AQRNA-seq для количественного определения малых РНК

Краткое содержание

Абсолютное количественное секвенирование РНК (AQRNA-seq) — это технология, разработанная для количественной оценки ландшафта всех малых РНК в биологических смесях. В данной работе продемонстрированы этапы подготовки библиотеки и обработки данных AQRNA-seq, количественно оценивающие изменения в пуле транспортной РНК (тРНК) в Mycobacterium bovis BCG во время периода покоя, вызванного голоданием.

Аннотация

AQRNA-seq обеспечивает прямую линейную зависимость между количеством прочтений секвенирования и числом малых копий РНК в биологическом образце, что позволяет точно количественно оценить пул малых РНК. Описанная здесь процедура подготовки библиотеки AQRNA-seq включает в себя использование специально разработанных линкеров секвенирования и этап снижения модификаций метилирования РНК, которые блокируют процесс обратной транскрипции, что приводит к увеличению выхода полноразмерных кДНК. Кроме того, подробно описана реализация сопутствующего биоинформатического конвейера. Эта демонстрация AQRNA-seq была проведена путем количественного анализа 45 тРНК в Mycobacterium bovis BCG, собранных в течение 5 выбранных дней в течение 20-дневного курса депривации питательных веществ и 6 дней реанимации. Здесь также будут обсуждаться текущие усилия по повышению эффективности и строгости AQRNA-seq. Это включает в себя изучение методов предотвращения очистки геля для смягчения проблем с димерами праймера после амплификации ПЦР и увеличения доли полноразмерных прочтений для обеспечения более точного картирования считываний. Будущие усовершенствования AQRNA-seq будут сосредоточены на содействии автоматизации и высокопроизводительному внедрению этой технологии для количественного определения всех малых видов РНК в образцах клеток и тканей различных организмов.

Введение

Секвенирование нового поколения (NGS), также известное как массово-параллельное секвенирование, представляет собой технологию секвенирования ДНК, которая включает в себя фрагментацию ДНК, лигирование адапторных олигонуклеотидов, амплификацию на основе полимеразной цепной реакции (ПЦР), секвенирование ДНК и повторную сборку последовательностей фрагментов в геном. Адаптация NGS к секвенированной РНК (РНК-секвенирование) является мощным подходом к идентификации и количественному определению РНК-транскриптов и их вариантов¹. Инновационные разработки в области подготовки библиотек РНК и биоинформатического анализа в сочетании с достижениями в области лабораторного оборудования расширили репертуар приложений РНК-секвенирования, перейдя от секвенирования экзома к передовым функциональным омикам, таким как профилирование некодирующих РНК², анализ одиночных клеток³, пространственная транскриптомика ^4,5, анализ альтернативного сплайсинга⁶, в том числе. Эти передовые методы РНК-секвенирования выявляют сложные функции РНК посредством количественного анализа транскриптома в нормальных и больных клетках и тканях.

Несмотря на эти достижения в области РНК-секвенирования, несколько ключевых технических особенностей ограничивают количественную мощность метода. В то время как большинство методов секвенирования РНК позволяют точно и точно количественно оценить изменения уровней РНК между экспериментальными переменными (т.е. биологическими образцами и/или физиологическими состояниями), они не могут обеспечить количественное сравнение уровней молекул РНК в образце. Например, большинство методов РНК-секвенирования не могут точно количественно определить относительное число копий отдельных молекул изоакцептора тРНК в клеточном пуле экспрессированных тРНК. Как подчеркивается в сопутствующей публикации⁷, это ограничение в отношении РНК-секвенирования обусловлено рядом особенностей структуры РНК и биохимии библиотечного приготовления. Например, активность ферментов лигирования, используемых для присоединения линкеров 3'- и 5'-концевого секвенирования к молекулам РНК, сильно зависит от идентичности концевых нуклеотидов РНК и линкеров секвенирования. Это приводит к значительным вариациям эффективности линкерных лигирования и значительному артефактному увеличению прочтений секвенирования ^8,9,10.

Второй набор ограничений вытекает из присущих молекулам РНК структурных свойств. В частности, формирование вторичной структуры РНК и динамические изменения в десятках посттранскрипционных модификаций РНК эпитранскриптома могут вызывать спад полимеразы или мутацию во время обратной транскрипции. Эти ошибки приводят к неполному или усеченному синтезу кДНК или изменению последовательности РНК. Хотя оба эти явления могут быть использованы для картирования вторичных структур или некоторых модификаций, они снижают количественную точность RNA-seq, если на последующих этапах подготовки библиотеки не удается захватить усеченные кДНК или если обработка данных отбрасывает мутировавшие последовательности, не соответствующие эталонному набору данных^. Кроме того, огромное химическое, длинное и структурное разнообразие РНК-транскриптов, а также отсутствие инструментов для равномерной фрагментации длинных РНК уменьшают применимость большинства методов РНК-секвенирования ко всем видам РНК¹³.

Метод AQRNA-seq (секвенирование РНК в абсолютном количестве) был разработан для устранения некоторых из этих технических и биологических ограничений, ограничивающих количественную точность^. Сводя к минимуму зависящие от последовательности смещения при захвате, лигировании и амплификации во время подготовки библиотеки секвенирования РНК, AQRNA-seq достигает превосходной линейности по сравнению с другими методами, точно количественно определяя 75% референсной библиотеки из 963 микроРНК с 2-кратной точностью. Эта линейная корреляция между количеством прочтений секвенирования и распространенностью РНК также наблюдается при анализе пула стандартов олигонуклеотидов РНК переменной длины и в отношении ортогональных методов, таких как нортерн-блоттинг. Установление линейности между количеством прочтений секвенирования и обилием РНК позволяет AQRNA-seq достичь точной, абсолютной количественной оценки всех видов РНК в образце.

Ниже приведено описание протокола для рабочего процесса подготовки библиотеки AQRNA-seq и сопутствующего нисходящего конвейера анализа данных. Метод был применен для выяснения динамики численности тРНК во время состояния покоя, вызванного голоданием, и последующей реанимации в модели туберкулеза Mycobacterium bovis bacilli de Calmette et Guérin (BCG). Были представлены результаты исследовательской визуализации данных секвенирования, а также последующего кластерного и дифференциального анализа экспрессии, которые выявили различимые закономерности в распространенности тРНК, связанные с различными фенотипами.

Протокол

ПРИМЕЧАНИЕ: На рисунке 1 представлена графическая иллюстрация процедур, связанных с подготовкой библиотеки AQRNA-seq. Подробную информацию о реагентах, химикатах и колонках/наборах, используемых в процедуре, можно найти в Таблице материалов. Рекомендуется проводить всестороннюю оценку чистоты, целостности и количества образцов входной РНК с использованием (i) электрофореза в 3% агарозном геле, (ii) автоматизированных инструментов электрофореза для контроля качества биомолекул в образцах (см. Таблицу материалов) и (iii) УФ-видимой спектрофотометрии и/или флуориметрического количества. В обязательном порядке все реакции и мастер-смеси должны быть на льду, если не указано иное. Транспортируйте реагенты (например, ферменты) в холодильных камерах на хранение при температуре -20 °C и обратно, чтобы сохранить их срок годности и избежать многократных циклов замораживания-размораживания библиотечных промежуточных продуктов.

