Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.

Методическая статья

Бесшовный подход к клонированию векторов экспрессии вируса репродуктивного и респираторного синдрома свиней

1.5K просмотров

⸱

DOI:

10.3791/66320

⸱

17 мая 2024 г.

 ,  , 
1College of Life Sciences, China West Normal University, 2Sichuan Sports College, 3Pathology Department, Suining Central Hospital

* These authors contributed equally

В этой статье

Краткое содержание

В данной работе мы представляем протокол для получения вектора экспрессии pVAX1-PRRSV путем введения подходящих сайтов рестрикции на 3'-конце вставок. Мы можем линеаризовать вектор и присоединять фрагменты ДНК к вектору один за другим с помощью технологии гомологичной рекомбинации.

Аннотация

Построение векторов экспрессии генов является важной составляющей лабораторной работы в области экспериментальной биологии. Благодаря таким техническим достижениям, как сборка Gibson, векторное построение становится относительно простым и эффективным. Однако, когда полноразмерный геном вируса репродуктивного и респираторного синдрома свиней (РРСС) не может быть легко амплифицирован с помощью одной полимеразной цепной реакции (ПЦР) из кДНК или трудно получить полноразмерный вектор экспрессии генов путем гомологичной рекомбинации нескольких вставок in vitro, текущий метод сборки Gibson не достигает этой цели.

Следовательно, мы поставили перед собой цель разделить геном РРСС на несколько фрагментов и ввести соответствующие сайты рестрикции в обратный праймер для получения фрагментов, амплифицированных методом ПЦР. После присоединения предыдущего фрагмента ДНК к вектору с помощью технологии гомологичной рекомбинации новый вектор приобретал сайт расщепления фермента рестрикции. Таким образом, мы можем линеаризовать вектор, используя вновь добавленный сайт расщепления фермента, и ввести следующий фрагмент ДНК ниже по течению от вышестоящего фрагмента ДНК.

Введенный сайт расщепления фермента рестрикции на 3'-конце предшествующего фрагмента ДНК будет уничтожен, и новый сайт расщепления будет введен в 3'-конец нижестоящего фрагмента ДНК. Таким образом, мы можем присоединять фрагменты ДНК к вектору один за другим. Этот метод применим для успешного построения вектора экспрессии РРСС и является эффективным методом для сборки большого количества фрагментов в вектор экспрессии.

Введение

Молекулярное клонирование, являющееся важным методом создания основанных на ДНК экспериментальных инструментов для экспрессии экспрессии в прокариотических и эукариотических клетках, является очень важным компонентом экспериментальной биологии. Молекулярное клонирование включает в себя четыре процесса: получение ДНК вкладыша, лигирование вкладыша в соответствующий вектор, превращение рекомбинантного вектора в Escherichia coli (E. coli) и идентификацию положительныхклонов. До сих пор было использовано несколько методов соединения молекул ДНК с использованием ферментоврестрикции 2,3 и ПЦР-опосредованной рекомбинации 4,5,6. Гомологичная рекомбинация, известная как технология бесшовного клонирования, представляет собой группу методов клонирования, которые позволяют последовательно и без шрамов встраивать один или несколько фрагментов ДНК в вектор. Эта технология включает в себя клонирование, независимое от последовательности и лигирования (SLIC), экстракт бесшовного клонирования с лигированием (SLiCE), In-Fusion и сборку Gibson. Он использует экзонуклеазу для разрушения одной нити вкладыша и вектор для генерации когезивных концов, а также для репарации in vivo или рекомбинации in vitro для ковалентного соединения вкладыша с вектором путем образования фосфодиэфирных связей. Возможность присоединить одну вставку к вектору в любой последовательности без каких-либо шрамов очень привлекательна. Кроме того, технология имеет возможность соединять 5-10 фрагментов в заранее определенном порядке без ограничений по последовательности.

Являясь одним из многих методов рекомбинантной ДНК, метод сборки Гибсона, в настоящее время наиболее эффективный метод клонирования 7,8, представляет собой надежный и элегантный метод на основе экзонуклеазы для бесшовной сборки одного или нескольких линеаризованных фрагментов ДНК. Реакцию сборки Гибсона проводят в изотермических условиях с использованием смеси трех ферментов, а именно: 5'-экзонуклеазы, высокоточной полимеразы и термостабильной ДНК-лигазы. Одноцепочечные 3'-выступы, создаваемые 5'-3' экзонуклеазой, способствуют отжигу фрагментов, которые имеют общую комплементарность на одном конце. Высокоточная полимераза эффективно заполняет пробелы в отожженных одноцепочечных областях путем добавления dNTP, а термостабильная ДНК-лигаза запечатывает зазубрины, образуя совместные молекулы ДНК8. Следовательно, этот технический метод широко используется для создания векторов экспрессии генов.

