Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.

Методическая статья

Хирургическая перфузия и изоляция поджелудочной железы свиньи для изоляции островков

2.3K просмотров

⸱

DOI:

10.3791/66350

⸱

7 июня 2024 г.

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Surgery, Section of Vascular Surgery, Washington University School of Medicine, 2CardioVascular Research Innovation in Surgery and Engineering Center, Washington University School of Medicine, 3Department of Medicine, Division of Nephrology, Washington University School of Medicine, 4Department of Medicine, Division of Endocrinology, Washington University School of Medicine, 5Department of Surgery, Section of Transplant Surgery, Washington University School of Medicine, 6Division of Molecular Cell Biology, Washington University School of Medicine, 7Department of Biomedical Engineering, Washington University McKelvey School of Engineering

В этой статье

Краткое содержание

Этот протокол содержит пошаговое руководство по приобретению поджелудочной железы свиньи для выделения и очистки островков.

Аннотация

Трансплантация островковых клеток поджелудочной железы является новым методом лечения диабета I типа; Однако она ограничена соответствием доноров и их доступностью. Ксенотрансплантация островков свиней представляет собой многообещающую альтернативу аллотрансплантации с потенциалом для крупномасштабного производства функциональных островков по требованию. Выход и жизнеспособность изолированных островков в значительной степени зависят от качества донорской поджелудочной железы и метода заготовки, в частности, от продолжительности времени теплой ишемии. Для улучшения сохранности органов и последующего выхода островков и жизнеспособности нами разработан протокол хирургической перфузии и резекции поджелудочной железы свиньи. Этот протокол использует прямую инфраренальную канюляцию аорты и перфузию органа, чтобы свести к минимуму время теплой ишемии и упростить процедуру для операторов, не имеющих обширного хирургического опыта. Последующая артериальная перфузия поджелудочной железы через аорту вымывает застоявшуюся кровь из микроциркуляторного русла, тем самым уменьшая тромбоз и окислительное повреждение тканей. В данной рукописи представлен подробный протокол хирургической перфузии и резекции поджелудочной железы свиньи с последующей изоляцией островков и очисткой.

Введение

Сахарный диабет 1 типа вызывается аутоиммунным разрушением бета-клеток поджелудочной железы1. Следовательно, пациенты зависимы от экзогенного инсулина, что подвергает их высокому риску колебаний гликемии с эпизодами гипер- и гипогликемии2. Островковая аллотрансплантация является потенциальным лекарством от диабета I типа; Тем не менее, ограниченная доступность доноров органов поджелудочной железы остается основным препятствием для широкого внедрения этой процедуры 2,3. Ксенотрансплантация островковых клеток от доноров свиней является многообещающей альтернативой, поскольку эти животные легко доступны. Оптимизация и масштабирование выделения островков поджелудочной железы свиней будут иметь решающее значение для прогрессирующей ксенотрансплантации островков.

Несмотря на то, что ранее было опубликовано несколько методов заготовки поджелудочной железы свиней, многие из этих процедур описывают панкреатэктомию после индукции сердечной смерти или обескровливания 4,5,6,7,8,9,10. Одним из основных недостатков этих методов является переменное теплое ишемическое время (WIT), возникающее между моментом сердечной смерти и началом внутриартериальной и/или внутрипротоковой инфузии консервирующего раствора. Даже 10 минут WIT негативно повлияют на урожайность островков и жизнеспособность5. Сведение к минимуму ВИТ требует быстрой перфузии поджелудочной железы с помощью консервирующего раствора. Во время забора органов брюшной полости канюляция аорты с последующей интракорпоральной перфузией раствором Университета Висконсина (UW) имеет решающее значение для удаления крови, предотвращения внутрисосудистого тромбоза, защиты от ишемического повреждения и минимизации клеточного повреждения11,12.