1. Дефосфорилирование РНК

Примечание: Удаление 5'-фосфата (P; донора) предотвращает самолигирование к 3'-гидроксилу (OH; акцептору) РНК. Линкеры не будут самолигировать, так как их 3'-конец модифицирован для включения либо дидезоксицитидина (линкера 1), либо спейсера (линкер 2). Линкеры могут быть лигированы только путем присоединения их 5'-P к 3'-ОН РНК или кДНК.

1. Готовят реакцию дефосфорилирования в стерильной ПЦР-пробирке (например, 200 мкл или 500 мкл) путем добавления до 2 мкл образца РНК, 0,5 мкл 40 ед/мкл ингибитора РНКазы, 1 мкл 0,5 мкл внутреннего стандарта (табл. 1), 0,5 мкл 10-кратного реакционного буфера Т4-лигазы РНК-лигазы, 1 мкл щелочной фосфатазы креветок, и достаточное количество воды, не содержащей РНКазы, для доведения общего объема до 5 мкл.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Для типичных образцов 75 нг РНК (или приблизительно 2 пмоль для 80 нт РНК) считается достаточным для количественного определения малых РНК с использованием этого протокола.
2. Инкубировать при 37 °C в течение 30 мин для дефосфорилирования РНК, а затем при 65 °C в течение 5 мин для инактивации фермента и денатурации РНК. Держите образцы при температуре 4 °C не менее 10 минут, чтобы предотвратить ренатурацию.

2. Лигирование линкера 1 к 3'-концу РНК

1. Приготовьте реакцию лигирования Линкера 1 в стерильной ПЦР-пробирке, добавив 5 мкл дефосфорилированных РНК (продукты из стадии 1), 0,5 мкл 40 Ед/мкл ингибитора РНКазы, 1 мкл 100 мкМ Линкера 1 (Таблица 1), 3 мкл 10 мМ АТФ, 2,5 мкл 10x Т4 РНК-лигазы реакционного буфера, 15 мкл PEG8000 (50% раствор), 2 мкл 30 Ед/мкл Т4 РНК-лигазы 1 и 1 мкл воды, не содержащей РНКазы.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Реагенты могут быть превращены в мастер-смесь для облегчения обработки образцов. Не включайте PEG8000 и Т4 РНК-лигазу 1 в мастер-микс.
2. Инкубировать при 25 °C в течение 2 ч, а затем при 16 °C в течение 16 ч для лигирования Linker 1 к РНК.
3. Очистите РНК, лигированные Linker-1, в колонке. Используйте набор для восстановления и очистки ДНК/РНК (см. Таблицу материалов).
   ПРИМЕЧАНИЕ: Этот протокол очистки колонок применяется ко всей последующей очистке колонок с использованием того же комплекта. Наборы, использующие технологию гель-фильтрации для удаления терминаторов красителя из реакций секвенирования (см. Таблицу материалов), здесь использовать нельзя, так как PEG8000 несовместимо с гелевыми фильтрами таких наборов. После очистки рекомендуется сохранять аликвоту (1,2 мкл) каждого образца. При необходимости эти аликвоты могут быть использованы для проверки эффективности лигирования с помощью коммерческого анализатора нуклеиновых кислот. Оставшиеся очищенные образцы храните на льду или при температуре -20 °C до дальнейших действий.
   1. Для объема образца < 50 мкл добавьте воду, не содержащую РНКазы, чтобы довести его до 50 мкл. Добавьте 2 объема олигосвязывающего буфера (входит в комплект) в 1 объем образца. Добавьте 8 объемов 100% этанола к 1 объему образца.
   2. Загрузите образец (до 750 мкл за один раз) в колонку, помещенную внутрь пробирки для сбора объемом 2 мл (входит в комплект). Чтобы связать РНК с колонкой, центрифугируйте при давлении 10 000 x g в течение 30 с и отбросьте проточный поток (т.е. жидкость в сборной пробирке). Поместите колонку обратно в пробирку для сбора.
   3. Чтобы смыть загрязнения с колонки, добавьте в колонку 750 мкл буфера для промывки ДНК (входит в комплект). Центрифугируйте при давлении 10 000 x g в течение 30 с и выбросьте проточный поток. Поместите колонку обратно в пробирку для сбора.
   4. Центрифугируйте на максимальной скорости (например, 16 000 x g для настольной микроцентрифуги) в течение дополнительной 1 минуты для удаления остаточного буфера для промывки ДНК.
   5. Чтобы элюировать РНК, осторожно переместите колонку в стерильную пробирку объемом 1,5 мл, добавьте в колонку воду, не содержащую РНКазы. Используйте больший объем, чем необходимо при элюировании РНК, чтобы учесть потенциальную потерю объема в процессе элюирования. Например, если для следующего этапа требуется 15 μЛ, добавьте 17 μЛ воды, не содержащей РНКазы, для элюирования. Центрифуга при 10 000 x g в течение 30 с.

3. Удаление посттранскрипционного метилирования деметилазой AlkB

Примечание: AlkB — это бактериальный фермент, который удаляет метильные группы из некоторых, но не из всех, метилированных нуклеотидов в ДНК и РНК. Удаление нескольких типов метилированных рибонуклеотидов в РНК предотвращает выпадение обратной транскриптазы, что позволяет проводить более полноценные чтения и идентифицировать сайты модификации. Этот этап необходимо контролировать при низком pH, чтобы предотвратить неожиданную деградацию РНК.