Репродуктивно-респираторный синдром свиней (РРСС) — это вирусное заболевание, которое приводит к нарушению репродуктивной функции и дыхательной недостаточности у свиней, вызванным РРСС в возрасте9 лет. Синдром проявляется в виде лихорадки, анорексии, пневмонии, вялости, депрессии и респираторного дистресса. Кроме того, при некоторых эпидемиях наблюдались клинические признаки, в том числе красно-синее обесцвечивание ушей. Являясь членом семейства артеривирусов, РРСС широко передается в страны-производители свинины при прямом контакте и обмене жидкостями, включая мочу, молозиво и слюну. Из-за распространения РРСС в Соединенных Штатах общие экономические потери свиноводческой отрасли оцениваются примерно в 664 миллиона долларов в год, исходя из масштаба разведения 5,8 миллиона свиноматок и 110 миллионов свиней10,11. Отчет Службы инспекции здоровья животных и растений показывает, что у 49,8% невакцинированных свиней наблюдается присутствие РРСС в сывороткекрови 12, а низкие уровни РРСС у инфицированных свиней выводятся через слюну, носовые выделения, мочу и фекалии13. Для борьбы с распространением РРСС 14,15,16 были реализованы различные стратегии. В дополнение к процедурам элиминации для создания полностью вирус-отрицательных популяций или улучшения биобезопасности и управления, введение вакцин является эффективным средством борьбы с РРСС.

РРСС представляет собой оболочечную одноцепочечную РНК-вирус с положительной смысловой РНК длиной около 15 килооснований (кб). Геном РРСС состоит по меньшей мере из 10 открытых рамок считывания (ORF), короткой 5' нетранслируемой области (5' UTR) и поли(A) хвоста на 3'-конце (рис. 1A)17. Геном вируса с отрицательной цепью РНК незаразен, в то время как геном вирусов с положительной цепью РНК является инфекционным. Существуют две основные стратегии трансфекции РНК и ДНК для получения потомства вируса18. Тем не менее, клонирование полноразмерного фрагмента, соответствующего геному РНК, имеет решающее значение для создания инфекционных клонов. Из-за длинного и сложного характера генома РРСС полный геном не может быть легко получен с помощью ПЦР за один раз. Кроме того, хотя искусственный синтез генов РРСС является эффективным решением, синтез длинных фрагментов часто обходится дорого. Следовательно, для получения полноразмерного вектора экспрессии РРСС мы попытались создать его методом гомологичной рекомбинации множественных вставок19,20. К сожалению, нам не удалось получить полноразмерный вектор экспрессии генов. Поэтому в данном исследовании мы добавили соответствующие сайты рестрикции к обратному праймеру и успешно получили вектор экспрессии pVAX1-PRRSV с помощью нескольких раундов гомологичной рекомбинационной реакции. Кроме того, этот метод может также обеспечить делецию или мутацию генов-мишеней и эффективно присоединить большое количество фрагментов ДНК к вектору экспрессии.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

1. Подготовка матрицы гена РРСС

  1. Разморозьте запас вируса в 1 мл реагента для экстракции РНК (см. Таблицу материалов).
  2. Добавьте 0,2 мл хлороформа и тщательно перемешайте. Выдерживать 3 мин.
  3. Центрифугируйте смесь в течение 15 мин при 12 000 × г при 4 °C.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Смесь делится на три фазы, а именно: бесцветную водную фазу, интерфазу и красную фенол-хлороформную фазу.
  4. Пипетируйте бесцветную водную воду в фазе и переложите ее в новую пробирку.
  5. Тщательно перемешайте водную фазу с 0,5 мл изопропанола и инкубируйте в течение 10 минут при 4 °C.
  6. Центрифугировать в течение 10 мин при 12 000 × г при 4 °C.
    ПРИМЕЧАНИЕ: На дне пробирки находится белый осадок РНК.
  7. С помощью микропипетки удалите надосадочную жидкость из пробирки.
  8. Добавьте 1 мл 75% этанола для ресуспендирования гранул и кратковременно перемешайте.
  9. Центрифуга в течение 5 мин при 7 500 × г при 4 °C. С помощью микропипетки удалите надосадочную жидкость из пробирки.
  10. Высушите РНК в течение 5 минут, добавьте 20-50 мкл воды, не содержащей РНКазы, чтобы ресуспендировать РНК, и тщательно перемешайте.
  11. Приступайте к выполнению обратной транскрипции; настроить реакции для выполнения обратной транскрипции, как показано в таблице 1.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Чтобы обеспечить успешную обратную транскрипцию, используйте высококачественные шаблоны РНК.
  12. Полученную кДНК использовать для ПЦР или хранить при температуре -20 °С.

