируя в 5 мкл 20 мМ NaOH в отдельные пробирки для ПЦР.
  2. Нагрейте образец до 99 °C в течение 10 минут в амплификаторе, чтобы лизировать клетки и выпустить ДНК в раствор. Этот шаг имеет решающее значение для подготовки матрицы ДНК для ПЦР.
  3. Переносят 1 мкл кипяченого образца в отдельную реакционную смесь ПЦР, содержащую соответствующие праймеры и ПЦР-реагенты для генотипирования. Мы использовали следующие праймеры: Форвардный праймер: 5'-AAATATACCCCCCCCTCGATCTAGA-3'. Обратная капсюль: 5'-GTAATACGACTCACTATAGGGCG-3'.
  4. Настройте реакцию ПЦР и подтвердите наличие правильной плазмиды с помощью электрофореза в агарозном геле. Выберите один трансформатор для дальнейших экспериментов.

4. Подготовка культуры дрожжевых клеток к FRET анализу

  1. Высейте полоску выбранного дрожжевого трансформанта в 3 мл жидкой среды 1x SD-Ura.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Выполняйте эту процедуру в ламинарном вытяжном шкафу и стерильном материале.
  2. Выращивать при температуре 30 °C, 200 об/мин не менее 12 часов до насыщения. Измерьте наружный диаметр600. Рост должен находиться в пределахOD 600 = 1.0-2.0.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Если OD600 ниже 1,0, дайте клеткам больше времени для инкубации. Если наружный диаметр600 превышает 2,0, не продолжайте и перезапустите с шага 4.1.

5. Подготовка дрожжевых клеток к анализу FRET

  1. Соберите 2 мл ночной дрожжевой культуры и центрифугируйте при 14 000 x g при комнатной температуре. Осторожно удалите надосадочную жидкость пипетированием.
  2. Ресуспендируйте гранулу в 1 мл буфера 50 мМ 2 (N-морфолино) этансульфоновой кислоты (MES) (pH 6).
  3. Центрифуга при 14 000 x g при комнатной температуре. Удалите надосадочную жидкость.
  4. Повторите шаги 5.2 и 5.3. Дрожжевые клетки ресуспендировать в 2 мл буфера MES, рН 6 и перелить объем в резервуар с реагентом.

6. Настройка флуоресцентных измерений

ПРИМЕЧАНИЕ: Данное сканирование считается выполненным в микропланшетном ридере с режимом флуоресценции.

  1. Для основных настроек установите прибор следующим образом: Тип измерения: Спектр интенсивности флуоресценции (FI); Название микропластины: Greiner 96 F-bottom.
  2. Для настройки оптики установите прибор следующим образом: Нет. точек развертки длин волн: 91; Длина волны возбуждения: 433 нм; Полоса возбуждения: 10 нм; Длина волны излучения: 460 - 550; Ширина шага: 1 нм; Полоса пропускания излучения: 10 нм; Фокусная высота, полученная автофокусом; Фокусное расстояние: 5 мм; Длина волны, используемая для усиления: 490 нм.
  3. Для общих настроек установите прибор следующим образом: Время установления: 0,1 с; Направление чтения: однонаправленное, горизонтальное слева направо, сверху вниз.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Коэффициент усиления, введенный вручную, должен быть отрегулирован для каждого измерения с использованием скважины, которая, как ожидается, будет отображать самые высокие уровни интенсивности флуоресценции на протяжении всего сканирования длины волны.