1. Приготовьте исходный раствор 1 М 2-кетоглутарата, растворив 1,4611 г 2-кетоглутарата (146,11 г на М) в 10 мл воды, не содержащей РНКазы. Фильтр стерилизуют раствор через шприц-фильтр 0,2 мкм. Разложите исходный раствор по 2 мл стерильных пробирок и храните при температуре -20 °C.
2. Приготовьте стоковый раствор 0,5 М L-аскорбиновой кислоты, растворив 0,88 г L-аскорбиновой кислоты (176,12 г/М) в 10 мл воды, не содержащей РНКазы. Фильтр стерилизуют раствор через шприц-фильтр 0,2 мкм. Разложите исходный раствор по 2 мл стерильных пробирок и храните при температуре -20 °C.
3. Приготовьте стоковый раствор 0,25 М гексагидрата сульфата железа аммония путем растворения 0,9835 г гексагидрата сульфата железа аммония (392,14 г/М) в 10 мл воды, не содержащей РНКазы. Фильтр стерилизуют раствор через шприц-фильтр 0,2 мкм. Разложите исходный раствор по 2 мл стерильных пробирок и храните при температуре -20 °C.
4. Приготовьте исходный раствор 1 М ГЕПЕС, растворив 2,383 г ГЕПЕС (238,30 г на М) в 10 мл воды, не содержащей РНКазы. Отрегулируйте pH раствора до 8 с помощью NaOH и простерилизуйте раствор фильтром через шприцевой фильтр 0,2 мкм. Разложите исходный раствор по 2 мл стерильных пробирок и храните при температуре -20 °C.
5. Приготовьте реакционный буфер 2x AlkB. Чтобы сделать 10 мл буфера, соедините 1,5 мкл 1 М 2-кетоглутарата (получено на этапе 3.1), 80 μЛ 0,5 М L-аскорбиновой кислоты (получено на этапе 3.2), 6 μЛ 0,25 М гексагидрата сульфата железа аммония (получено на этапе 3.3), 100 μЛ 10 мг/мл BSA, 1000 μЛ 1 M HEPES (получено на шаге 3.4; добавить последнее), и 8812,5 мкл воды, не содержащей РНКазы. Фильтр стерилизует буфер через шприцевой фильтр 0,2 мкм.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Реакционный буфер 2x AlkB должен быть приготовлен свежим непосредственно перед каждым экспериментом из-за химической лабильности компонентов.
6. Приготовьте реакцию расщепления AlkB в стерильной ПЦР-пробирке, добавив 20 мкл лигированных РНК Linker-1 (продукты из стадии 2), 50 мкл 2x реакционного буфера AlkB (полученного на стадии 3.5), 2 мкл деметилазы AlkB, 1 мкл ингибитора РНКазы и 27 мкл воды, не содержащей РНКазы.
7. Инкубировать при комнатной температуре в течение 2 ч для удаления посттранскрипционного метилирования из РНК.
8. Чтобы удалить AlkB из реакции, выполните действия, описанные ниже.
   1. Для разделения чистых фаз добавьте 50 μL воды, не содержащей РНКазы, в реакцию AlkB, а затем добавьте 100 μL фенола: хлороформ: изоамиловый спирт 25:24:1 (pH = 5,2).
   2. Встряхните вручную в течение 10 с, а затем центрифугируйте при 16 000 x g в течение 10 минут. Убедитесь, что ротор настольной центрифуги совместим с ПЦР-пробирками. При необходимости используйте адаптеры.
   3. Перенесите РНК (т.е. водный слой сверху; примерно 140 мкл) в стерильную пробирку объемом 1,5 мкл. Если хлороформ (т.е. нижний слой) подмешан к водному слою, то снова центрифугируйте с теми же настройками.
   4. Добавьте 100 мкл хлороформа к экстрагированным РНК для удаления остаточного фенола. Встряхните вручную в течение 10 с, а затем центрифугируйте при 16 000 x g в течение 10 минут.
   5. Перенесите РНК (т.е. водный слой сверху; примерно 120 мкл) в стерильную пробирку объемом 1,5 мкл.
9. Очистите выделенные РНК в колонке. Используйте набор для восстановления и очистки ДНК/РНК (см. Таблицу материалов). Следуйте протоколу, описанному в шаге 2.3, чтобы выполнить очистку колонки.

4. Удаление лишнего Линкера 1

ПРИМЕЧАНИЕ: Рекомендуется сохранять аликвоту (1,2 мкл) каждого образца после очистки. При необходимости эти аликвоты могут быть использованы для проверки эффективности разложения RecJf с помощью коммерческого анализатора нуклеиновых кислот. Приступайте к очищенным образцам сразу же для обратной транскрипции.

1. Приготовьте реакцию деденилирования в стерильной ПЦР-пробирке, добавив 15 мкл линкер-1-лигированных РНК (продукты из стадии 3), 1 мкл 40 Ед/мкл ингибитора РНКазы, 2 мкл 10x набора буфера 2 (см. Таблицу материалов) и 2 мкл 50 Ед/мкл 5'-деденилазы.
2. Инкубировать при 30 °C в течение 1 ч, чтобы удалить аденин на 5'-конце линкера 1. Добавьте 2 мкл 30 U/μL RecJf в реакцию омертвения.
3. Выдерживать при 37 °C в течение 30 минут, чтобы переварить излишки Линкера 1. Добавьте в реакцию еще 2 мкл 30 ед/мкл RecJf.
4. Инкубировать при 37 °C в течение 30 минут, чтобы продолжить переваривание избытка Линкера 1, а затем при 65 °C в течение 20 минут, чтобы денатурировать фермент.
5. Очистите РНК, лигированные Linker-1, в колонке. Используйте набор, в котором используется технология гель-фильтрации для удаления терминаторов красителя из реакций секвенирования (см. Таблицу материалов), так как он эффективен при удалении коротких остатков (например, олигонуклеотидов длиной от 2 до 10.о.). Выполните описанные ниже шаги для очищения.
   1. Подготовьте колонки гель-фильтра в соответствии с протоколом производителя. Поместите колонку в стерильную пробирку объемом 1,5 мл и загрузите в колонку 24 мкл образца.
   2. Чтобы очистить РНК, центрифугируйте при давлении 800 x g в течение 3 мин и выбросьте колонку. Очищенные РНК находятся в элюанте.

5. Реакция обратной транскрипции (ОТ)

ПРИМЕЧАНИЕ: Следующая настройка реакции RT (см. Таблицу материалов) соответствует протоколу производителя с незначительными изменениями, обеспечивающими совместимость с AQRNA-seq.

1. Приготовьте реакцию отжига ОТ-праймера в стерильной ПЦР-пробирке, добавив 24 мкл матричных РНК (продукты из стадии 4), 1 мкл 2 мкМ праймера ОТ (табл. 1) и 1 мкл dNTP (по 10 мМ каждого типа нуклеотидов).
2. Инкубировать при 80 °C в течение 2 мин до отжига праймеров RT до матричных РНК, а затем немедленно охладить на льду в течение 2 мин.
3. Приготовьте реакцию RT, добавив в реакционную пробирку для отжига 6 мкл 5-кратного реакционного буфера, 1 мкл ингибитора РНКазы 40 Ед/мкл и 1 мкл обратной транскриптазы.
4. Инкубировать при 50 °C в течение 2 ч для обратной транскрибации РНК-матриц, а затем при 70 °C в течение 15 мин для инактивации фермента. Продукты ОТ (т.е. гибриды РНК-кДНК) могут храниться при температуре 4 °C или -20 °C в течение ночи.

6. Гидролиз РНК

1. Добавьте 1 мкл 5 М NaOH в гибрид РНК-кДНК (продукты из этапа 5). Инкубировать при температуре 93 °C в течение 3 мин для гидролиза нити РНК гибрида РНК-кДНК.
2. Добавьте 0,77 мкл 5 М HCl для нейтрализации реакции. После добавления HCl перемешайте и поверните вниз по трубке. Нейтрализация происходит мгновенно.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Рекомендуется проверить точное количество 5 М HCl, необходимое для нейтрализации 1 мкл NaOH (например, с помощью pH-полосок) в буферных условиях.
3. Очистите одноцепочечные кДНК с помощью колонки. Используйте набор для восстановления и очистки ДНК/РНК (см. Таблицу материалов). Следуйте протоколу, описанному в шаге 2.3, чтобы выполнить очистку колонки.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Комплекты, использующие технологию гелевой фильтрации для удаления концеваторов красителей из реакций секвенирования (см. Таблицу материалов), не могут быть использованы здесь из-за изменения pH на предыдущих этапах.
4. Скоростной вакуум очищенной кДНК до < 5 μл, а затем добавьте воду, не содержащую РНКазы, чтобы довести объем до 5 μл. Будьте осторожны, чтобы не отсосить кДНК до полной сухости.
5. Перенесите очищенные кДНК в стерильную ПЦР-пробирку. Очищенные кДНК могут храниться при температуре -20 °C до 1 недели.