2. Дизайн праймера для ПЦР

  1. Проектирование переднего праймера
    1. Откройте программу и выберите «Новый файл ДНК».
    2. Вставьте последовательность гена PRRSV (GenBank: FJ548852.1) из NCBI в программное обеспечение. Нажмите кнопку OK , чтобы создать файлы последовательности.
    3. Проанализируйте последовательность и отметьте стыки фрагментов. Разработайте прямую специфическую последовательность праймера фрагментов. В большинстве случаев предпочтительная температура плавления (Tm) составляет от 55 °C до 62 °C, а содержание GC составляет 40-60%.
    4. Нажмите на Праймеры и выберите Добавить праймер.
    5. Вставьте конкретную последовательность и добавьте перекрывающиеся последовательности вектора к первым 5'-нуклеотидам праймера конкретной последовательности. Рядом с каждым соединением выберите 20-40.о., который будет служить областью перекрытия между двумя соседними фрагментами.
    6. Назовите передний праймер, содержащий выступы и конкретную последовательность (см. дополнительный рисунок S1).
    7. Нажмите на кнопку Добавить праймер к шаблону.
  2. Проектирование обратной грунтовки
    1. Проанализируйте последовательность и отметьте стыки фрагментов в программном обеспечении. Разработайте обратную специфическую последовательность праймера из фрагментов.
    2. Нажмите на Праймеры и выберите Добавить праймер.
    3. Вставьте определенную последовательность и добавьте сайт рестрикции к первым 5'-нуклеотидам праймера специфической последовательности.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Добавленные сайты ограничения должны отсутствовать во фрагменте вставки и векторе, за исключением множественных сайтов клонирования.
    4. Добавьте 20-40.о. нависающие последовательности векторов к первым 5'-нуклеотидам сайта рестрикции.
    5. Назовите обратный капсюль, содержащий выступы и конкретную последовательность (см. дополнительный рисунок S1).
    6. Нажмите на кнопку Добавить праймер к шаблону.

3. ПЦР для амплификации фрагментов

  1. Настройте шесть отдельных реакций ПЦР (табл. 2): для фрагмента 1 используйте праймеры P1 и P2 (см. дополнительный рисунок S2); для фрагмента 2 используйте праймеры P3 и P4 (см. дополнительный рисунок S2); для фрагмента 3 используйте капсюли P5 и P6 (см. дополнительный рисунок S2); для фрагмента 4 использовать капсюли P7 и P8 (см. дополнительный рисунок S2); для фрагмента 5 использовать капсюли Р9 и Р10; и использовать праймеры P11 и P12 для амплификации фрагмента 6 (см. дополнительный рисунок S2).
    ПРИМЕЧАНИЕ: Разморозьте, смешайте и кратко центрифугируйте каждый компонент перед использованием.
  2. Запустите ПЦР по трехэтапному протоколу, показанному в таблице 2.
  3. Добавьте 1 мкл 6-кратного буфера загрузки ДНК к 5 мкл продукта ПЦР, перемешайте и кратковременно центрифугируйте содержимое.
  4. Анализируйте образцы с помощью электрофореза в 1% агарозном геле.

4. Очистка фрагментов ПЦР

ПРИМЕЧАНИЕ: Очистка продуктов ПЦР от геля с помощью набора для экстракции геля (см. Таблицу материалов) важна для векторного конструирования.