7. Приготовление гипертонических растворов и флуоресцентные измерения

  1. Приготовьте растворы 0 М, 0,2 М, 0,4 М, 0,6 М, 0,8 М, 1 М, 1,5 М и 2 М NaCl в 96-луночном черном планшете с прозрачным дном. Окончательный объем в каждой лунке составит 200 мкл (150 мкл раствора осмолита + 50 мкл суспензии дрожжевых клеток).
    ПРИМЕЧАНИЕ: Другие осмолиты могут быть использованы для индуцирования гиперосмотического стресса. Все растворы должны быть приготовлены в буфере MES 50 мМ с рН 6.
  2. Загрузите 150 мкл 50 мМ буфера MES, рН 6 в первые три лунки ряда А (А1, А2, А3) и в последующие лунки добавьте 150 мкл соответствующего раствора в порядке возрастания слева направо (рисунок 2). Чтобы проверить все предложенные концентрации, продолжайте загрузку в ряду B.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Эта настройка учитывает измерения 3 технических повторов для каждой концентрации.
  3. С помощью 12-канальной микропипетки перенесите 50 мкл промытых дрожжевых клеток в каждую лунку. Дрожжевые клетки имеют свойство оседать на дно водоема. Обязательно тщательно ресуспендируйте дрожжевую суспензию, пипетируя вверх и вниз перед переносом клеток.
  4. Поместите тензодатчики в 96-луночную пластину, содержащую различные растворы, и хорошо перемешайте, пипетируя вверх и вниз не менее 4 раз.
  5. Немедленно измерьте спектры интенсивности излучения флуоресценции для желаемых лунок в микропланшетном считывателе с настройками спецификации шага 6. Повторите процедуру для каждого IDR, который будет проверяться в анализе FRET.
  6. Необязательный шаг. Если возможно, измерьте конструкцию, предназначенную только для доноров (pDRFLIP38-mCerulean3), выполнив действия, описанные здесь.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Мы рекомендуем выполнить этот шаг, чтобы рассчитать эффективность FRET для каждого условия. Если считыватель не может выполнить этот шаг, FRET можно рассчитать с помощью метода коэффициента FRET. Оба метода расчета FRET описаны на шагах 8 и 9.
  7. Выполните по крайней мере три репликации в течение трех независимых дней для каждой конструкции.

8. Обработка данных по методу эффективности FRET

ПРИМЕЧАНИЕ: Для читателей, знакомых с языком программирования R, мы предоставляем набор скриптов R для обработки данных, описанных в этом разделе. Скрипты можно найти на https://github.com/Kaz-bits/cuevaslab-procotols/tree/main/FRET. Следуйте инструкциям в файле README.

  1. Экспортируйте данные в виде .xlsx файлов из считывателя микропланшетов.
  2. Нормализовать значения интенсивности флуоресценции на каждой длине волны сканирования до изобестовой точки используемой пары FRET.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Этот шаг необходим для сравнения спектров всех тестируемых условий. Изобестическая точка пары mCerulean3 и Citrine FRET составляет 515 нм. Например, получить отношение значений интенсивности флуоресценции 460 нм/515 нм, 461 нм/515 нм, 462 нм/515 нм и так далее.
  3. Вычислите среднее значение для каждой технической репликации после нормализации значений флуоресценции. Всего для каждого состояния гиперосмотического стресса должна быть своя колонка.
  4. Визуализируйте все спектры интенсивности флуоресценции на одном графике (рис. 3). Каждый спектр должен отображать комбинацию спектров флуоресцентного излучения отдельных mCerulean3 и Citrine. В редких случаях, когда эффективность FRET равна 0, будет наблюдаться только спектр излучения флуоресценции донора, или, когда эффективность FRET равна 1, будет наблюдаться только флуоресценция акцептора. Пик флуоресцентного излучения для mCerulean3 (донор) составляет 475 нм, а пик флуоресцентного излучения для Citrine (акцептор) — 525 нм.
  5. Определите, показывает ли измерение флуоресценции типичное изменение FRET в ответ на гиперосмотическое напряжение. Если конформация IDR чувствительна к лечению, это отразится как изменение эффективности FRET. Типичное изменение эффективности FRET связано со снижением интенсивности флуоресценции донора с увеличением интенсивности флуоресценции акцептора или наоборот.
  6. Количественная оценка эффективности FRET (EFRET). Получить нормализованные пиковые значения донора (mCerulean3) (475 нм/515 нм) для конструкции IDR и конструкции только для донора для каждого состояния гиперосмотического стресса. Используйте средние нормализованные пиковые значения технических репликаций. Выполните эту операцию для каждой из трех независимых репликаций. Рассчитайте EFRET по следующей формуле:
    figure-protocol-1
    Где IDA — отношение 475 нм/515 нм от конструкции IDR (конструкция пары FRET), а ID — отношение 475 нм/515 нм от конструкции только для доноров.
  7. Сравните эффективность FRET. Нормализуйте значения EFRET каждого гиперосмотического стрессового состояния к EFRET нестрессового состояния (например, 0 M NaCl). Проводите сравнения с помощью ящичковой диаграммы или графика с гладкой кривой. Выполните односторонний ANOVA с последующим статистическим тестом Тьюки post hoc (p-значения: *p < 0,05, **p < 0,01, ***p < 0,001, ****p < 0,0001).