7. Лигирование линкера 2 к 3'-концу кДНК

1. Приготовьте реакцию лигирования Linker 2 в стерильной ПЦР-пробирке, добавив 5 мкл кДНК (продукты из стадии 6), 1 л 50 мкМ Линкера 2 (Таблица 1), 2 мкл 10x T4 реакционного буфера ДНК-лигазы, 1 мкл 10 мМ АТФ, 9 мкл PEG8000 (50% раствор) и 2 мкл 400 ед/мкл ДНК-лигазы T4.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Реагенты могут быть превращены в мастер-смесь для облегчения обработки образцов. Не включайте PEG8000 и Т4 ДНК-лигазу в мастер-микс.
2. Инкубировать при 16 °C в течение 16 ч для лигирования Linker 2 к кДНК.
3. Очистите кДНК с помощью Linker-2-лигирования. Используйте набор для восстановления и очистки ДНК/РНК (см. Таблицу материалов). Следуйте протоколу, описанному в шаге 2.3, чтобы выполнить очистку колонки.

8. Удаление лишнего Линкера 2

1. Приготовьте реакцию деденилирования в стерильной ПЦР-пробирке, добавив 16 мкл кДНК, лигированных линкер-2, 2 мкл 10-кратного буфера 2 набора и 2 мкл 50 ед/мкл 5'-деденилазы. Инкубировать при 30 °C в течение 1 ч, чтобы удалить аденин на 5'-конце линкера 2.
2. Добавьте 2 мкл 30 U/μL RecJf в реакцию омертвения. Инкубировать при 37 °C в течение 30 минут, чтобы переварить избыток Linker 2. Добавьте в реакцию еще 2 мкл 30 ед/мкл RecJf.
3. Инкубировать при 37 °C в течение 30 минут, чтобы продолжить переваривание избытка Линкера 2, а затем при 65 °C в течение 20 минут, чтобы денатурировать фермент.

9. ПЦР-амплификация кДНК с помощью секвенирующих праймеров

1. Назначьте образцам праймеры для ПЦР. Для эффективного мультиплексирования каждый образец нуждается в уникальной комбинации прямых и обратных праймеров (Таблица 1).
2. Добавьте воду, не содержащую РНКазы, чтобы довести объем образца до 25 мкл. Сохраните 5 мкл каждого образца в стерильной ПЦР-пробирке в качестве резерва на случай, если потребуется повторить ПЦР.
3. Приготовьте реакцию ПЦР (см. Таблицу материалов для набора для ПЦР), добавив 20 мкл кДНК (продукты из стадии 8), 1 мкл прямого праймера 2,5 мкм, 1 мкл обратного праймера 2,5 мкм, 25 мкл 2x буфера ДНК-полимеразы, 2 мкл воды, не содержащей РНКазы, и 1 мкл ДНК-полимеразы.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Реагенты могут быть превращены в мастер-смесь для облегчения обработки образцов. Не добавляйте ДНК-полимеразу в мастер-смесь.
4. Проводят ПЦР с начальной денатурацией при 94 °С в течение 1 мин с последующим проведением 18 циклов денатурации при 98 °С в течение 20 с - отжиг при 58 °С в течение 20 с - удлинение при 68 °С в течение 1 мин.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Не амплифицируйте ПЦР за пределами линейного диапазона. В общей сложности 18 циклов будут оптимальными для большинства экспериментов, но это может зависеть от контекста.
5. Скоростно вакуумируйте ПЦР-продукты до менее чем 25 μл, а затем добавьте воду, не содержащую РНКазы, чтобы довести объем до 25 μл. Переложите 5 μЛ ПЦР-продуктов в стерильную пробирку объемом 0,5 мл для проверки распределения по размерам (см. шаг 9.6). Храните оставшиеся 20 мкл продуктов ПЦР при температуре -20 °C до дальнейших действий.
6. Проверьте распределение продуктов ПЦР по размерам, как описано ниже.
   1. Приготовьте 3% агарозный гель в буфере TAE.
      ПРИМЕЧАНИЕ: В этом протоколе бромид этидия (EtBr) используется для окрашивания гелем после электрофореза (см. шаг 9.6.5). Соответствующие красители ДНК могут быть добавлены в раствор геля на этом этапе или использованы для окрашивания гелем позже.
   2. Смешайте 1 мкл 6-кратного загрузочного красителя с 5 мкл продуктов ПЦР (начиная с шага 9.5) и загрузите гель со смесью.
   3. Загрузите 5 мкл ДНК-трапов в лунку перед первым образцом и в лунку после последнего образца. Используйте лестницы ДНК 50.о. или 100.о., чтобы обеспечить улучшенную дискриминацию по размеру продуктов ПЦР в диапазоне от 150 до 300.о.
   4. Запустите гель-электрофорез для определения местоположения продуктов ПЦР. Соответствующее условие выполнения может зависеть от контекста. Здесь работайте при напряжении 120 В, 400 мА в течение 75 минут для гелевой плиты размером 17,78 см (ширина) x 10,16 см (высота) x 1 см (толщина).
   5. Поместите гель в коробку и заполните коробку деионизированной (DI) водой до полного погружения геля. Добавьте 10 μL EtBr в деионизированную воду, пропитанную гелем. Оберните коробку фольгой и поставьте ее на шейкер. Окрашивайте гель в течение 30 минут, встряхивая.
   6. Выбросьте отходы, содержащие EtBr, в бутылку для отходов, помещенную в вытяжной шкаф. Промойте гель деионизированной водой один раз и слейте воду, содержащую EtBr, в бутылку для отходов.
   7. Заполните коробку водой DI до полного погружения геля. Оберните коробку фольгой и поставьте ее на шейкер. Смойте гель в течение 10 минут, встряхивая.
   8. Слейте воду, содержащую EtBr, в бутылку для отходов в вытяжном шкафу. Используйте гелевый тепловизор для визуализации полос. Получите изображение геля с высоким разрешением.

