Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.

Методическая статья

Окрашивание Picrosirius Red для полуколичественной гистопатологической оценки отложения коллагена у мышей моделей хронического отторжения аллотрансплантата легкого

2K просмотров

⸱

DOI:

10.3791/66395

⸱

21 марта 2025 г.

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Thoracic Surgery, Medical Center - University of Freiburg, Faculty of Medicine, University of Freiburg, 2Department of Plastic and Hand Surgery, Medical Center - University of Freiburg, Faculty of Medicine, University of Freiburg, 3Department of Thoracic Surgery, Kyoto University Hospital, 4Department of Otolaryngology, Medical Center - University of Freiburg, Faculty of Medicine, University of Freiburg

* These authors contributed equally

В этой статье

Краткое содержание

Окрашивание Picrosirius Red является полуколичественным методом для объективной оценки отложения коллагена при мышином легочном фиброзном ремоделировании в пространственном разрешении. Помимо оценки общего отложения коллагена, окрашивание Picrosirius Red позволяет дифференцировать коллагеновые волокна разной толщины.

Аннотация

Фиброз является патофизиологическим признаком хронического отторжения после трансплантации легких и главным препятствием на пути к долгосрочному выживанию реципиента. Для изучения хронического отторжения доступно несколько моделей трансплантации легких у мышей. Тем не менее, они демонстрируют неоднородные результаты в отношении фиброзных изменений трансплантата, а гистологическая степень фиброза в основном сообщается качественно. Таким образом, пространственно разрешенный подход, который позволяет проводить статистический анализ, может помочь в оценке фиброза в этих моделях. В этом исследовании представлено окрашивание Picrosirius Red для полуколичественной оценки организации коллагена в аллотрансплантатах легких мышей и сравнение его со стандартными гематоксилином и эозином, трихромом Массона и окрашиванием Херовичи. Окрашивание проводили на срезах двух разных моделей трансплантации мышей на основе несоответствий малого и большого комплекса гистосовместимости (MHC). Метод был разработан для полуколичественного анализа организации коллагена в целых срезах легких. Таким образом, он может служить инструментом для мышиных экспериментальных моделей фиброзных заболеваний легких.

Введение

Трансплантация легких является определенным терапевтическим вариантом для пациентов, страдающих терминальной стадией заболевания легких. Тем не менее, долгосрочная выживаемость затруднена хроническим отторжением, затрагивающим 50% реципиентов в течение первых пяти послеоперационных лет1. Фиброзное ремоделирование мелких дыхательных путей и паренхимы легких является гистологическим признаком, лежащим в основе прогрессирующей потери легочной функции при хроническом отторжении аллотрансплантата легких2. Экспериментально хроническое отторжение аллотрансплантата легкого может быть смоделировано с помощью трансплантации ортотопического легкого мыши между несовпадающими линиями мышей MHC. Для достижения фенотипа хронического отторжения были предложены различные комбинации штаммов3. Среди них часто используется комбинация трансплантатов несоответствующего донора MHC C57BL/10 и реципиента C57BL/64. В качестве альтернативы, донорские легкие BALB/c могут быть пересажены реципиентам C57BL/6, получающим ежедневную иммуносупрессивную терапию5. Эти модели приводят к гистологически разной степени фиброзных изменений6. Об этих изменениях часто сообщают качественно с помощью стандартных Гематоксилина и Эозина, а также трихромного окрашивания Массона.