Предыдущие исследования показали, что во время получения поджелудочной железы свиньи промывание чревного ствола и верхней брыжеечной артерии под низким давлением раствором UW улучшает выход островков и чистоту4. Тем не менее, ранее опубликованные методы получения поджелудочной железы свиней включают открытую канюляцию аорты, которая может быть технически сложной, особенно для небольших свиней 13,14,15. В этой рукописи мы представляем подробный пошаговый протокол с сопутствующими визуальными средствами для хирургической перфузии и забора поджелудочной железы свиньи с последующей изоляцией и очисткой островков. Этот новый метод канюляции аорты во время изоляции поджелудочной железы был разработан специально для минимизации ВИТ и обеспечения возможности получения поджелудочной железы в бескровном поле в качестве средства максимизации выхода и жизнеспособности островковых клеток.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

Все процедуры, связанные с животными, одобрены Институциональным комитетом по уходу за животными и их использованию (IACUC) в Отделении сравнительной медицины Медицинской школы Вашингтонского университета. Для этой процедуры идеально подходят взрослые йоркширские свиньи весом от 35 до 35 кг; Тем не менее, протокол может быть адаптирован для свиней разных размеров в зависимости от контекста эксперимента. Вся процедура должна быть выполнена стерильно в условиях операционной.

1. Предоперационная подготовка и обезболивание

  1. Успокойте свинью коктейлем из 4 мг/кг тилетамина и золазепама, 20 мг/кг кетамина и 2 мг/кг ксилазина, вводимого внутримышечно.
  2. Установите периферический венозный доступ через ушную вену.
  3. Вызвать общую анестезию с помощью ингаляционного 1%-3% изофлурана в 100% кислороде и эндотрахеально интубировать свинью.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Может быть предпочтительно использовать пропофол или любой другой внутривенный индукционный агент вместо ингалянта для индукции для более гладкой процедуры индукции и интубации. Жизненно важные показатели, концентрацияCO2 в конце выдоха, сатурация кислорода и форма сердечной волны постоянно контролируются для оценки и поддержания глубины анестезии. Плоскость брюшной хирургии подтверждается с помощью прикроватного ультразвука.
  4. Побрейте и подготовьте свинью с хлоргексидина глюконатом от грудинной выемки до двустороннего паха.
  5. Накидывайте операционное поле с четким обзором всей брюшной полости (рисунок 1А).

2. Оперативная постановка и обнажение забрюшинного пространства

  1. Выполните лапаротомический разрез по средней линии (рисунок 1B).
    1. Используйте скальпель с 10 лезвиями и электрокаутерию, чтобы сделать срединную лапаротомию от мечевидного отростка до лобка. Позаботьтесь о том, чтобы изгиб разреза вокруг нижнего брюшного урогенитального отверстия.
  2. Выполните правое висцеральное вращение.
    1. Выведите наружу правую толстую кишку и тонкую кишку, завернув их в стерильное полотенце.
    2. Осторожно втяните толстую кишку и кишечник влево, чтобы обнажить правое забрюшинное пространство, избегая при этом перекрута кишечника или мальротации.
  3. Слейте воду из мочевого пузыря (по желанию).
    1. Если мочевой пузырь полон и оказывает воздействие на окружающую среду, зажмите мочевой пузырь между двумя щипцами Дебейки и используйте скальпель с 11 лезвиями, чтобы надрезать вентральную стенку мочевого пузыря.
    2. Поместите всасывающий наконечник Yankauer в мочевой пузырь для отвода мочи и декомпрессии мочевого пузыря.
  4. Установите абдоминальный ретрактор для облегчения оптимального обнажения правого забрюшинного пространства (рис. 1C).

3. Забрюшинная диссекция

  1. Начните забрюшинную диссекцию (рисунок 2А).
    1. С помощью электрокаутерии разрежьте брюшину справа от средней линии, от уровня правой почки до бифуркации аорты.
    2. Резко обнажают инфраренальную аорту, нижнюю полую вену (НПВ), правую почечную артерию и вену
  2. Получите круговой контроль дистального инфраренального отдела аорты с помощью петли большого сосуда.
  3. Лигейт IVC (рис. 2B).
    1. Получите круговой контроль средней инфраренальной НПВ.
    2. Лигируйте IVC с помощью шелкового галстука 2-0.
  4. Перевязка почечных сосудов (рисунок 2В).
    1. Получите круговой контроль над правой и левой почечными артериями и венами.
    2. Лигируйте эти конструкции с помощью шелковых галстуков 2-0.
    3. Если имеется несколько почечных артерий, аналогичным образом изолируйте и перевязайте каждый из этих сосудов.