  1. Добавьте 9 мкл 6-кратного буфера загрузки ДНК к 45 мкл продуктов ПЦР, перемешайте и кратковременно центрифугируйте содержимое.
  2. Проведите электрофорез 1% агарозного геля/голдвью для отделения фрагментов ДНК.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Не используйте повторно рабочий буфер TAE, так как его значение pH повлияет на восстановление фрагмента ДНК.
  3. После достаточного разделения полос используйте острый скальпель, чтобы аккуратно вырезать полосы ДНК.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Минимизируйте размер гелевого ломтика, обрезав излишки агарозы.
  4. Взвесьте гелевый ломтик в чистой микроцентрифужной пробирке объемом 1,5 мл, добавьте равный объем связующего буфера к гелевому ломтику (например, 0,3 мл на ломтик 0,3 г) и инкубируйте при 60 °C в течение 7 минут.
  5. Вставьте мини-колонку в пробирку для сбора объемом 2 мл. Добавьте 700 мкл раствора ДНК/агарозы с шага 4.4 в мини-колонку.
  6. Центрифуга при 10 000 × г в течение 1 мин при комнатной температуре. Выбросьте фильтрат и повторно используйте пробирку для сбора.
  7. Добавьте 300 мкл связующего буфера и центрифугуйте при 13 000 × г в течение 1 минуты при комнатной температуре. Выбросьте фильтрат и повторно используйте пробирку для сбора.
  8. Добавьте 700 μL промывочного буфера и центрифугуйте в дозе 13 000 × г в течение 1 минуты при комнатной температуре. Выбросьте фильтрат и повторно используйте пробирку для сбора.
  9. Вращайте пустую мини-колонку в течение 2 минут на максимальной скорости, чтобы высушить матрицу колонны. Поместите мини-колонку в чистую микроцентрифужную пробирку объемом 1,5 мл.
  10. Добавьте 20 μL деионизированной воды непосредственно в центр мембраны колонны и оставьте при комнатной температуре на 2 минуты. Центрифуга при скорости 13 000 × g в течение 1 мин.
  11. Храните ДНК при температуре -20 °C.

5. Подготовка линеаризованного вектора

ПРИМЕЧАНИЕ: После подготовки плазмиды выбранные ферменты можно использовать для ее разрезания. Длительное переваривание или переваривание с помощью двух ферментов имеет решающее значение для обеспечения переваривания всей ДНК. Это позволит снизить количество ложноположительных клонов в последующих экспериментах.

  1. Линеаризация pVAX1
    1. Приготовьте реакционную смесь при комнатной температуре в указанном порядке (табл. 3).
      ПРИМЕЧАНИЕ: Объем воды следует добавить, чтобы сохранить указанный общий объем реакции. Здесь 1 г плазмиды расщепляли ферментами в реакционной смеси. В зависимости от концентрации плазмиды объем плазмиды может быть скорректирован в реакционной смеси.
    2. Аккуратно перемешайте; Затем вращаем вниз. Инкубировать при температуре 37 °C в тепловом блоке или водяном термостате в течение 60 минут.
    3. Проводят очистку гелем аналогично очистке фрагментов ПЦР в разделе 4 с помощью набора для экстракции геля (см. Таблицу материалов).
  2. Линеаризация pVAX1-F1
    Примечание: pVAX1-F1 является вектором, полученным в результате рекомбинации первого раунда pVAX1 (NdeI и HindIII) и фрагмента 1. pVAX1-F2 — вектор, полученный в результате рекомбинации раунда pVAX1-F1 (NdeI) и фрагмента 2. pVAX1-F3 — вектор, полученный в результате рекомбинации раунда pVAX1-F2 (NdeI) и фрагмента 3. pVAX1-F4 — вектор, полученный в результате рекомбинации раунда pVAX1-F3 (NdeI) и фрагмента 4. pVAX1-F5 — вектор, полученный в результате рекомбинации раунда pVAX1-F4 (EcoRV и NtoI) и фрагмента 5.
    1. Для каждого вектора готовьте реакционную смесь отдельно при комнатной температуре в указанном порядке (табл. 3).
    2. Аккуратно перемешайте; Затем вращаем вниз. Инкубировать при температуре 37 °C в тепловом блоке или водяном термостате в течение 60 минут.
    3. Проводят очистку гелем аналогично очистке фрагментов ПЦР в разделе 4 с помощью набора для экстракции геля (см. Таблицу материалов).

6. Субклонирование на новый вектор

ПРИМЕЧАНИЕ: Хорошая эффективность клонирования может быть достигнута при использовании 50-200 нг вектора и вкладышей.