Стандартное гистологическое окрашивание гематоксилином и эозином позволяет рассмотреть образец, поскольку он окрашивает ядра в синий цвет, в то время как цитоплазма и коллагеновые волокна кажутся красными. При окрашивании трихромом Массона ядра окрашиваются в черный цвет, коллагеновые волокна окрашиваются в зеленый или синий цвета, а фон, включая цитоплазму, фибрин и мышцы, становится красным. Поскольку трихромное окрашивание Массона может привести к заниженным значениям, использование красителя Picrosirius Red считается полезным7. Picrosirius Red — это линейный анионный краситель, который связывается с длинными катионными коллагеновыми волокнами и обеспечивает контрастное красное окрашивание. Кроме того, окрашивание Picrosirius Red усиливает естественное двулучепреломление коллагеновых волокон под действием кроссполяризованного света8. Таким образом, можно оценить толщину коллагенового волокна и его упаковку. С помощью поляризационного фильтра фон становится темным, и становится возможным различить толщину отложенного коллагена. В то время как толстые коллагеновые волокна кажутся красными, тонкие коллагеновые волокна становятся зелеными при поляризации. В литературе часто описывается прямая связь между двойным лучепреломлением и подтипом коллагена, при этом красное двулучепреломление относится к коллагену I, а зеленое двулучепреломление — к коллагену III9.

Этот протокол описывает использование окрашивания Picrosirius Red для оценки фиброза в аллотрансплантатах легких мышей. В дополнение к традиционному гистологическому окрашиванию, он позволяет полуколичественно оценить фиброзные изменения у мышиных моделей хронического отторжения, обеспечивает возможность различать толстые и тонкие коллагеновые волокна всего за одно окрашивание, является экономически эффективным и простым в выполнении. Этот метод в равной степени может быть применен к другим экспериментальным моделям мышей, характеризующимся фиброзным ремоделированием паренхимы легких.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

Все протоколы для животных соответствуют этическим принципам 3R для гуманных исследований на животных и были одобрены местным ветеринарным этическим комитетом (Veterinäramt Kanton Zürich, Швейцария, исследование No 45/2014). Кроме того, читатели должны получить разрешение от соответствующих учреждений, прежде чем проводить какие-либо процедуры на лабораторных животных.

1. Получение образцов

  1. Проводите эксперименты на животных в соответствии с индивидуальными потребностями и соответствующим этическим одобрением. Один микрохирург выполняет все операции без дополнительного длительного времени ишемии.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Для воспроизведения наших репрезентативных результатов приобретите специфических взрослых самцов C57BL/6J, C57BL/10J и мышей BALB/c весом 27-30 г без патогенов от Charles River Laboratories. Для изотрансплантатов используйте животных C57BL/6J в качестве доноров и реципиентов. В модели с незначительными несоответствиями трансплантация донорских легких C57BL/10J реципиентам C57BL/6J. В основной несогласованной модели трансплантацию донорских легких BALB/c реципиентам C57BL/6J и послеоперационное введение циклоспорина (10 мг/кг/сут) и метилпреднизолона (1,6 мг/кг/сут) подкожно ежедневно5. Используйте физиологический раствор для перфузии и извлечения легких через 8 недель (56 дней).
  2. Для эвтаназии следует интубировать животное с помощью катетера 20G и проветрить его с помощьюО2 с добавлением 2%-3% изофлурана. Подтверждают достаточную глубину обезболивания отсутствием реакции на щипывание лапы.
  3. Выполните срединную лапаростернотомию, разрезав брюшную стенку хирургическими ножницами и разрезав длину грудины, чтобы обнажить сердце. Определите нижнюю полую вену и придаток левого предсердия по их анатомическому расположению.
  4. В быстрой последовательности разрежьте нижнюю полую вену и придаток левого предсердия хирургическими ножницами и перфузируйте животное 3-5 мл 0,9% NaCl через корень легочной артерии с помощью шприца, чтобы удалить всю кровь из легочного круга кровообращения.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Эвтаназия должна проводиться в соответствии с соответствующим этическим одобрением. В равной степени могут быть применены и другие методы. Рекомендуется тщательно удалять кровь из легочного круга кровообращения, что также может быть выполнено путем перфузии после остановки кровообращения.
  5. Удалите перфузированные легкие с помощью ножниц.
  6. Для консервации инкубируйте образцы в 4% формалине. Вводите раствор формалина непосредственно в бронхи и легочную сосудистую сеть. Погрузите образцы в формалин и дайте им инкубироваться не менее 6 часов.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Для раздувания легкого формалином следует применять стандартизированную процедуру для получения сопоставимых результатов. Примеры протоколов для таких процедур опубликованы в других работах 10,11.
  7. Обрезайте орган в соответствии с потребностями эксперимента. Поперечно разрежьте легкие пополам, чтобы захватить все части бронхиального дерева в разрезе.
  8. Передайте образцы в автоматический тканевый процессор для обезвоживания в спиртовой последовательности, очистке в ксилоле и парафиновом покрытии следующим образом: 70% этанол, 70% этанол, 80% этанол, 96% этанол, 100% этанол (1 ч каждый), 100% этанол, 100% этанол, ксилол (2 ч каждый), ксилол (1 ч) и парафин 3 раза в течение 2 ч.
  9. Расплавить парафин и заложить образцы в правильной ориентации в закладочные кассеты из полиоксиметилена. Позаботьтесь о том, чтобы образцы были заделаны поверхностью разреза вниз. С помощью ротационного микротома последовательно вырежьте секции размером 5 мкм. Дайте предметным стеклам высохнуть в течение 24 часов при температуре 37 °C перед дальнейшей обработкой.