4. Внутригрудная диссекция

  1. Надрезать правую гемидиафрагму (рисунок 3А).
    1. Аккуратно втяните печень вниз, чтобы обнажить правую гемидиафрагму. Наложите два зажима Аллиса на перепончатую часть правой гемидиафрагмы и надрежьте диафрагму между двумя зажимами с помощью электрокаутеризации.
    2. Удлините миотомию диафрагмы примерно на 7 см по горизонтали.
  2. Получите круговой контроль внутригрудного НПВ (рисунок 3В).
    1. Наденьте шелковый галстук 2-0 вокруг внутригрудного НПВ. Защелкните концы шва небольшим кровоостанавливающим средством, не закупоривая НПВ.
  3. Удлините диафрагму до левой гемидафрагматии (рисунок 3C).
    1. С помощью двух зажимов Allis отведите край диафрагмомотомии вниз и распространите на левую гемидиафрагму.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Избегайте попадания в перикард во время диафрагмотомии.
  4. Обнажите нисходящую грудную аорту в левой заднемедиальной области грудной клетки.

5. Канюляция инфраренальной аорты, висцеральная изоляция и перфузия

  1. Систематически проводят антикоагуляцию у свиньи.
    1. Вводят системный гепарин (100 ЕД/кг) через периферический венозный доступ. Подождите 3 минуты, прежде чем приступить к канюляции аорты.
  2. Доступ к инфраренальной аорте осуществляется с помощью иглы для микропункции 18 G (рис. 4A).
  3. Пропустите J-образную проволоку через иглу в аорту и извлеките иглу через проволоку.
  4. Поместите тубус 10Fr на провод в аорту и извлеките провод (рисунок 4B).
  5. Подсоедините трубку для внутривенного введения к тубусу 10Fr и стерильным образом введите раствор UW через тубус. Настаивать раствор UW со скоростью 40-60 капель/мин.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Поток не начнется до тех пор, пока грудная аорта не будет пережата. Убедитесь, что внутривенная трубка не находится под напряжением, чтобы избежать смещения внутриаортальной оболочки.
  6. Выполняйте висцеральную изоляцию и перфузию в быстрой последовательности.
    1. Зажмите подренальную аорту с помощью аортального зажима.
    2. Зажмите нисходящую грудную аорту с помощью аортального зажима.
    3. Перевяжите внутригрудной НПВ с ранее поставленной ничьей 2-0.
    4. Вводите 100 мг/кг KCl для эвтаназии через периферический венозный доступ.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Сердечная смерть начинается с введения KCl.
    5. Сделайте венотомию в инфраренальной НПВ, превосходящую завязку 2-0, и введите отсасывание через венотомию с бассейновым наконечником (Рисунок 4C).
    6. Перфузируйте внутренности 2-3 л холодного раствора УМ.
    7. Продолжайте диссекцию для тотальной панкреатэктомии во время перфузии.
      Примечание: Внутренние органы, и в частности поджелудочная железа, должны стать бледными по мере того, как раствор UW проникает в область солидных органов (Рисунок 5A).

6. Тотальная панкреатэктомия

  1. Освободите тонкую кишку от втягивания, пока раствор UW перфузирует.
  2. Начинайте диссекцию двенадцатиперстной, соединительной и селезеночной долей поджелудочной железы во время висцеральной перфузии. Втяните желудок сверху, чтобы обнажить поджелудочную железу. С помощью комбинации тупого рассечения и электрокаутеризации рассеките поджелудочную железу от ее сальниковых прикреплений.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Тело поджелудочной железы эффективно обхватывает воротную вену. Следите за тем, чтобы воротная вена не проходила кзади к доле двенадцатиперстной кишки, а затем спереди к мосту и соединительным долям.
  3. Изолируйте проток поджелудочной железы (рисунок 5B). Найдите проток поджелудочной железы в том месте, где он входит в двенадцатиперстную кишку. Перевязать воздуховод с помощью двух шелковых стяжек 3-0 и пересечь воздуховод между стяжками.
  4. Полная панкреатэктомия (рисунок 5C).
    1. Рассеките оставшуюся часть доле двенадцатиперстной кишки от С-петли двенадцатиперстной кишки до тех пор, пока она не станет свободно подвижной.
    2. Отделите поджелудочную железу от остальных ее прикреплений. Тщательно перевяжите и разделите мелкие сосуды от верхней брыжеечной артерии до поджелудочной железы.
    3. Отделите поджелудочную железу от воротной вены. Рассекаем тело поджелудочной железы и соединительную долю от воротной вены. Перевязывайте любые венозные ветви от воротной вены до поджелудочной железы, в том числе и селезеночную вену.
      1. Пересеките мостик поджелудочной железы между соединительной долей и долей селезенки, чтобы обеспечить свободную мобилизацию из воротной вены.
        ПРИМЕЧАНИЕ: Следите за тем, чтобы не нарушить работу двенадцатиперстной доли поджелудочной железы от селезеночной доли.
  5. Погрузите всю поджелудочную железу в холодный стерильный раствор UW, поместив контейнер сразу на лед. Транспортируйте поджелудочную железу в стерильный колпак для изоляции островков. Продолжайте изоляцию островков поджелудочной железы (Рисунок 6).