  1. Настройте реакцию бесшовного клонирования и сборки ExonArt (табл. 4). Отрегулируйте общий объем реакции до 10 мкл с помощью стерилизованного деионизированного H2O и перемешайте.
  2. Инкубируйте реакцию в термоамплификаторе в течение 15-60 мин при 50 °C. Храните образцы на льду.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Увеличение продолжительности инкубации до 60 минут может повысить эффективность сборки.
  3. Разморозьте химически компетентные клетки DH5α на льду.
  4. Добавьте 10 μL сборочного продукта в соответствующие ячейки; Затем аккуратно перемешайте, пипетируя вверх и вниз.
  5. Выложите смесь на лед на 30 минут.
  6. Тепловой шок при 45 °C в течение 45 с и перенос трубок на лед на 3 мин.
  7. Добавьте в пробирку 900 μл среды SOC.
  8. Встряхивайте пробирку при 225 об/мин в течение 1 ч в встряхивающем инкубаторе при температуре 37 °C.
  9. Центрифугируйте реакцию превращения при 6 000 × г в течение 2 мин. Выбросьте надосадочную жидкость и повторно суспендируйте клетки в 100 мкл свежей среды SOC.
  10. Распределите трансформированную клеточную суспензию на отдельную ЛБ-пластину с 50 мкг/мл канамицина.
  11. Инкубируйте все планшеты в течение ночи при температуре 37 °C. Выберите отдельные изолированные колонии из каждой экспериментальной пластины.

7. Анализ трансформантов

  1. Соберите восемь колоний в 20 мкл LB среды, содержащей 50 мкг/мл канамицина.
  2. Настройте реакцию ПЦР на колонию и запустите ПЦР (табл. 5).
    ПРИМЕЧАНИЕ: Для ПЦР-реакции колонии для фрагмента 1 используйте праймеры P1 и P2 (см. Дополнительный файл 1); для фрагмента 2 использовать праймеры P3 и P4 (см. Дополнительный файл 1); для фрагмента 3 использовать капсюли P5 и P6 (см. Дополнительный файл 1); для фрагмента 4 использовать капсюли P7 и P8 (см. дополнительный рисунок S2); для фрагмента 5 использовать капсюли Р9 и Р10; и использовать праймеры P11 и P12 для обнаружения фрагмента 6 (см . дополнительный рисунок S2).
  3. Добавьте 1 мкл 6-кратного буфера для загрузки ДНК в 5 мкл продукта ПЦР, перемешайте и кратковременно центрифугируйте содержимое.
  4. Проанализируйте результаты с помощью электрофореза в 1% агарозном геле.
  5. Выберите одну положительную колонию в 5 мл LB среды, содержащей 50 мкг/мл канамицина, и выращивайте в течение ночи при 37 °C.
  6. Получите плазмиду с помощью мини-набора для плазмидной ДНК (см. Таблицу материалов) в соответствии с инструкциями производителя.
  7. Визуализируйте результаты с помощью электрофореза в 1% агарозном геле.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

В данной работе мы представляем систему рекомбинации in vitro для сборки и восстановления перекрывающихся молекул ДНК с использованием обратного праймера с помощью постоянно вводимых сайтов рестрикции (рис. 1B). Эта система представляет собой простую и эффективную процедуру, включающую получение линейного вектора и фрагментов вставки, содержащих выступы, введенные методом ПЦР, с праймерами, имеющими соответствующие 5'-последовательности удлинения и сайты рестрикции; одиночная изотер...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

Метод сборки Гибсона представляет собой метод молекулярного клонирования на основе рекомбинации in vitro для сборки фрагментов ДНК8. Этот метод позволяет собрать несколько фрагментов ДНК в кольцевую плазмиду в ходе изотермической реакции в одной пробирке. Однако одним из препятствий для метода сборки Гибсона является получение длинных фрагментов из кДНК. Длинные фрагменты трудно точно амплифицировать по многим причинам. Например, праймеры легче не совпадают в течение длительного времени, ...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.