2. Депарафинизация и гидратация парафиновых стекол

  1. Удалите парафин, инкубируя образцы 2 раза в 100% ксилоле в течение 5 минут каждый.
    ВНИМАНИЕ: Ксилол легковоспламеняющийся и опасен для здоровья. Используйте только под вытяжным шкафом.
  2. Увлажните образцы в 100% этаноле, 100% этаноле, 95% этаноле, 70% этаноле и 50% этаноле в течение 2 минут каждый. Затем промыть в течение 2 минут в дистиллированной воде.

3. Окрашивание Picrosirius Red

  1. Окрашивать в течение 8 мин в растворе гемалума Мейера. Вымойте горки в течение 10 минут под проточной водой из-под крана.
  2. Инкубировать предметные стекла в течение 1 ч в растворе Picrosirius Red. Для раствора Picrosirius Red используйте либо предварительно смешанный раствор для окрашивания, либо 0,1% Direct Red 80 или Sirius Red F 3B (CI 35780), разведенный в насыщенной пикриновой кислоте.
    ВНИМАНИЕ: Пикриновая кислота легковоспламеняющаяся и взрывоопасная, с ней следует обращаться осторожно.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Существует множество различных поставщиков наборов для окрашивания Picrosirius Red, как указано в таблице материалов. Помните о различиях в цене и способах окрашивания и всегда придерживайтесь инструкций поставщиков. Рекомендуется использовать только наборы для окрашивания с определенным цветовым индексом для Sirius Red F 3B (CI 35780).
  3. Опустите предметные стекла в 5-10 раз в раствор уксусной кислоты (0,5%). Осторожно встряхните предметные стекла, чтобы физически удалить раствор.
  4. Обезвоживайте предметные стекла в 95% этаноле, 100% этаноле, 100% этаноле, 100% ксилоле и 100% ксилоле в течение 5 минут каждый.
  5. Заделайте, добавив по одной капле монтажного носителя на каждый образец, и накройте покровным стеклом. Дайте предметным стеклам высохнуть под вытяжным шкафом.