7. Канюляция протока поджелудочной железы

  1. Поместите поджелудочную железу на стерильный лоток на льду внутри шкафа биобезопасности.
  2. Удалите излишки фиброзной ткани и крови подальше от поджелудочной железы.
  3. При необходимости разрежьте проток поперечно, чтобы лучше визуализировать просвет. Найдите и введите канюлю в проток с помощью катетера соответствующего размера (16 G).
  4. Закрепите катетер на месте шелковой завязкой 2.0, но не закупоривайте просвет.
  5. Приготовьте три раствора для обеззараживания и погрузите канюлированную поджелудочную железу в каждый раствор для обеззараживания на 60 с.

8. Перфузия и растяжение поджелудочной железы

  1. Приготовьте ферментный раствор для расщепления (рисунок 6).
    1. Смешайте 100 мг коммерчески доступных растворов коллагеназы 1 и 2 (см. Таблицу материалов для получения более подробной информации) с желаемым количеством 1x HBSS и 10 000 ЕД раствора гепарина. Если выделенная ткань поджелудочной железы составляет от 100 г до 200 г, смешайте фермент с 200 мл 1x HBSS и раствором гепарина.
  2. Влейте раствор фермента в поджелудочную железу.
    1. При контролируемой умеренной силе ввести в проток поджелудочной железы раствор фермента в болюсах объемом 60 мл. Продолжайте этот процесс до тех пор, пока весь ферментный раствор не будет введен в поджелудочную железу.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Эффективная инфузия должна вызывать растяжение ткани поджелудочной железы.
    2. Если некоторое количество ферментного раствора вытекает из ткани поджелудочной железы в стерильный лоток, повторно введите этот оставшийся раствор в поджелудочную железу на шаге 8.3 или поместите его в камеру Рикорди на шаге 9.2.
  3. Непосредственно введите оставшийся раствор фермента в любые плохо расширенные сегменты панкреатической паренхимы с помощью иглы 22 G.

9. Пищеварение поджелудочной железы

  1. Поместите резервуар контура, содержащий 500 мл 1x HBSS, в водяную баню, установленную на 47 °C, для предварительного нагрева раствора резервуара.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Ферментный раствор оптимально функционирует при температуре 36-38 °C, и эта температура должна быть достигнута в течение 5 минут после запуска перистальтического насоса. Температура содержимого Ricordi, включая поджелудочную железу, наполненную ферментами, первоначально составляет 4 °C. При предварительном нагреве резервуара контура до 47 °C содержимое резервуара и камеры Ricordi смешивается, доводя температуру всего контура до 36-38 °C в течение 5 минут после запуска перистальтического насоса.
  2. Удалите и выбросьте катетер из протока поджелудочной железы и разрежьте поджелудочную железу на кусочки ~1-3 см.
  3. Подготовьте контур разложения. Перистальтический насос будет циркулировать раствор из резервуара контура сбраживания через нагревательный змеевик в камеру Рикорди (Рисунок 6).
  4. Поместите кусочки поджелудочной железы с девятью шариками из нитрида кремния диаметром 1,5 см внутрь камеры Ricordi и заполните до уровня фильтра оставшимся раствором фермента.
  5. Чтобы герметизировать камеру Ricordi, поместите сетчатый фильтр и резиновую прокладку, а затем крышку на камеру Ricordi. Закройте крышку камеры Ricordi, затянув винты, и убедитесь, что камера хорошо закрыта, прежде чем продолжить.
  6. Поместите нагревательный змеевик в водяную баню с температурой 47 °C.
  7. Поместите входные и выпускные канюли в резервуар для контура сбраживания, содержащий 500 мл 1x HBSS.
  8. Запускайте насос со скоростью расхода 450 мл/мин до тех пор, пока вся камера не будет заполнена раствором для разложения. Уменьшите расход до 100 мл/мин по мере циркуляции жидкости в контуре.
  9. Вручную встряхните камеру разложения, чтобы взбалтывать ткань шариками из нитрида кремния.
  10. Начиная с 8 минут пищеварения, возьмите образец объемом 1 мл из контурного резервуара для окрашивания дитизоном (DTZ) для контроля хода пищеварения.
    1. Чтобы приготовить окрашивание DTZ, растворите 10 мг DTZ в 2 мл диметилсульфоксида (ДМСО).
    2. Добавьте 10 мкл приготовленного красителя DTZ в 1 мл образца для разложения. Осмотрите образец при 4-кратном увеличении. Островки будут выглядеть от темно-красного до черного с окрашиванием DTZ.
      Примечание: Пищеварение завершено, когда большинство или все наблюдаемые островки «свободны» и неповреждены, а ацинарная ткань рассеивается на более мелкие кластеры.
  11. Когда разложение будет завершено, перенесите змеевик в ледяную ванну, удалите входную канюлю из резервуара и увеличьте скорость насоса до 210-250 мл/мин. Дайте переваренной ткани стечь из камеры Рикорди в резервуар контура.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Обычно после переваривания в камере Рикорди остается очень мало ткани. Как правило, остается <10% непереваренной ткани поджелудочной железы, хотя это может варьироваться в зависимости от специфических факторов.
  12. Взвесьте оставшуюся ткань, чтобы определить эффективность пищеварения. Переложите переваренную ткань из контурного резервуара в конические пробирки объемом 250 мл, которые охлаждаются на льду.