9. Обработка данных методом коэффициента FRET

ПРИМЕЧАНИЕ: Если измерения только с помощью доноров не могут быть получены, выполните метод коэффициента FRET. Этот метод сравнивает соотношение FRET в различных условиях гиперосмотического стресса. Шаги с 7.1 по 7.5 должны быть выполнены перед шагами этого раздела, чтобы проверить типичное поведение FRET. Для читателей, знакомых с языком программирования R, мы предоставляем набор скриптов R для выполнения обработки данных, описанных в этом разделе. Скрипты можно найти на https://github.com/Kaz-bits/cuevaslab-procotols/tree/main/FRET. Следуйте инструкциям в файле README.

  1. Извлечение данных на длинах волн 475 нм и 525 нм из файла xlsx, ранее экспортированного из считывателя микропланшетов. Эти значения соответствуют пику флуоресцентного излучения для mCerulean3 (донор, DxDm) и пику флуоресцентного излучения для цитрина (акцептор, DxAm) при возбуждении донорного флуорофора (433 нм).
  2. Нормализовать значения интенсивности флуоресценции на длинах волны 475 нм и 525 нм до изобестовой точки используемой пары FRET. Изобестическая точка пары mCerulean3 и Citrine FRET составляет 515 нм. Получаем соотношение FRET (DxAm/DxDm).
  3. Сравните коэффициенты FRET. Нормализуйте значения DxAm/DxDm для каждого гиперосмотического стрессового состояния к среднему значению DxAm/DxDm для нестрессового состояния (например, 0 M NaCl). Проведите сравнение, используя ящичковую диаграмму или график плавной кривой (рис. 4 и рис. 5). Выполните односторонний анализ дисперсии с последующим статистическим тестом Тьюки post hoc (p-значения: *p < 0,05, **p < 0,01, ***p < 0,001, ****p < 0,0001).

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

После трансформации дрожжевых клеток плазмидой pDRFLIP38-AtLEA4-5 наблюдалась флуоресценция положительных трансформантов с помощью трансиллюминатора синего света и фильтра (рис. 1). Приготовление различных растворов для индуцирования гиперосмотического стресса занимает много времени, поэтому мы предлагаем следовать 96-луночному шаблону, показанному на рисунке 2. Сразу после обработки гиперосмотического стресса различными концентрациями хлорида натрия были получены спектры флуоресцентного излучения (рис. 3). Спектры флуоресцентного излучения каждого состояния были получены для валидации типичного поведения изменения FRET. Для исправления экспериментальных ошибок требуется нормализация значений интенсивности флуоресценции до изобестовой точки. Для получения этих репрезентативных результатов мы протестировали ранее зарегистрированный AtLEA4-5, который является высокочувствительным растением IDR6. В качестве ориентира мы также протестировали слегка нечувствительный глобулярный белок АДФ (рис. 3). Можно заметить, что обе конструкции демонстрируют комбинацию эмиссионных спектров mCerulean3 и Citrine (пики для донорного и акцепторного FP), что указывает на некоторую степень базальной эффективности FRET в стандартных условиях (0 M NaCl). Для AtLEA4-5 гиперосмотический стресс вызывал увеличение интенсивности флуоресценции акцептора в сочетании со снижением интенсивности флуоресценции донора, что свидетельствует о гиперосмотическом стресс-индуцированном уплотнении IDR (рис. 3A). При АД эта тенденция не наблюдалась (рис. 3Б). Чтобы количественно оценить различия в структурной чувствительности при различных методах лечения гиперосмотического стресса, мы построили график соотношения FRET (DxAm/DxDm) для каждого состояния и выполнили односторонний статистический тест ANOVA (рис. 4). Наконец, мы сравнили структурную чувствительность AtLE4-5 и ABP. Мы заметили, что AtLEA4-5 обладает значительно более высокой чувствительностью, чем АДФ (рис. 5).

figure-results-1
Рисунок 1: Флуоресцентное излучение трансформантов S. cerevisiae . SD-ura чашка Петри, покрытая S. cerevisiae, преобразованная плазмидой pDRFLIP38-AtLEA4-5. Флуоресценцию наблюдали с помощью трансиллюминатора синего света и оранжевого фильтра. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этого рисунка.