Благодарности

Эта работа была поддержана финансовой поддержкой фондов для инициирования докторских исследований, предоставленных Китайским западным педагогическим университетом (No 20E059).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
1 kb plus DNA LadderTiangen Biochemical Technology (Beijing) Co., LtdMD113-02
2x Universal Green PCR Master MixRong Wei Gene Biotechnology Co., LtdA303-1
AgaroseSangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd.9012-36-6
Настольная микроцентрифугаThermo Fisher Scientific  Co., LtdFRESCO17
Чистый стендSujing Antai Air Technology  Co., LtdVD-650-U
Оборудование для электрофореза ДНКСкалыватель Scientific  Co., Ltd170905117
буфер для загрузки ДНК (6x)Biosharp Biotechnology Co., LtdBL532A
E. Z. N. A. Набор для экстракции геляOmega Bio-Tek Co., LtdD2500-01
E.Z.N.A. Мини-набор плазмидной ДНК IOmega Bio-Tek Co., LtdD6943-01
Культиватор с электронагреванием при постоянной температуреShanghai Hengyi Scientific Instrument Co., LtdDHP-9082
Набор для бесшовного клонирования и сборки ExonArtRong Wei Gene Biotechnology Co., LtdA101-02
ExonScript RT SuperMix с dsDNaseRong Wei Gene Biotechnology Co., LtdA502-1
FastDigest Eco321 (EcoRV)Thermo Fisher Scientific  Co., LtdFD0303
FastDigest HindIIIThermo Fisher Scientific  Co., LtdFD0504
FastDigest NheIThermo Fisher Scientific  Co., LtdFD0974
FastDigest NotIThermo Fisher Scientific  Co., LtdFD0596
Gel Doc XRBio-Rad Laboratories Co., Ltd721BR07925
Голдвью Гель Нуклеиновая кислотаШанхай Yubo Biotechnology Co., LtdYB10201ES03
льдогенераторШанхайская машина для производства инструментов Shanghai Bilang Instrument Manufacturing Co., LtdFMB100
Invitrogen Platinum SuperFi II DNA PolymeraseThermo Fisher Scientific  Co., Ltd12361010
LB Agar Plate (Kanamycin)Sangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd.B530113-0010
LB стерильная жидкая среда (Канамицин)Sangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd.B540113-0001
МикропипеткиThermo Fisher Scientific  Co., Ltd—
Микроволновая печьPanasonic Electric (China) Co., LtdNN-GM333W
Shanghai Zhicheng Analytical Instrument Manufacturing Co., LtdZHWY-2102C
PRRSV вирус Сычуаньскийсельскохозяйственный университет—
SnapGeneGSL Biotech, LLCv5.1Для разработки праймеров
T100 PCR Gradient Thermal CyclerBio-Rad Laboratories  Co., LtdT100 Thermal Cycler
TAE bufferSangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd.B040123-0010
Реагент ТРИзолThermo Fisher Scientific  Co., Ltd15596026реагент для экстракции РНК
Орбитальные шейкеры