10. Забор ткани поджелудочной железы

  1. Переваренную ткань поджелудочной железы центрифугировать в конических пробирках объемом 250 мл при 250 × г в течение 1 мин при 4 °C без тормоза.
  2. С осторожностью извлекайте пробирки из центрифуги и аспирируйте надосадочную жидкость с помощью серологической пипетки, избегая при этом разрушения гранулы.
  3. Аккуратно суспензируйте гранулы в каждой конической трубке и объедините их в одну коническую трубку объемом 250 мл. Если ткани ≤50 мл, ресуспендируйте гранулу до общего объема 100 мл в растворе для сбора островков. Если ткани имеется >50 мл, ресуспендируйте гранулу до общего объема 200 мл в растворе для сбора островков. В случае, если собрано более 100 мл ткани, запустите два цикла очистки Cell Processor.
  4. Ресуспендируйте ткань в среде RPMI до получения общего объема 100 мл (при условии, что было собрано 50 мл ткани) и загрузите в клеточный процессор.

11. Очистка островков методом непрерывного градиента

  1. Подготовьте процессор ячеек в соответствии с инструкциями производителя.
  2. Загрузите 125 мл градиентного раствора высокой плотности в формовщик непрерывного градиента, затем загрузите градиентный раствор высокой плотности в процессор ячейки с помощью насоса, настроенного на 200 мл/мин.
  3. Запустите функцию центрифуги клеточного процессора со скоростью 1 000 об/мин.
  4. Выпустите воздух из системы и повторно загрунтуйте с помощью градиентного раствора высокой плотности.
  5. Добавьте 125 мл градиентного раствора высокой плотности и 130 мл градиентного раствора низкой плотности в образователь градиента.
  6. Загрузите 100 мл переваренной суспензии тканей.
  7. Увеличьте частоту процессора ячеек до 2 000 об/мин в течение 3 минут.
  8. Подготовьте 16 конических пробирок объемом 50 мл для сбора очищенной островковой фракции. Добавьте 25 мл среды RPMI в каждую пробирку и расположите все пробирки в порядке возрастания.
  9. Соберите очищенные островковые фракции в подготовленные для сбора конические пробирки.

12. Оценка островков и окрашивание

  1. Соберите 100-200 мкл аликвот из каждой из очищенных фракций островков и поместите их в 24-луночный планшет для культуры тканей для окрашивания DTZ для оценки содержания островков и из каждой фракции очистки. Осмотрите каждую фракцию с помощью световой микроскопии с 4-кратным увеличением. Островки будут выглядеть от темно-красного до черного цвета с окрашиванием DTZ.
  2. После того, как островки определены, выберите фракции с наибольшим содержанием островков. Очищенную фракцию центрифугировать при 250 × г в течение 1 мин при 4 °C без тормоза.
  3. Осторожно аспирируйте надосадочную жидкость и ресуспендируйте островковую гранулу в среде роста островков. Очищенные островки переложить в колбы для культуры Т-125.
  4. После очистки оцените островки на количество, жизнеспособность и функциональность.
    1. Используйте счетчик островковых клеток для оценки числа островков и распределения по размерам (рис. 7A). Целая поджелудочная железа обычно дает 1-2 миллиона островковых эквивалентов.
    2. Для окрашивания на жизнеспособность смешайте 2 мкл кальцеина AM и 2 мкл гомодимера-1 этидия (CaAM/EthD-1) с 1 000 мкл PBS (рис. 7B). Дайте островкам окраситься в течение 30 минут, затем оцените их с увеличением менее 4x или 10x. Жизнеспособные островки будут окрашиваться в зеленый цвет, в то время как нежизнеспособные островки будут окрашиваться в красный.