figure-results-2
Рисунок 2: 96-луночный шаблон планшета для системы FRET. В последовательных скважинах размещаются три технические реплики для каждого состояния гиперосмотического напряжения. Первые две строки (A и B) удовлетворяют восьми условиям для одной конструкции (IDR1). В следующих строках могут размещаться новые конструкции (IDR2, IDR3 и т. д.). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этого рисунка.

figure-results-3
Рисунок 3: Нормированные спектры флуоресцентного излучения при различных условиях гиперосмотического стресса. Спектры подтвердили типичное поведение FRET в ответ на лечение гиперосмотическим стрессом (NaCl). (A) AtLEA4-5, высокочувствительный РДЭ. Увеличение интенсивности флуоресценции акцептора сопряжено со снижением интенсивности флуоресценции донора. (B) АДФ, слегка нечувствительный шаровидный белок. Пики наблюдаются на длинах волн 475 нм и 525 нм по паре FRET mCerulean3 и Citrine. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этого рисунка.

figure-results-4
Рисунок 4: Количественная оценка структурной чувствительности в различных условиях гиперосмотического стресса. Нормализованное соотношение FRET (DxAm/DxDm) живых дрожжевых клеток, обработанных различными концентрациями NaCl. (А) AtLEA4-5. (B) Арабиноза-связывающий белок (ABP). n = 9 независимых измерений. Односторонняя ANOVA. Н.С.: Несущественно. p-значения: *p < 0,05, **p < 0,01, ***p < 0,001, ****p< 0,0001. Прямоугольники представляют 25-75-й процентиль (линия на медиане). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этого рисунка.

figure-results-5
Рисунок 5: Сравнение структурной чувствительности AtLEA4-5 и ABP. (A) Нормализованное отношение FRET (DXAM/DxDm) при различных условиях гиперосмотического напряжения для AtLEA4-5 и ABP. n = 3 независимых измерения. (B) Значение Delta FRET (1,5 M - 0 M NaCl) для AtLEA4-5 и ABP. Изменение выражается в виде структурной чувствительности конструкций, измеренной в системе FRET при 1,5 M NaCl. n = 3 независимых измерения. Среднее значение ± SD. Двусторонний ANOVA с использованием следующих p-значений: *p < 0,05, **p < 0,01, ***p < 0,001, ****p< 0,0001. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этого рисунка.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Представленный здесь метод позволяет получить представление о том, как глобальные измерения ансамбля РДЭ воспринимают и реагируют на возмущения окружающей среды. Этот метод основан на генетически закодированной конструкции и не требует никаких дополнительных компонентов, кроме стабильной экспрессии плазмиды в дрожжевых клетках, что делает его адаптируемым для потенциального применения в других типах клеток. Кроме того, он универсален для изучения других физико-химических возмущений, которые эукариотические клетки испытывают в течение своегожизненного цикла. Разрешающая способность FRET заметна, при этом перенос энергии происходит только в пределах длины волны менее 10 нм между донорным и акцепторным ФП. Однако основным ограничением является отсутствие точной структурной информации, которую невозможно получить с помощью ансамблевого метода FRET.

Присущая РДЭ гетерогенность и гибкость создают проблемы при изучении их ансамбля в клеточном контексте, что делает такие методы, как рентгеновская кристаллография, непрактичными. ЯМР рассматривался для изучения неупорядоченных белков в клетках, но изменение условий может быть проблемой из-за интерференции сигнала22. Применение метода FRET для изучения конформационных ансамблей IDR открывает уникальные возможности, позволяющие картировать распределение популяций в живых клетках. Кроме того, он может быть дополнен методами in vitro, такими как одномолекулярный FRET (smFRET), демонстрируя его адаптивность к различным подходам и условиям эксперимента23. Этот протокол использует mCerulean3 в качестве донора FP и Citrine в качестве акцепторного FP, обеспечивая простую и легкую для отслеживания систему. При выборе пар FRET необходимо тщательно учитывать спектральное перекрытие, чтобы смягчить перекрестные помехи между сигналами24,25. При регистрации изменений структурной чувствительности с помощью этого метода выбор соответствующего показателя FRET, такого как эффективность FRET (EFRET), имеет решающее значение для надежной интерпретации сигнала. В качестве альтернативы структурную чувствительность можно проанализировать и сравнить с помощью коэффициента FRET (DXAM/DxDm), но это требует тщательной коррекции перекрестных помех флуоресценции донор-акцептор25. На интерпретацию флуоресцентных данных, полученных с помощью микропланшетных ридеров, могут влиять различные факторы, включая свойства флуорофоров, ориентацию диполя, межмолекулярные и интрамолекулярные системы FRET, подготовку образцов и анализ данных25.