4. Оцифровка и обработка изображений

  1. Сфокусируйте образцы под световым микроскопом с помощью соответствующего программного обеспечения для обработки изображений, пока изображение не станет четким и резким. Добавьте поляризационный фильтр и отрегулируйте степень поляризации, пока фон не станет полностью темным или черным. Когда фон максимально темный, достигается правильная поляризация.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Также можно визуализировать окрашивание Picrosirius Red обычным проходящим светом и без поляризационного фильтра. Для этой цели рекомендуется использовать Sirius Red с Fast Green, так как было показано, что он более чувствителен, чем Sirius Red в отдельности12,13. Тем не менее, поляризационная микроскопия необходима, чтобы различать толстые и тонкие коллагеновые волокна.
  2. Полностью сканируйте все образцы с 20-кратным увеличением и экспортируйте как .tiff. Перевод на программное обеспечение Фиджи14. Убедитесь, что вы заранее правильно очистили предметные стекла и используете стандартные настройки, касающиеся времени экспозиции и интенсивности источника света.
  3. Окружите образец вручную и вырежьте его в программном обеспечении с помощью Edit > Clear Outside. Измерьте общую площадь поверхности, щелкнув Анализ > Измерить.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Выбор отсека для измерения является важным этапом в получении надежных и сопоставимых результатов. При оцифровке и отборе всего образца отображается хороший срез, а гетерогенные ткани рассматриваются как единое целое. Тем не менее, также можно ограничиться определенными областями в образцах, такими как плевра или отдельные бронхи. Не забывайте всегда выбирать отсеки для сравнения в стандартизированном виде. Если образцы демонстрируют большую вариабельность вентиляции, целесообразно исключить из анализируемого отсека15 зону воздушного пространства.
  4. Измерьте общее содержание коллагена в образце с помощью цветового порога, нажав «Изображение» > «Настроить > цветовой порог », и отрегулируйте настройки, нажав «Анализировать» > «Анализировать частицы». Устанавливаем размер = 1 - бесконечность, четкость, суммирование. Яркость = 35 - 255. Оттенок = 2 - 130
    ПРИМЕЧАНИЕ: Разумная настройка цветовых порогов имеет решающее значение для достижения надежных результатов.
  5. Повторите то же самое для толстых и тонких коллагеновых волокон, регулируя оттенок как красные figure-protocol-1 толстые коллагеновые волокна (оттенок 2-30) и желто-зеленые figure-protocol-2 тонкие коллагеновые волокна (оттенок 31-130). В результате получится область окрашенных пикселей.
  6. Настройте макрос для автоматической обработки, нажав Плагины > Макросы > Запись и повторите со всеми сэмплами.
  7. Чтобы получить окончательные значения, стандартизированные по площади поверхности поперечного сечения, разделите площадь окрашенных пикселей для всех параметров на общую площадь поверхности, измеренную на шагах 4.3 и 4.5 для каждого образца соответственно.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

Описанный выше протокол позволяет провести объективную полуколичественную оценку отложения коллагена в мышиной легочной ткани. Фиброзное ремоделирование является патофизиологическим признаком хронического отторжения после трансплантации легких. Поэтому окрашивание Picrosirius Red применялось в моделях отторжения хронического аллотрансплантата легких с использованием левосторонней трансплантации ортотопического легкого мышей. Обширная трансплантация легких с несогласованностью MHC от донора BALB/c реципиенту C57BL/6 в усл...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

Стандартные гистологические методы, такие как гематоксилин и эозин, а также трихромное окрашивание Массона, широко используются для выявления фиброзных изменений в легких мышей с пространственным разрешением16,19. Тем не менее, часто необходимы дополнительные методы для количественной оценки этих изменений и оценки коллагенового состава ткани.

Окрашивание Picrosirius Red было впервые описано в 1964 год...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

Авторам нечего раскрывать.