10. Очищение гелем

1. Приготовьте 3% агарозный гель в буфере TAE. Приготовьте гель толщиной 1 см с помощью широких гребней (толщина 1 мм; ширина 5 мм; глубина 15 мм) таким образом, чтобы каждая лунка могла содержать не менее 25 μл смеси красителей для загрузки образцов.
2. Смешайте 4 мкл 6-кратного загрузочного красителя с 20 мкл продуктов ПЦР (начиная с шага 9.5) и загрузите смесь в гель. Оставляйте пустые полосы между образцами, чтобы свести к минимуму перекрестное загрязнение во время иссечения геля.
3. Загрузите лестницы ДНК, запустите гель-электрофорез, покрасьте и промойте гель, а также сделайте изображения геля, как описано в шаге 9.6.
4. Удалите гелевые блоки, содержащие продукты ПЦР в пределах целевого диапазона размеров. Для минимизации контаминации димерами праймеров (линкеры 175.о. без вставок) экстрагируют продукты ПЦР размером более 195.о. (175.о. линкеров + 20.н. микроРНК).
5. Очистите продукты ПЦР с помощью экстракции гелем. Используйте набор для экстракции геля (см. Таблицу материалов). Протокол очистки основан на протоколе производителя с незначительными изменениями для совместимости с AQRNA-seq. Все этапы центрифугирования следует проводить при 17 900 x g в течение 1 мин с использованием настольной центрифуги при комнатной температуре, если не указано иное. Выполните действия, описанные ниже.
   1. Измерьте вес гелевых блоков внутри пробирок. Добавьте 6 объемов Buffer QG (входит в комплект) в 1 объем гелевого блока (1 мг геля составляет примерно 1 μл).
   2. Выдерживать при температуре 50 °C в течение 10 мин или до полного растворения гелевых блоков. Делайте вихревые трубки каждые 2 минуты для облегчения растворения геля. После растворения геля смесь должна напоминать цвет Buffer QG без растворенного геля. Если цвет оранжевый или фиолетовый, добавьте 10 мкл 3 М ацетата натрия (pH = 5,0) и тщательно перемешайте.
   3. Добавьте в смесь 1 гель объема изопропанола и тщательно перемешайте. Поместите спиновую колонку в сборную пробирку объемом 2 мл (входит в комплект).
   4. Чтобы связать ДНК, нанесите образец (до 750 мкл каждый раз) на колонку и центрифугу. Выбросьте проточный поток и поместите колонну обратно в ту же сборную трубу. Максимальное количество геля на спин-колонку составляет 400 мг.
   5. Добавьте 500 μL Buffer QG в колонку и центрифугу. Выбросьте проточный поток и поместите колонну обратно в ту же сборную трубу.
   6. Чтобы смыть загрязнения, добавьте в колонку 750 μL Buffer PE (входит в комплект) в колонку, дайте колонке постоять 5 минут и центрифугируйте. Выбросьте проточный поток и поместите колонну обратно в ту же сборную трубу. Еще раз центрифугируйте для удаления остатков промывочного буфера.
   7. Поместите колонку в стерильную пробирку объемом 1,5 мл. Чтобы элюировать ДНК, добавьте 30 μL Buffer EB (входит в комплект) в центр мембраны колонки, дайте колонке постоять 4 минуты и центрифугируйте.
   8. Speed-vac и ресуспендирование очищенных гелем продуктов ПЦР в 12 мкл Buffer EB.
6. Измерьте концентрацию сконструированных библиотек с помощью УФ-видимой спектрофотометрии и/или флуориметрического количественного анализа.

11. Библиотечное секвенирование

1. Отправьте созданные библиотеки во внешний центр секвенирования для оценки качества и секвенирования Illumina. Чтобы обеспечить достаточную чувствительность при количественном картировании малых РНК-ландшафтов, выбирайте парное секвенирование с чтением 75.о. с каждого направления (т.е. PE75), стремясь получить не менее 1,5 млн прочтений необработанной последовательности в каждом направлении для каждого образца. Используйте пользовательские праймеры (Таблица 1) для секвенирования NextSeq, но это необязательно для секвенирования в MiSeq.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Секвенирование может быть выполнено с помощью платформ MiSeq или NextSeq500. Выбор платформы может зависеть от характера образцов и общего количества образцов.

12. Конвейер анализа данных

ПРИМЕЧАНИЕ: На рисунке 2 представлена графическая иллюстрация упрощенных процедур, задействованных в конвейере анализа данных, который принимает в качестве входных данных необработанные последовательности (в формате FASTQ) и генерирует матрицу распространенности со строками, представляющими члены малых видов РНК, представляющими интерес, и столбцами, представляющими образцы. Для парного секвенирования каждый образец соответствует двум файлам FASTQ, один для прямого чтения, а другой для обратного чтения. Полный конвейер анализа данных со всеми связанными скриптами и руководством с подробными аннотациями для каждого шага доступен на GitHub (https://github.com/Chenrx9293/AQRNA-seq-JoVE.git).

1. Извлекайте необработанные чтения последовательностей из внешнего центра секвенирования и оценивайте качество секвенирования с помощью программ с открытым исходным кодом, таких как FastQC¹⁴ или fastp¹⁵.
2. Создание библиотеки опорных последовательностей в формате FASTA.
   Примечание: Ключом к адаптивности конвейера к различным классам малых РНК является подходящая библиотека референсных последовательностей. Для получения точных оценок численности членов конкретных классов РНК, представляющих интерес (например, микроРНК), ожидается, что пользователи будут тщательно курировать библиотеку референсных последовательностей для использования с конвейером. Все остальные инструкции для выполнения конвейера остаются согласованными для разных классов малых РНК.
3. Создайте каталог с именем AQRNA-seq для реализации конвейера анализа данных и поместите в него все скрипты, отфильтрованные по качеству чтения последовательностей и библиотеку ссылочных последовательностей. Следуйте подробным инструкциям на GitHub (https://github.com/Chenrx9293/AQRNA-seq-JoVE.git) для подготовки подкаталогов и внесения существенных изменений в файлы для нацеливания на различные организмы и/или малые виды РНК, а также для совместимости операционной системы и/или планировщика заданий.
4. Реализуйте конвейер анализа данных, следуя инструкциям, описанным в руководстве на GitHub (https://github.com/Chenrx9293/AQRNA-seq-JoVE.git), которое содержит описания, входные и выходные файлы, а также командные строки для каждого шага. Таким образом, конвейер включает в себя (i) обрезку линкерных последовательностей и случайных нуклеотидов из прочтений, (ii) фильтрацию прочтений на основе их длины, (iii) отображение прочтений на референсные последовательности, (iv) разрешение неоднозначных отображений и (v) генерацию матрицы распространенности.

Результаты

Mycobacterium bovis Штамм БЦЖ (bacilli de Calmette et Guérin) 1173P2, претерпевающий экспоненциальный рост, подвергался временным рядам (0, 4, 10 и 20 дней) питательного голодания с последующей 6-дневной реанимацией в богатой питательными веществами среде, как это было представлено ранее в Hu et ^al.7. Малые РНК были выделены из бактериальной культуры с тремя биологическими репликами в каждой из пяти обозначенных временных точек. Библиотеки Illumina были сконструированы с использованием описанного выше рабочего процесса подготовки библиотеки AQRNA-seq (рис. 1) с последующим секвенированием на секвенсоре в Центре BioMicro Массачусетского технологического института. Затем данные секвенирования были обработаны с помощью конвейера анализа данных AQRNA-seq (рис. 2), настроенного для количественной оценки распространенности тРНК.

После ПЦР-амплификации библиотеки кДНК с помощью праймеров секвенирования во всех образцах наблюдалось присутствие продуктов ПЦР размером 175 пар оснований (.н.), что свидетельствует об образовании димеров праймеров. Чтобы уменьшить перенос димеров праймеров, продукты ПЦР размером более 195.о. вырезали из геля и очищали (рис. 3B).