Межмолекулярный метод FRET является основным ограничением ансамблевого метода FRET, поскольку его невозможно исключить из первоначального анализа данных. Это представляет собой важное соображение для читателя, поскольку известно, что некоторые РДЭ рекрутируются в биомолекулярные конденсаты26,27. Локальная концентрация макромолекул в биомолекулярных конденсатах высока, что может индуцировать межмолекулярные взаимодействия и, таким образом, влиять на показания FRET. Для AtLEA4-5 было показано, что он самоорганизуется в дискретные точечные структуры при гиперосмотической нагрузке в дрожжевых клетках6. Чтобы исключить эффект межмолекулярного ФРЭ, авторы инкубировали клетки с 1,6-гександиолом (1,6-HD), молекулой, которая разрушает биомолекулярные конденсаты. Обработка 1,6-HD растворяла конденсаты AtLEA4-5, но уровни FRET не снижались, что указывает на то, что конденсация белка не вызывает нежелательных межмолекулярных FRET. Поскольку этот эффект будет зависеть от каждого IDR, читатели должны использовать дополнительные подходы, такие как акцепторное фотообесцвечивание или совместное выражение конструктов только для доноров и только для акцепторов6. Тем не менее, информация, полученная с помощью ансамбля FRET в живых клетках, имеет важное значение для характеристики структурной чувствительности РДЭ.

Сложный аспект протокола, представленного здесь, заключается в том, что он использует организм, который демонстрирует ответное поведение на гиперосмотический стресс. В присутствии высоких внешних концентраций хлорида натрия вода покидает клетку, увеличивая концентрацию общего белка и создавая скученную среду28. РДЭ чувствительны к изменениям скученности макромолекул 5,6,11,12. В частности, AtLEA4-5, белок, используемый в качестве модели в этом протоколе, был чувствителен к различным молекулярно-массовым краудерам, но не к высоким концентрациям солей или глицерина in vitro6. Поскольку накопление глицерина важно для ответа и акклиматизации дрожжевых клеток к гиперосмотичному стрессу29, уместно подчеркнуть, что основной вклад в уплотнение AtLEA4-5 вносит макромолекулярная скученность во время ранних событий осмо-чувствительности. То, как изменяется структура AtLEA4-5 на последующих стадиях акклиматизации, когда накапливается глицерин, требует дальнейшего изучения.