13. Культура клеток островков поджелудочной железы

  1. В течение первых 48 ч культивируйте островки в восстановительной среде при 37 °C для обеспечения достаточного количества питательных веществ (~1 000 островков/мл восстановительной среды).
  2. Со 2-го по 21-й день культивируйте островки в стандартной питательной среде при температуре 37 °C.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

Оперативная установка и срединная лапаротомия показаны на рисунке 1. Лапаротомический разрез должен быть изогнут, чтобы избежать урогенитального отверстия (Рисунок 1B). При настройке втягивающего устройства прикрепите стойку для втягивающего устройства Omni или Bookwalter к левому, нижнему углу стола. Идеальная ретракция включает в себя две ретракторные лопасти для правой брюшной стенки, две для левой брюшной стенки и 1-2 для правой толстой кишки и тонкой кишки,...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

Ксенотрансплантация островков поджелудочной железы с использованием доноров свиней является перспективной стратегией лечения сахарного диабета I типа. Выделение островков является сложной задачей, а конечная жизнеспособность и выход островков очень чувствительны к гипотензии и ишемии тканей, возникающим во время забора органов 16,17. Для оптимизации закупки и сохранения поджелудочной железы в этом протоколе представлен новый мето...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

Авторы не сообщают о конфликте интересов.

Благодарности

Эта рукопись была поддержана грантом на клинические инновации от Mid-America Transplant Foundation.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
1 М NaOH, 100 млMillipore Sigma1310-73-2
10x HBSS, 500 мл (от 15 до 30 ° C)Thermo Fisher14065056
1x D-PBS, 500 млThermo Fisher14200075
1x HBSS, 1 лThermo Fisher14025076
250 мл конические пробиркиMillipore SigmaCLS430236-6EA
Amphotericin B [50 мг]Millipore SigmaPHR1662
антисептик Повидон-йод 10%Millipore Sigma25655-41-8
BioRad Градиентный формерBioRad395
Дигидрат хлорида кальцияThermo Fisher10035-04-8
COBE Cell ProcessorEbay 317690 
Резервуар для контура сбраживания, бутылка Gibco, 1 лThermo Fisher10341001
диметилсульфоксидом (ДМСО)Thermo Fisher85190
ДитизонThermo Fisher60-10-6
Градиентный формовочный соединительный комплектBioRad1652008
гепарином [1000 ед/мл]Изделия для неотложной медицинской помощи0409-2720-01
HEPES Buffer (1 М), 100 млThermo Fisher15630080
Сывороточный альбумин человека 25%, 100 млCelprogenHSA2001-25-1
IsofluraneCovetrusАртикул #:11695067772
КетаминПаттерсонаАртикул #:07-894-8462
Либераза (100 мг)Millipore Sigma5401020001
ЖИВОЙ/МЕРТВЫЙ Набор для обеспечения жизнеспособности/цитотоксичностиThermo FisherL3224
Lympholyte 1.1 Media 500 млCedarlane LabsCL5020
Masterflex LS 16 ТрубкаMasterfle96419-16
Перистальтический насосMasterflex07522-30
PenStrep (2 мг/мл)CelprogenPS-30-002
Pulmozyme (1 мг/мл, 2,5 мл/флакон)Dornase Alfa8931278
восстановительная среда, PIM(R)Prodo Laboratories, Inc.PIM-R001GMP
RPMI 1640Millipore SigmaR8758-1L
Стандартная питательная среда, PIM(S)Prodo Laboratories, Inc.PIM-S001GMP
Tzed™ (тилетамин и золазепам) Инъекция CPattersonАртикул #:07-894-6240
Университет Висконсина (UW) раствор, 3 лGlobal Transplant Solutions1000-0046-06
Водяная баняSigma AlderichCLS6783-1EA
КсилазинПаттерсонАртикул #:07-891-6165