Отфильтрованные по качеству и обрезанные последовательности были сопоставлены с пользовательской библиотекой референсных последовательностей, включающей 45 изоакцепторов тРНК, внутренний стандарт и контрольные последовательности (т.е. 23S рРНК, 16S рРНК, 5S рРНК, rnpB и ssr). Изоакцепторы тРНК составляли от 10,5% до 40,2% от общего числа картированных прочтений данного образца и показали гораздо более высокую распространенность, чем контрольные последовательности (рис. 4). Важно отметить, что относительно низкие доли изоакцепторов тРНК при считывании можно объяснить более высокой относительной распространенностью внутренних стандартов. Таким образом, считанные пропорции изоакцепторов тРНК относительно внутренних стандартов (рис. 4, розовые и зеленые цветовые блоки) могут контролироваться оператором путем тонкой настройки количества внутреннего стандарта, вносимого в реакцию.

Данные о распространенности необработанных тРНК нормализовали с использованием метода медианы отношений, реализованного в версии пакета DESeq2 (далее обозначается как v)^{1.36.0 16} в R Statistical Programming Environment (далее – R) v 4.2.1¹⁷. После нормализации достигается количественный ландшафт изоакцепторов тРНК в БЦЖ Mycobacterium bovis во время нутриентного голодания и реанимации (рис. 5).

Чтобы выявить различные кластеры образцов с различными фенотипами на основе закономерностей в распространенности изоакцепторов тРНК, был проведен анализ главных компонент (PCA) нормализованных данных о распространенности тРНК с использованием пакета stats v 4.2.1¹⁷ in R (рис. 6). В ходе анализа были выделены образцы 0-го дня голодания и 6-го дня реанимации из образцов 4-го, 10-го и 20-го дней голодания, что свидетельствует о значительной разнице в ландшафте тРНК Mycobacterium bovis BCG, выращенных в среде, лишенной питательных веществ, и в среде, богатой питательными веществами.

Для профилирования динамики распространенности каждого изоакцептора тРНК в пяти обозначенных временных точках был проведен дифференциальный анализ экспрессии нормализованных данных о распространенности тРНК с использованием пакета DESeq2 v 1.36.0 в R (рис. 7). Анализ показал, что 17 из 20 семейств изоакцепторов содержали изоакцепторы, которые дифференциально экспрессировались (т.е. значительно повышались или понижались) по крайней мере в одном из временных моментов, что предполагает потенциальную роль регуляции пула тРНК в персистирующем состоянии Mycobacterium bovis BCG при туберкулезе.

Рисунок 1: Схема рабочего процесса подготовки библиотеки AQRNA-seq. Ключевые шаги, описанные в рабочем процессе, перечислены в центре схемы и соединены с соответствующими графическими иллюстрациями пунктирными линиями. Подробное описание каждого шага можно найти в разделе Протокол. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этой цифры.

Рисунок 2: Схема конвейера анализа данных AQRNA-seq. Основные этапы, описанные в конвейере, перечислены в центре схемы и соединены с соответствующими графическими иллюстрациями пунктирными линиями. Подробное описание каждого шага доступно на GitHub (https://github.com/Chenrx9293/AQRNA-seq-JoVE.git). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этой цифры.

Рисунок 3: Электрофорез фрагментов кДНК в агарозном геле после амплификации ПЦР с секвенированием праймеров. (A) Изображение геля до экстракции и очистки геля. Дорожки 7 и 14 с левой стороны содержат 5 μL из 50.о. лестницы ДНК, в то время как другие дорожки содержат по 20 μL каждого из 15 образцов. Размерная локализация продуктов ПЦР указывает на их максимальную концентрацию в диапазоне от 175.о. (димеры праймеров) до 300.о. (два праймера + 120.о. 5S рРНК). (Б) Изображение геля после экстракции и очистки геля. Для каждого образца гелевый блок в диапазоне от 200 до 400.о. был исключён, чтобы свести к минимуму загрязнение димерами праймеров в библиотеке секвенирования. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этой цифры.

Рисунок 4: Количество успешно сопоставленных операций чтения последовательностей с библиотекой эталонных последовательностей. По оси X отображаются названия образцов (например, D18-69XX), сгруппированных по временным точкам (например, День голодания 0). Для каждой выборки количество прочтений, связанных с различными категориями целевых предметов, представлено с помощью цветных блоков, расположенных друг над другом. Числа, расположенные в центре цветовых блоков, представляют собой пропорции прочтений, соответствующих соответствующим целевым объектам в данной выборке. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этой цифры.

Рисунок 5: Количественный ландшафт изоакцепторов тРНК Mycobacterium bovis BCG в различные моменты времени голодания и реанимации. Данные о распространенности необработанных тРНК нормализовались с помощью метода медианы отношений. Здесь каждая строка изображает нормализованное содержание тРНК (ось y) в виде среднего ± стандартной ошибки для 3 биологических репликатов в каждый момент времени. По оси x изоакцепторы из одного семейства были сгруппированы вместе и помечены соответствующей аминокислотой. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этой цифры.

Рисунок 6: Квадратичный косинусный график образцов, полученных в результате анализа главных компонент (PCA). ПЦА проводили на основе нормализованного содержания тРНК. Квадрат косинуса указывает на важность главных компонент для образцов, и образцы были построены относительно квадрата косинуса первых двух главных компонентов. Образцы были помечены с использованием идентификаторов образцов и цветовой кодировкой по временным точкам. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этой цифры.

Рисунок 7: Дифференциальная экспрессия изоакцепторов тРНК в разные моменты времени. Нормализованное содержание тРНК было обобщено в виде средних значений (линейных узлов) ± стандартной ошибки (полос погрешностей) по 3 биологическим репликам. Из-за ограниченности места условия были сокращены следующим образом: S0-S20 = голодные дни 0-20; R6 = 6-й день реанимации. Дифференциальный анализ экспрессии был проведен для каждого изоакцептора тРНК, сравнивая различные временные точки попарно с использованием теста отношения правдоподобия и теста Вальда. Компактные буквы использовались для представления статистической значимости, когда распространенность данного изоакцептора тРНК в моменты времени, имеющие по крайней мере одну общую букву, существенно не отличались друг от друга. Например, содержание тРНК-Lys-CTT-1-1 (в лизиновой панели) было значительно снижено от S0 до S4 и от S4 до S10, но не от S10 до S20. Затем он был значительно отрегулирован с S20 до R6. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этой цифры.

Таблица 1: Олигонуклеотиды, участвующие в процессе подготовки библиотеки AQRNA-seq. Внутренним стандартом является РНК, в то время как все остальные олигонуклеотиды являются ДНК. Перечисленные праймеры для ПЦР и пользовательские праймеры для секвенирования специфичны для платформ секвенирования. Дополнительные праймеры для ПЦР могут быть разработаны с помощью новых индексных последовательностей. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы скачать эту таблицу.

Обсуждение

Рабочий процесс подготовки библиотеки AQRNA-seq предназначен для максимального захвата РНК в образце и минимизации падения полимеразы во время обратной транскрипции⁷. С помощью двухэтапного линкерного лигирования новые олигонотиды ДНК (Линкер 1 и Линкер 2) лигируются в избытке, чтобы полностью комплементировать РНК в образце. Избыток линкеров может быть эффективно удален с помощью RecJf, экзонуклеазы от 5' до 3', специфичной для одноцепочечных ДНК, оставляя лигированные продукты нетронутыми. Кроме того, обработка AlkB уменьшает метильные модификации на РНК¹⁸, которые могут вызывать падение полимеразы во время обратной транскрипции, и, таким образом, облегчает проблему артефактных усеченных продуктов кДНК. AQRNA-seq представляет собой первый зарегистрированный метод систематической оптимизации эффективности лигирования и амплификации. AQRNA-seq был проверен на его количественную точность и отсутствие артефактов смещения, и было показано, что он является наиболее точным применением для исследований профилирования микроРНК.