Изучение конформационной динамики в неупорядоченных белках включает в себя целый ряд методов. В этом контексте FRET является ключевым методом. В зависимости от конкретных исследовательских запросов и рассматриваемых особенностей, исследователи могут использовать ЯМР-спектроскопию in vivo для характеристики IDR30. Кроме того, smFRET является ценным инструментом для исследований in vivo 23. Спектроскопия электронного парамагнитного резонанса (ЭПР) является еще одним методом, используемым для количественного изучения РДЭ в клеточном контексте31. Методы, основанные на масс-спектрометрии, также являются мощными подходами, поскольку они могут предоставить структурную информацию о клеточной конформации белков32. К таким методам относятся нативная масс-спектрометрия (нативная МС) и масс-спектрометрия ионной подвижности (ИМ-МС)32,33. Все эти методы позволяют исследователям углубиться в многочисленные конформации IDR и его динамику, проливая свет на их вклад в клеточную биологию. Протокол, описанный в данной работе, может быть использован для проведения первичного скрининга структурной чувствительности с высокой пропускной способностью. Последующие исследования могут быть сосредоточены на проверке структурной чувствительности в желаемом типе клеток или с возможностью получения механистического понимания с помощью методов in vitro, таких как smFRET, CD или SAXS. Комбинация методов необходима для получения четкой картины структурной чувствительности РДК в изменяющихся средах клеток.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Благодарим сотрудников лаборатории Куэваса-Веласкеса за критическое рецензирование рукописи. Эта работа была поддержана Programa de Apoyo a Proyectos de Investigación e Innovación Tecnológica, Dirección General de Asuntos del Personal Académico, Universidad Nacional Autónoma de México (UNAM-PAPIIT), проект No IA203422; Consejo Nacional de Humanidades, Ciencias y Tecnología (CONAHCYT), проект номер 252952; и Programa de Apoyo a la Investigación y el Posgrado, Facultad de Química, Universidad Nacional Autónoma de México, Grant 5000-9182. CET (CVU 1083636) и CAPD (CVU 1269643) благодарят CONAHCYT за стипендию M.Sc.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
96-луночный планшетGreiner Bio-One655096
АгарSigma-Aldrich5040
BglIINew England BioLabsR0144S
BJ5465 клеткиAmerican Type Culture Collection208289
Buffer MES 50 mMSigma-AldrichM8250
Buffer Tris-HCl 10 mMInvitrogen
EDTA 1 мМMerck108452
Falcon ПробиркиCorning352057
LB Фильтрующий материалSigma-AldrichL2897
Ацетат лития 0,1 MSigma-AldrichL6883
Низкоплавкий агарозныйфильтр GOLDBIOA-204-25
Микроцентрифугаeppendorf5452000010
Набор MiniprepZymoPureD4210
NaOH 0.02 MMerck106462
PEG 3,350 40%Sigma-Aldrich1546547
плазмида pDRFLIP38-AtLEA4-5addgene178189
Планшетный ридерBMG LABTECHCLARIOstar Plus
SacINew England BioLabsR3156S
ДНК спермы лосося 2 мг/млThermo Fisher Scientific15632011
SD-UraSigma-AldrichY1501
Глорид натрияSigma-AldrichS9888
Taq polymesarePromegaM5123
TransiluminatorAccuris instrumentsE4000
UV-Visible спектрофотометрThermo Fisher ScientificBiomate3
YPD медиаSigma-AldrichY1500
15506017 Трубки