Ссылки

  1. Gillespie, K. M. Type 1 diabetes: pathogenesis and prevention. CMAJ. 175 (2), 165-170 (2006).
  2. Shapiro, A. M., Pokrywczynska, M., Ricordi, C. Clinical pancreatic islet transplantation. Nat Rev Endocrinol. 13 (5), 268-277 (2017).
  3. Shapiro, A. M., et al. Islet transplantation in seven patients with type 1 diabetes mellitus using a glucocorticoid-free immunosuppressive regimen. N Engl J Med. 343 (4), 230-238 (2000).
  4. Anazawa, T., et al. Improved method of porcine pancreas procurement with arterial flush and ductal injection enhances islet isolation outcome. Transplant Proc. 42 (6), 2032-2035 (2010).
  5. Dufrane, D., et al. Parameters favouring successful adult pig islet isolations for xenotransplantation in pig-to-primate models. Xenotransplantation. 13 (3), 204-214 (2006).
  6. Hilling, D. E., Rijkelijkhuizen, J. K., Tons, H. A., Terpstra, O. T., Bouwman, E. Porcine islet isolation outcome is not affected by the amount and distribution of collagen in the pancreas. Xenotransplantation. 17 (3), 250-255 (2010).
  7. Lamb, M., et al. In vitro maturation of viable islets from partially digested young pig pancreas. Cell Transplant. 23 (3), 263-272 (2014).
  8. Otsuka, R., et al. Pancreas preservation with a neutrophil elastase inhibitor, alvelestat, contributes to improvement of porcine islet isolation and transplantation. J Clin Med. 11 (15), 4290(2022).
  9. Vanderschelden, R., Sathialingam, M., Alexander, M., Lakey, J. R. T. Cost and scalability analysis of porcine islet isolation for islet transplantation: comparison of juvenile, neonatal and adult pigs. Cell Transplant. 28 (7), 967-972 (2019).
  10. Weegman, B. P., et al. Temperature profiles of different cooling methods in porcine pancreas procurement. Xenotransplantation. 21 (6), 574-581 (2014).
  11. Hart, N. A., et al. Determination of an adequate perfusion pressure for continuous dual vessel hypothermic machine perfusion of the rat liver. Transpl Int. 20 (4), 343-352 (2007).
  12. Tullius, S. G., et al. Accumulation of crystal deposits in abdominal organs following perfusion with defrosted University of Wisconsin solutions. Am J Transplant. 2 (7), 627-630 (2002).
  13. Ching, C. D., et al. A reliable method for isolation of viable porcine islet cells. Arch Surg. 136 (3), 276-279 (2001).
  14. Lu, Y., et al. Adult pig islet isolation. J Vis Exp. (176), (2021).
  15. Taylor, M. J., Baicu, S., Greene, E., Vazquez, A., Brassil, J. Islet isolation from juvenile porcine pancreas after 24-h hypothermic machine perfusion preservation. Cell Transplant. 19 (5), 613-628 (2010).
  16. Iwanaga, Y., Sutherland, D. E., Harmon, J. V., Papas, K. K. Pancreas preservation for pancreas and islet transplantation. Curr Opin Organ Transplant. 13 (4), 445-451 (2008).
  17. Pratschke, J., et al. Brain death and its influence on donor organ quality and outcome after transplantation. Transplantation. 67 (3), 343-348 (1999).
  18. vander Windt, D. J., et al. Early islet damage after direct exposure of pig islets to blood: has humoral immunity been underestimated. Cell Transplant. 21 (8), 1791-1802 (2012).
  19. Wright, M. J., Cavanagh, T. J., Fetterhoff, T. J., Wile, K. J. Effect of blood content on porcine pancreatic dissociation and islet yield. Transplant Proc. 26 (6), 3442(1994).
  20. Toso, C., et al. Isolation of adult porcine islets of Langerhans. Cell Transplant. 9 (3), 297-305 (2000).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Больше статей

Островки поджелудочной железыксенотрансплантацияканюляция аортыконсервация органовпереваривание поджелудочной железыочистка островковградиентное центрифугирование
Хирургическая перфузия и изоляция поджелудочной железы свиньи для изоляции островков
Связаться с нами
Порекомендовать библиотеке

Конфиденциальность

Условия использования

Политики

© 2026 MyJoVE Corporation. Все права защищены.