Благодарности

Birte Ohm поддерживается Программой Берты-Оттенштейна для ученых-клиницистов медицинского факультета Фрайбургского университета. Штеффен У Айзенхардт является профессором Гейзенберга Немецкого научно-исследовательского общества (DFG) и поддержал эту работу личными грантами. Кроме того, мы хотели бы поблагодарить Шину Кройцалер за ее техническую помощь. Рисунок 1 был создан с помощью Biorender.com. Визуализация проводилась в центре Lighthouse Core Facility, который частично финансируется Медицинским факультетом Фрайбургского университета (номера проектов 2023/A2-FOL; 2021/B3-Fol), DKTK и DFG (проект No 450392965).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
Уксусная кислотаHoneywell, Шарлотта, США33209
Axio ObserverZeiss, Оберкохен,Германия 4633000956 (серийный номер)
Coverslip 1.5Roth, Karlsruhe, ГерманияKCY5.1
Формальдегид 37%Fisher Scientific, Лестершир, ВеликобританияF/1501/PB15
Раствор гемалума МейераMerck, Дармштадт, Германия109249
Picrosirius Red SolutionMorphisto, Оффенбах-на-Майне, Германия13422альтернативы, которые можно использовать: ab150681, abcam, Кембридж, Великобритания; SRS250 ScyTek Laboratories, Логан Сити
США Поляризационный фильтрZeiss, Оберкохен, Германия000000-1121-813
Ротационный микротом, HistoCore AUTOCUTLeica, Вецлар, Германия149AUTO00C1, 14051956472
Монтажный материал ROTI HistokittRoth, Карлсруэ, Германия6638.1
ROTI Plast ParaffinRoth, Карлсруэ, Германия6642.5
Кассеты для встраивания Rotilabo, POMRoth, Карлсруэ, ГерманияK113.1
Superfrost Plus Адгезионный микроскопepredia, Портсмут, ВеликобританияJ1800AMNZ
Tissue Processor Leica, Вецлар, ГерманияTP 1020
Software
Fiji software version 2.14.0/1.54fOpen Source
Imaging Software ZEN 3.4.91Zeiss, Oberkochen, Германия