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Wright, P. E., Dyson, H. J. Intrinsically disordered proteins in cellular signalling and regulation. Nat Rev Mol Cell Biol. 16 (1), 18-29 (2015).
  2. Covarrubias, A. A., Romero-Pérez, P. S., Cuevas-Velazquez, C. L., Rendón-Luna, D. F. The functional diversity of structural disorder in plant proteins. Arch Biochem Biophys. 680, 108229(2019).
  3. Ahmed, S. S., et al. Characterization of intrinsically disordered regions in proteins informed by human genetic diversity. PLoS Comput Biol. 18 (3), e1009911(2022).
  4. Birol, M., Melo, A. M. Untangling the conformational polymorphism of disordered proteins associated with neurodegeneration at the single-molecule level. Front Mol Neurosci. 12, 309(2019).
  5. Moses, D., et al. Revealing the hidden sensitivity of intrinsically disordered proteins to their chemical environment. J Phys Chem Lett. 11 (23), 10131-10136 (2020).
  6. Cuevas-Velazquez, C. L., et al. Intrinsically disordered protein biosensor tracks the physical-chemical effects of osmotic stress on cells. Nat Commun. 12 (1), 5438(2021).
  7. Holehouse, A. S., Sukenik, S. Controlling structural bias in intrinsically disordered proteins using solution space scanning. J Chem Theory Comput. 16 (3), 1794-1805 (2020).
  8. Martin, E. W., Hopkins, J. B., Mittag, T. Small-angle X-ray scattering experiments of monodisperse intrinsically disordered protein samples close to the solubility limit. Methods Enzymol. 646, 185-222 (2021).
  9. Miles, A. J., Drew, E. D., Wallace, B. A. DichroIDP: a method for analyses of intrinsically disordered proteins using circular dichroism spectroscopy. Commun Biol. 6 (1), 823(2023).
  10. Kaminski, C. F., Rees, E. J., Schierle, G. S. K. A quantitative protocol for intensity-based live cell FRET imaging. Method Mol Biol. 1076, 445-454 (2014).
  11. Moses, D., et al. Structural biases in disordered proteins are prevalent in the cell. bioRxiv. , (2022).
  12. Cuevas-Velazquez, C. L., Saab-Rincón, G., Reyes, J. L., Covarrubias, A. A. The Unstructured N-terminal Region of Arabidopsis Group 4 Late Embryogenesis Abundant (LEA) Proteins Is Required for Folding and for Chaperone-like Activity under Water Deficit. J Biol Chem. 291 (20), 10893-10903 (2016).
  13. JoVE Science Education Database. Restriction enzyme digests. , JoVE. Cambridge, MA, USA. (2023).
  14. JoVE Science Education Database. Gel purification. , JoVE. Cambridge, MA, USA. (2023).
  15. JoVE Science Education Database. DNA ligation reactions. , JoVE. Cambridge, MA, USA. (2023).
  16. JoVE Science Education Database. Bacterial transformation using heat Ssock and competent cells. , JoVE. Cambridge, MA, USA. (2023).
  17. JoVE Science Education Database. PCR: Principle, instrumentation, and applications. , JoVE. Cambridge, MA, USA. (2023).
  18. JoVE Science Education Database. Plasmid purification. , JoVE. Cambridge, MA, USA. (2023).
  19. JoVE Science Education Database. DNA gel electrophoresis. , JoVE. Cambridge, MA, USA. (2023).
  20. JoVE Core Molecular Biology. Sanger/chain termination sequencing using dideoxynucleotides - Concept. , Available from: https://app.jove.com/science-education/v/12020/sanger-sequencing (2023).
  21. Theillet, F. X., et al. Physicochemical properties of cells and their effects on intrinsically disordered proteins (IDPs). Chem Rev. 114 (13), 6661-6714 (2014).
  22. Brutscher, B., et al. NMR methods for the study of instrinsically disordered proteins structure, dynamics, and interactions: General overview and practical guidelines. Adv Exp Med Biol. 870, 49-122 (2015).
  23. Metskas, L. A., Rhoades, E. Single-molecule FRET of intrinsically disordered proteins. Annu Rev Phys Chem. 71, 391-414 (2020).
  24. Roebroek, T., et al. Simultaneous readout of multiple FRET pairs using photochromism. Nat Commun. 12 (1), 2005(2021).
  25. Algar, W. R., Hildebrandt, N., Vogel, S. S., Medintz, I. L. FRET as a biomolecular research tool - understanding its potential while avoiding pitfalls. Nat Methods. 16 (9), 815-829 (2019).
  26. Lyon, A. S., Peeples, W. B., Rosen, M. K. A framework for understanding the functions of biomolecular condensates across scales. Nat Rev Mol Cell Biol. 22 (3), 215-235 (2021).
  27. Belott, C., Janis, B., Menze, M. A. Liquid-liquid phase separation promotes animal desiccation tolerance. Proc Natl Acad Sci U S A. 117 (44), 27676-27684 (2020).
  28. Miermont, A., et al. Severe osmotic compression triggers a slowdown of intracellular signaling, which can be explained by molecular crowding. Proc Natl Acad Sci U S A. 110 (14), 5725-5730 (2013).
  29. Saito, H., Posas, F. Response to hyperosmotic stress. Genetics. 192 (2), 289-318 (2012).
  30. Selenko, P., Wagner, G. Looking into live cells with in-cell NMR spectroscopy. J Struct Biol. 158 (2), 244-253 (2007).
  31. Cattani, J., Subramaniam, V., Drescher, M. Room-temperature in-cell EPR spectroscopy: alpha-Synuclein disease variants remain intrinsically disordered in the cell. Phys Chem Chem Phys. 19 (28), 18147-18151 (2017).
  32. Beveridge, R., Chappuis, Q., Macphee, C., Barran, P. Mass spectrometry methods for intrinsically disordered proteins. Analyst. 138 (1), 32-42 (2013).
  33. Beveridge, R., et al. Ion mobility mass spectrometry uncovers the impact of the patterning of oppositely charged residues on the conformational distributions of intrinsically disordered proteins. J Am Chem Soc. 141 (12), 4908-4918 (2019).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Intrinsically Disordered RegionsStructural SensitivityHyperosmotic StressFRET MeasurementSaccharomyces CerevisiaeFluorescence IntensityProtein ConformationMicroplate ReaderOsmolyte ResponseYeast Cell Stress

Related Articles