Ссылки

  1. Lessard, J. C. Molecular cloning. Methods Enzymol. 529, 85-98 (2013).
  2. Shetty, R. P., Endy, D., Knight, T. F. Jr Engineering BioBrick vectors from BioBrick parts. J. Biol. Eng. 2, 5(2008).
  3. Horton, R. M., Cai, Z. L., Ho, S. N., Pease, L. R. Gene splicing by overlap extension: tailor-made genes using the polymerase chain reaction. Biotechniques. 54 (3), 129-133 (2013).
  4. Horton, R. M. PCR-mediated recombination and mutagenesis. SOEing together tailor-made genes. Mol Biotechnol. 3 (2), 93-99 (1995).
  5. Bang, D., Church, G. M. Gene synthesis by circular assembly amplification. Nat. Methods. 5 (1), 37-39 (2008).
  6. Geu-Flores, F., Nour-Eldin, H. H., Nielsen, M. T., Halkier, B. A. USER fusion: a rapid and efficient method for simultaneous fusion and cloning of multiple PCR products. Nucleic Acids Res. 35 (7), e55(2007).
  7. Gibson, D. G. Enzymatic assembly of overlapping DNA fragments. Methods Enzymol. 498, 349-361 (2011).
  8. Gibson, D. G., et al. Enzymatic assembly of DNA molecules up to several hundred kilobases. Nat Methods. 6 (5), 343-345 (2009).
  9. Cho, J. G., Dee, S. A. Porcine reproductive and respiratory syndrome virus. Theriogenology. 66 (3), 655-662 (2006).
  10. Holtkamp, D. J., et al. Assessment of the economic impact of porcine reproductive and respiratory syndrome virus on United States pork producers. J. Swine Health Prod. 21, 72-84 (2013).
  11. Thomann, B., Rushton, J., Schuepbach-Regula, G., Nathues, H. Modeling economic effects of vaccination against porcine reproductive and respiratory syndrome: Impact of vaccination effectiveness, vaccine price, and vaccination coverage. Front Vet Sci. 7, 500(2020).
  12. Dwivedi, V., et al. Evaluation of immune responses to porcine reproductive and respiratory syndrome virus in pigs during early stage of infection under farm conditions. Virol J. 9, 45(2012).
  13. Mengeling, W. L., Lager, K. M., Vorwald, A. C. Clinical consequences of exposing pregnant gilts to strains of porcine reproductive and respiratory syndrome (PRRS) virus isolated from field cases of "atypical" PRRS. Am. J. Vet. Res. 59 (12), 1540-1544 (1998).
  14. Dee, S. A., Joo, H. S. Prevention of the spread of porcine reproductive and respiratory syndrome virus in endemically infected pig herds by nursery depopulation. Vet Rec. 135 (1), 6-9 (1994).
  15. Dee, S. A., Joo, H. Strategies to control PRRS: a summary of field and research experiences. Vet Microbiol. 55 (1-4), 347-343 (1997).
  16. Renukaradhya, G. J., Meng, X. J., Calvert, J. G., Roof, M., Lager, K. M. Live porcine reproductive and respiratory syndrome virus vaccines: Current status and future direction. Vaccine. 33 (33), 4069-4080 (2015).
  17. Conzelmann, K. K., Visser, N., Woensel, P. V., Thiel, H. J. Molecular characterization of porcine reproductive and respiratory syndrome virus, a member of the arterivirus group. Virology. 193 (1), 329-339 (1993).
  18. Han, M. Y., Yoo, D. W. Engineering the PRRS virus genome: Updates and perspectives. Vet Microbiol. 174 (3), 279-295 (2014).
  19. Bryksin, A. V., Matsumura, I. Overlap extension PCR cloning: a simple and reliable way to create recombinant plasmids. Biotechniques. 48 (6), 463-465 (2010).
  20. Wang, S., et al. Restriction-based multiple-fragment assembly strategy to avoid random mutation during long cDNA cloning. J Cancer. 6 (7), 632-635 (2015).
  21. Zhang, Z. D., et al. The economic impact of porcine reproductive and respiratory syndrome outbreak in four Chinese farms: Based on cost and revenue analysis. Front Vet Sci. 9, 1024720(2022).
  22. Chen, N. H., et al. High genetic diversity of Chinese porcine reproductive and respiratory syndrome viruses from 2016 to 2019. Res Vet Sci. 131, 38-42 (2020).
  23. Wang, X. B., et al. Salidroside, a phenyl ethanol glycoside from Rhodiola crenulata, orchestrates hypoxic mitochondrial dynamics homeostasis by stimulating Sirt1/p53/Drp1 signaling. J Ethnopharmacol. 293, 115278(2022).
  24. Hou, Y., et al. Salidroside intensifies mitochondrial function of CoCl2-damaged HT22 cells by stimulating PI3K-AKT-MAPK signaling pathway. Phytomedicine. 109, 154568(2023).
  25. Zhang, S. R., et al. Generation of an infectious clone of HuN4-F112, an attenuated live vaccine strain of porcine reproductive and respiratory syndrome virus high copy plasmid. Virol J. 8, 410(2011).
  26. Ni, Y. Y., Huang, Y. W., Cao, D. J., Opriessnig, T., Meng, X. J. Establishment of a DNA-launched infectious clone for a highly pneumovirulent strain of type 2 porcine reproductive and respiratory syndrome virus: identification and in vitro and in vivo characterization of a large spontaneous deletion in the nsp2 region. Virus Res. 160 (1-2), 264-273 (2011).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Больше статей

Экспрессионный вектор PRRSVгомологичная рекомбинациясборка по Гибсонуклонирование с помощью рестриктазамплификация ПЦР-фрагментовэлектрофорез в агарозном гелеколониальная ПЦРлинеаризация векторасборка фрагментов ДНК
Бесшовный подход к клонированию векторов экспрессии вируса репродуктивного и респираторного синдрома свиней
Связаться с нами
Порекомендовать библиотеке

Конфиденциальность

Условия использования

Политики

© 2026 MyJoVE Corporation. Все права защищены.