Ссылки

  1. Weigt, S., DerHovanessian, A., Wallace, W., Lynch, J., Belperio, J. Bronchiolitis Obliterans Syndrome: The Achilles' heel of lung transplantation. Semin Respir Crit Care Med. 34 (3), 336-351 (2013).
  2. Verleden, G. M., et al. Chronic lung allograft dysfunction: Definition, diagnostic criteria, and approaches to treatment-A consensus report from the Pulmonary Council of the ISHLT. J Heart Lung Transplant. 38 (5), 493-503 (2019).
  3. Lama, V. N., et al. Models of lung transplant research: A consensus statement from the National Heart, Lung, and Blood Institute workshop. JCI Insight. 2 (9), e93121(2017).
  4. Martinu, T., et al. Spectrum of chronic lung allograft pathology in a mouse minor-mismatched orthotopic lung transplant model. Am J Transplant. 19 (1), 247-258 (2019).
  5. de Vleeschauwer, S., et al. Chronic rejection pathology after orthotopic lung transplantation in mice: The development of a murine BOS model and its drawbacks. PLoS One. 7 (1), e29802(2012).
  6. Yamada, Y., et al. Chronic airway fibrosis in orthotopic mouse lung transplantation models-An experimental reappraisal. Transplantation. 102 (2), e49-e58 (2018).
  7. Whittaker, P., Kloner, R. A., Boughner, D. R., Pickering, J. G. Quantitative assessment of myocardial collagen with picrosirius red staining and circularly polarized light. Basic Res Cardiol. 89 (5), 397-410 (1994).
  8. Puchtler, H., Waldrop, F. S., Valentine, L. S. Polarization microscopic studies of connective tissue stained with picro-sirius red FBA. Beitr Pathol. 150 (2), 174-187 (1973).
  9. Junqueira, L. C. U., Cossermelli, W., Brentani, R. Differential staining of collagens type I, II and III by Sirius Red and polarization microscopy. Arch Histol Jpn. 41 (3), 267-274 (1978).
  10. Davenport, M. L., Sherrill, T. P., Blackwell, T. S., Edmonds, M. D. Perfusion and inflation of the mouse lung for tumor histology. J Vis Exp. (162), e60605(2020).
  11. Limjunyawong, N., Mock, J., Mitzner, W. Instillation and fixation methods useful in mouse lung cancer research. J Vis Exp. (102), e52964(2015).
  12. Segnani, C., et al. Histochemical detection of collagen fibers by Sirius Red/Fast Green is more sensitive than van Gieson or Sirius Red alone in normal and inflamed rat colon. PLoS One. 10 (12), e0144630(2015).
  13. Courtoy, G. E., et al. Digital image analysis of Picrosirius Red staining: A robust method for multi-organ fibrosis quantification and characterization. Biomolecules. 10 (11), 1585(2020).
  14. Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nat Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
  15. Ségard, B. D., et al. Quantification of fibrosis extend and airspace availability in lung: A semi-automativ ImageJ/Fiji toolbox. PloS. 2 (2), e0298015(2024).
  16. Zhou, X., Moore, B. B. Lung section staining and microscopy. Bio Protoc. 7 (10), e2286(2017).
  17. Herovici, C. Picropolychrome: histological staining technic intended for the study of normal and pathological connective tissue. Rev Fr Etud Clin Biol. 8, 88-89 (1963).
  18. Sweat, F., Puchtler, H., Rosenthal, S. Sirius Red F3BA as a stain for connective tissue. Arch Pathol. 78, 69-72 (1964).
  19. Cardiff, R. D., Miller, C. H., Munn, R. J. Manual hematoxylin and eosin staining of mouse tissue sections. Cold Spring Harb Protoc. 2014 (6), 655-658 (2014).
  20. Montes, G. S., Junqueira, L. C. The use of the Picrosirius-polarization method for the study of the biopathology of collagen. Mem Inst Oswaldo Cruz. 86, Suppl 3 1-11 (1991).
  21. Rittié, L. Method for Picrosirius Red-polarization detection of collagen fibers in tissue sections. Methods Mol Biol. 1627, 395-407 (2017).
  22. Diehm, Y. F., et al. Stem cell-enriched hybrid breast reconstruction reduces risk for capsular contracture in a hybrid breast model. Plast Reconstr Surg. 152 (3), 572-580 (2023).
  23. Rich, L., Whittaker, P. Collagen and Picrosirius Red staining: A polarized light assessment of fibrillar hue and spatial distribution. Braz J Morphol Sci. 22 (2), 97-104 (2005).
  24. Datar, U. V., et al. Clinicopathologic study of a series of giant cell fibroma using picrosirius red polarizing microscopy technique. Arch Iran Med. 17 (11), 746-749 (2014).
  25. Nishat, R., Kumar, H. Collagen fibers in oral submucous fibrosis - A polarizing microscopy study using two special stains. Indian J Pathol Microbiol. 62 (4), 537-543 (2019).
  26. Lattouf, R., et al. Picrosirius red staining: a useful tool to appraise collagen networks in normal and pathological tissues. J Histochem Cytochem. 62 (10), 751-758 (2014).
  27. López De Padilla, C. M. Picrosirius Red staining: Revisiting its application to the qualitative and quantitative assessment of collagen type I and type III in tendon. J Histochem Cytochem. 69 (10), 633-643 (2021).
  28. Junqueira, L. C. U., Bignolas, G., Brentani, R. R. Picrosirius staining plus polarization microscopy, a specific method for collagen detection in tissue sections. Histochem J. 11 (4), 447-455 (1979).
  29. Zheng, L., et al. Scar collagen deposition in the airways of allografts of lung transplant recipients. Am J Respir Crit Care Med. 155 (6), 2072-2077 (1997).
  30. Astbury, S., et al. Reliable computational quantification of liver fibrosis is compromised by inherent staining variation. J Pathol Clin Res. 7 (5), 471-481 (2021).
  31. Feingold, B., et al. Diffuse myocardial fibrosis among healthy pediatric heart transplant recipients: Correlation of histology, cardiovascular magnetic resonance, and clinical phenotype. Pediatr Transplant. 21 (5), 12986(2017).
  32. vander Ploeg, E. A., Melgert, B. N., Burgess, J. K., Gan, C. T. The potential of biomarkers of fibrosis in chronic lung allograft dysfunction. Transplant Rev (Orlando). 35 (3), 100626(2021).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Теги

Окрашивание Picrosirius Red для полуколичественной гистопатологической оценки отложения коллагена у мышей моделей хронического отторжения аллотрансплантата легкого
Свяжитесь с нами
Рекомендовать библиотеке

Конфиденциальность

Условия эксплуатации

Политика

Авторские права © 2026 MyJoVE Corporation. Все права защищены.