AQRNA-seq является особенно обширным приложением, и рекомендуется соблюдать оперативную осторожность на чувствительных к температуре и/или времени этапах подготовки библиотеки. В частности, стадии, предшествующие синтезу кДНК (рис. 1; этапы 1-4), когда образцы содержат изначально нестабильную одноцепочечную РНК (ссРНК) или ДНК-линкер-лигированную одноцепочечную РНК, должны выполняться без ненужных перерывов. Гидролиз РНК (рис. 1; шаг 6) с использованием прочного основания при высокой температуре очень эффективен при расщеплении матриц РНК после обратной транскрипции¹⁹. Тем не менее, необходимо соблюдать осторожность, чтобы избежать длительного воздействия на образец сильного основания и замедленной нейтрализации сильной кислотой, особенно при большом количестве образцов. В целом, настоятельно рекомендуется готовить все реакции на льду и избегать повторных циклов замораживания-оттаивания для промежуточных продуктов библиотеки.

Выборка промежуточных продуктов библиотеки в ключевых точках рабочего процесса рекомендуется для проверки качества и своевременного устранения неполадок в процессе. Анализ образцов с помощью автоматизированных инструментов для электрофореза может определить успех и эффективность линкерного лигирования (рис. 1; шаги 2 и 7). Визуализация локализации индексированных продуктов кДНК после добавления ПЦР секвенирующих праймеров (рис. 1; шаг 9) с помощью электрофореза в агарозном геле может помочь в оценке адекватности циклов ПЦР, а также в выявлении возможной деградации образцов и/или наличия димеров праймеров. Праймеры для ПЦР и секвенирования могут быть перепроектированы для обеспечения совместимости с платформой для секвенирования, которую представляет оператор.

Отчасти из-за особенностей проектирования, связанных с подготовкой библиотеки, конвейер анализа данных AQRNA-seq был в основном построен на основе пользовательских скриптов, включающих лишь несколько существующих программ биоинформатики. Тем не менее, для выравнивания чтения последовательностей по библиотеке эталонных последовательностей был использован инструмент Basic Local Alignment Search Tool (BLAST)²⁰ из-за его различных преимуществ, которые удовлетворяют специфические потребности анализа данных AQRNA-seq. К ним относятся (i) способность выравнивать чтения короче 20.о. и выполнять выравнивание подстрок, (ii) разумная обработка неоднозначных оснований (N), (iii) немного более высокая точность выравнивания и (iv) информативный вывод, обеспечивающий существенные детали, такие как несоответствия и пробелы, что способствует разнообразному анализу последующих процессов.

В частности, остается несколько проблем проектирования как в процессе подготовки библиотеки, так и в конвейере анализа данных AQRNA-seq, которые требуют дальнейшей оптимизации и представляют собой фокус текущей работы. Во-первых, превосходная количественная точность AQRNA-seq по сравнению с традиционными методами RNA-seq была достигнута при 50-75 нг ввода малых РНК, в то время как в настоящее время этот рабочий процесс тестируется с уменьшенным количеством входных РНК для повышения его чувствительности и с более длинными РНК для расширения его полезности. Во-вторых, хотя посттранскрипционное метилирование удаляется ферментативно с помощью AlkB, существуют и другие модификации РНК, которые могут вызывать снижение полимеразы во время обратной транскрипции^. Это может привести к образованию артефактных усеченных продуктов кДНК, которые не могут быть эффективно дифференцированы от биологически значимой 5'-деградации полноразмерных тРНК. Таким образом, в настоящее время оцениваются несколько возможных путей дальнейшего улучшения процессивности обратной транскриптазы на предмет эффективности и совместимости с AQRNA-seq. В-третьих, удаление димеров праймера путем экстракции и очистки гелем неэффективно и неизменно приводит к потере целевых фрагментов и увеличению вариабельности между библиотеками. Таким образом, уменьшение потенциального переноса димеров праймера без потери фрагментов мишени дает возможность еще больше повысить чувствительность и количественную точность AQRNA-seq. Важно отметить, что как обработка AlkB, так и экстракция и очистка гелем являются трудоемкими, что делает их неоптимальными для обработки большого количества образцов. Благодаря улучшениям, достигнутым в вышеуказанных областях, в будущем будет обеспечена автоматизация и высокопроизводительная обработка метода AQRNA-seq. Постоянное совершенствование конвейера анализа данных ставит во главу угла повышение эффективности, количественной точности и гибкости. В то время как текущий конвейер эффективно отсекает 3'-адаптеры от прочтений последовательности, подмножество прочтений также обладает 5'-адаптерными последовательностями, вероятно, из-за неадекватной блокировки 3'-конца линкеров во время лигирования. Наличие 5'-последовательностей адаптеров может поставить под угрозу количественную точность, влияя на выравнивание чтения последовательностей. Таким образом, адекватное удаление как 3', так и 5' последовательностей адаптеров будет гарантировано за счет использования дополнительных инструментов для обрезки адаптеров, таких как Cutadapt²¹. Для повышения эффективности в пересмотренном конвейере будут интегрированы рациональные стратегии сокращения вычислительного времени. Это включает в себя этап сборки парного конечного чтения для объединения прямых и обратных чтений путем выявления значительного перекрытия и извлечения уникальных последовательностей вместе с их вхождениями в каждой библиотеке. Ожидается, что такие стратегии значительно сократят время вычислений на последующих этапах за счет исключения избыточного анализа (i) операций чтения с обоих направлений и (ii) дублированных последовательностей, которые могут доминировать в пуле чтения последовательностей библиотек AQRNA-seq. В дальнейшем синергетическая оптимизация как рабочего процесса подготовки библиотеки, так и конвейера анализа данных AQRNA-seq, вероятно, откроет разнообразные возможности в строгом количественном исследовании всех форм РНК (например, транскриптома, фрагментов тРНК и редких видов РНК, таких как циркулирующие опухолевые РНК), картировании модификаций тРНК и других ключевых областях биологии биомаркеров и открытий.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье

Имя	Компания	Каталожный номер	Комментарии
2-кетоглутарат	Sigma-Aldrich	75890	Приготовить рабочий раствор (1 М) и хранить его при -20°М; C
2100 Биоанализатор Agilent		G2938C
Аденозин 5'-трифосфат (АТФ)	New England Biolabs	M0437M (компонент #: N0437AVIAL)	NEB M0437M содержит Т4 РНК-лигазу 1 (30 U/μ L), Т4 РНК-лигаза реакционный буфер (10X), PEG 8000 (1X) и АТФ (100 мМ); приготовить рабочий раствор (10 мМ) и хранить его при -20°М; C
AGAROSE GPG/LE	AmericanBio	AB00972-00500	Хранить при температуре окружающей среды
гексагидрат сульфата аммония железа(II)	Sigma-Aldrich	F2262	Приготовить рабочий раствор (0,25 М) и хранить его при температуре -20°С; C
Биоанализатор для анализа малых РНК	Agilent	5067-1548	Анализ малых РНК используется для проверки качества входных РНК и эффективности ферментативных реакций (например, лигирование по линкеру 1)
Бычий сывороточный альбумин (BSA; 10 мг/мл)	New England Biolabs	B9000	Этот продукт был снят с производства 15.12.2022 и заменен на рекомбинантный альбумин, класс молекулярной биологии (NEB B9200).
Хлороформ	Макрон Файн Кемикалс	4441-10
Деметилаза	ArrayStar	AS-FS-004	поставляется с предварительной обработкой тРНК rtStar и Набор для синтеза кДНК первой нити (AS-FS-004)
Смесь растворов дезоксинуклеотидов (dNTP)	New England Biolabs	N0447L (компонент #: N0447LVIAL)	Эта смесь растворов dNTP содержит эквимолярные концентрации dATP, dCTP, dGTP и dTTP (10 мМ каждая)
Цифровой двойной тепловой блок	VWR Scientific Products	13259-052	Нагревательный блок используется с QIAquick  Набор для экстракции геля
DyeEx  2.0 Набор для вращений	Qiagen	63204	Эффективен при удалении коротких остатков (например, олигонукосов длиной менее 10.н.)
Источник питания для электрофореза	Bio-Rad Labrotories	PowerPac 300
Eppendorf PCR Tubes (0,5 мл)	Eppendorf	0030124537
Eppendorf Safe-Lock Tubes (0,5 мл)	Eppendorf	022363611
Eppendorf Safe-Lock Tubes (1,5 мл)	Eppendorf	022363204
Eppendorf Safe-Lock Tubes (2 мл)	Eppendorf	022363352
Этиловый спирт (этанол), чистый	Sigma-Aldrich	E7023	Чистый этанол используется с набором Oligo Clean and Concentrator Kit от Zymo Research
Система визуализации геля	Alpha Innotech	FluorChem 8900
Gel Loading Dye, фиолетовый (6X), без SDS	New England Biolabs	N0556S (компонент #: B7025SVIAL)	NEB N0556S содержит Quick-Load Purple 50 bp DNA Ladder и Gel Loading Dye, фиолетовый (6X), без SDS
GENESYS 180 UV-Vis Spectrophotometer	Thermo Fisher Scientific	840-309000	Спектрофотометр используется для измерения концентраций олиго по закону
Пива HEPES	Sigma-Aldrich	H4034	Приготовить рабочий раствор (1 М; рН=8 с NaOH) и хранить его при -20 °°; C
Соляная кислота (HCl)	Научные продукты VWR	BDH3028	Приготовить рабочий раствор (5 М) и хранить его при температуре окружающей среды
Изопропиловый спирт (изопропанол), чистый	Macron Fine Chemicals	3032-16	Изопропанол используется с QIAquick  Набор для экстракции геля
L-аскорбиновую кислоту	Sigma-Aldrich	A5960	Приготовьте рабочий раствор (0,5 М) и храните его при -20°М; C
Микроцентрифуга	Eppendorf	5415D
NanoDrop 2000 Спектрофотометр	Thermo Fisher Scientific	ND-2000
NEBuffer 2 (10X)	New England Biolabs	M0264L (компонент #: B7002SVIAL)	NEB M0264L содержит RecJf (30 U/μ L) и NEBuffer 2 (10X); хранить при -20 °DG; C
Вода без нуклеазы (не обработанная DEPC)	Thermo Fisher Scientific	AM9938
Олиго Клин & Комплект концентраторов	Zymo Research	D4061	Хранить при температуре окружающей среды
PEG 8000 (50% раствор)	New England Biolabs	M0437M (компонент #: B1004SVIAL)	NEB M0437M содержит Т4 РНК-лигазу 1 (30 U/μ L), Т4 РНК-лигаза реакционный буфер (10X), PEG 8000 (1X) и АТФ (100 мМ); приготовить рабочий раствор (10 мМ) и хранить его при -20°М; C
Пельтье Термоамплификатор	MJ Research	PTC-200
Фенол:хлороформ:изоамил  спирт 25:24:1 pH = 5,2	Thermo Fisher Scientific	J62336
Буфер PrimeScript (5X)	TaKaRa	2680A
Обратная транскриптаза PrimeScript	TaKaRa	2680A
QIAquick  Набор для экстракции геля	Qiagen	28704	Этот набор требует нагревательного блока и изопропанола для работы с
Quick-Load Purple 100 bp DNA Ladder	New England Biolabs	N0551S (компонент #: N0551SVIAL)
Quick-Load Purple 50 bp DNA Ladder	New England Biolabs	N0556S (компонент #: N0556SVIAL)	NEB N0556S содержит Quick-Load Purple 50 bp DNA Ladder и гелевый краситель, фиолетовый (6X), без SDS
RecJf  (30 U/μ L)	New England Biolabs	M0264L (компонент #: M0264LVIAL)	NEB M0264L содержит RecJf (30 U/μ L) и NEBuffer 2 (10X); хранить при -20 °DG;
Ингибитор С-РНКазы (мышь; 40 Ед/&м; L)	Биолаборатории Новой Англии	M0314L ( компонент #: M0314LVIAL)	Хранить при -20 °deg; C
SeqAMP  ДНК-полимераза	TaKaRa	638509	TaKaRa 638509 содержит SeqAMP  ДНК-полимераза  и SeqAMP  Буфер для ПЦР (2X)
SeqAMP  Буфер для ПЦР (2X)	TaKaRa	638509	TaKaRa 638509 содержит SeqAMP  ДНК-полимераза  и SeqAMP  ПЦР-буфер (2X)
Щелочная фосфатаза креветок (1 Ед/&м; L)	Биолаборатории Новой Англии	M0371L ( компонент #: M0371LVIAL)
Гидроксид натрия (NaOH)	Sigma-Aldrich	S5881	Приготовьте рабочий раствор (5 М) и храните его при температуре окружающей среды
T4 DNA Ligase (400 U/μ L)	Биолаборатории Новой Англии	M0202L ( компонент #: M0202LVIAL)	NEB M0202L содержит T4 DNA Ligase (400 U/μ L) и реакционный буфер ДНК-лигазы T4 (10X
)T4 реакционный буфер ДНК-лигазы (10X)	Биолаборатории Новой Англии	M0202L ( компонент #: B0202SVIAL)	NEB M0202L содержит T4 DNA Ligase (400 U/μ L) и Т4 ДНК-лигаза реакционный буфер (10X)
T4 РНК-лигаза 1 (30 U/μ L)	New England Biolabs	M0437M (компонент #: M0437MVIAL)	NEB M0437M содержит Т4 РНК-лигазу 1 (30 U/μ L), реакционный буфер РНК-лигазы T4 (10X), PEG 8000 (1X) и реакционный буфер АТФ (100 мМ)
T4 РНК-лигазы (10X)	New England Biolabs	M0437M (компонент #: B0216SVIAL)	NEB M0437M содержит РНК-лигазу Т4 1 (30 U/μ L), Т4 РНК-лигаза реакционный буфер (10X), PEG 8000 (1X) и АТФ (100 мМ)