Мы подробно описываем хирургические процедуры при черепно-костных композитных дефектах у крыс, а также исследования краткосрочных и долгосрочных прогнозов модели. Мы стремимся построить стандартизированную модель для разработки шовно-регенеративной терапии.
Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.
Методическая статья
Установление дефектов костного шовного материала у крыс: стандартизированная модель исследования шовно-регенеративной терапии
В этой статье
Краткое содержание
Аннотация
Масштабные черепные дефекты часто совпадают с разрывом черепного шва, что приводит к нарушениям в восстановлении черепного дефекта и развитии черепа (последнее происходит в развивающемся черепе). Тем не менее, отсутствие стандартизированной модели препятствует прогрессу в изучении шовно-регенеративной терапии и создает проблемы для проведения сравнительного анализа в различных исследованиях. Для решения этой проблемы в действующем протоколе подробно описан процесс моделирования черепных шовно-костных композитных дефектов у крыс.
Модель была создана путем сверления прямоугольных отверстий по всей толщине размером от 4,5 мм × 2 мм поперек коронковых швов. Крыс усыпляли, а образцы черепа собирали после операции на 0-й день, 2-ю неделю, 6-ю неделю и 12-ю неделю. Результаты μКТ образцов, собранных сразу после операции, подтвердили успешное установление шовно-костного композитного дефекта с удалением коронального шва и прилегающих костных тканей.
Данные6-й и12-й недель после операции продемонстрировали естественную тенденцию к заживлению дефекта. Гистологическое окрашивание еще больше подтвердило эту тенденцию, показав увеличение минерализованных волокон и новую кость в центре дефекта. Эти результаты указывают на прогрессирующее сращение швов с течением времени после дефектов черепной ветки, подчеркивая важность терапевтических вмешательств для регенерации швов. Мы ожидаем, что этот протокол будет способствовать развитию шовно-регенеративной терапии, предлагая новый взгляд на функциональное восстановление дефектов черепа и снижая неблагоприятные исходы, связанные с потерей швов.
Введение
Черепные швы представляют собой плотные фиброзные соединения между костями черепа, действующие как суставы, облегчающие легкое движение черепа и обеспечивающие защитную подушку для мозга под давлением1. В последние годы все больше исследований подчеркивают ключевую роль черепных швов в развитии черепа, черепно-лицевом гомеостазе и врожденном остеорепаративном потенциале 2,3,4,5,6,7,8. В периоды роста и развития черепные швы выступают в качестве основных центров роста в черепе4. Образование новой кости происходит на остеогенных фронтах по обе стороны швов, в то время как клетки внутри швов поддерживают недифференцированное мезенхимальное состояние, обеспечивая сбалансированное расширение черепа наряду с ростом мозга1. Потеря черепных швов в это время приводит к несоответствию между ростом черепа и мозга, что приводит к серьезным проблемам, таким как травмы головного мозга, гидроцефалия, повышенное внутричерепное давление и когнитивная дисфункция 3,9.
Кроме того, черепные швы играют решающую роль в определении прогноза дефектов черепа 5,7,10. Регенеративный потенциал по поверхности черепа распределен неравномерно, при этом черепные швы демонстрируют значительно превосходящие возможности по сравнению с бесшовными областями10,11. Одно исследование показывает, что скорость заживления черепного дефекта обратно коррелирует с расстоянием между черепным швом и местом повреждения10. В частности, удаление коронарных и сагиттальных швов приводит к незаживлению дефектов теменной кости7, что подчеркивает необходимость регенерации швов при дефектах черепа. Тем не менее, основное внимание в современных исследованиях сосредоточено преимущественно на восстановлении костной структуры черепа, пренебрегая регенерацией мезенхимы шва.
Что касается достижений в регенерации швов, то многообещающие результаты были отмечены при трансплантации костных лоскутов, содержащих шовные материалы, мезенхимальных стволовых клеток (МСК) и искусственных биоматериалов. Когда костные лоскуты со швами были пересажены в дефекты черепной кисти, они успешно интегрировались и зажили, в отличие от тех, у которых не было швов, у которых наблюдалось несращение и неспособность образовывать надкостницу, твердую мозговую оболочку или остеоциты. Аналогичным образом, имплантация МСК, полученных из костного мозга, в сагиттальные шовно-костные композитные дефекты способствовала образованию шовных промежутков12. Следует отметить, что недавнее исследование показало реализацию регенерации швов с помощью МСК Gli1+, что позволяет контролировать внутричерепное давление, исправлять деформации черепа и улучшать нейрокогнитивныефункции. По мере развития регенеративной медицины и биомедицинской инженерии исследователи все больше внимания уделяют тканевым биоматериалам из-за их адаптируемых и настраиваемых характеристик14. В частности, было доказано, что политетрафторэтиленовые мембраны доказали свою эффективность при одновременной реконструкции мезенхимы костей черепа и шовной нити15,16.
Тем не менее, в черепно-лицевых исследованиях отсутствуют установленные модели для изучения мезенхимальной регенеративной терапии швов, в отличие от относительно зрелых моделей восстановления других тканей, таких как кости, кожа, хрящи и мышцы. Отсутствие стандартизированной модели ограничивает изучение шовно-регенеративной терапии и затрудняет проведение сравнительного анализа различных исследований. Таким образом, в нашем исследовании был установлен осуществимый и воспроизводимый череповой шовно-костный композитный дефект крыс. С помощью этого метода мы стремимся разработать соответствующие клинические вмешательства для реконструкции черепных швов, предлагая новые перспективы функционального восстановления дефектов черепа и уменьшения неблагоприятных исходов в результате потери швов.
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Протокол
Все процедуры на животных в этом исследовании были рассмотрены и одобрены Этическим комитетом Западно-Китайской школы стоматологии Сычуаньского университета (WCHSIRB-D-2021-597). В общей сложности 12 (по 3 крысы в каждой из четырех временных точек) крыс Спрэга-Доули (SD) (самец, 300 г, возраст 8 недель) были получены из коммерческого источника (см. Таблицу материалов).
1. Предоперационная подготовка
- Хирургические изделия
- Подготовьте хирургические инструменты, показанные на рисунке 1А, в том числе изогнутые щипцы, одноразовый стерильный скальпель, надкостничный элеватор, ирригационную иглу, ватные шарики, низкоскоростной наконечник, хирургический мотор, стоматологические низкоскоростные круглые боры (рисунок 1В, диаметр 1,2 мм и 0,8 мм соответственно), иглодержатель, монофиламентные швы 3-0 и прямые ножницы.
- Стерилизация и дезинфекция
- Предварительно простерилизуйте инструменты путем стерилизации паром (125-135 °C, 20-25 мин).
- Используйте этанол для стерилизации термочувствительного медицинского оборудования, такого как электробритвы.
- Используйте стерильные медицинские нетканые материалы для покрытия рабочей платформы и дезинфицируйте окружающую среду 75% этанолом.
- Анестезия
- Подготовьте животных к операции с 1-недельным периодом акклиматизации.
- Введите крысам внутрибрюшинно ксилазин (10 мг/кг) и кетамин (100 мг/кг) за 20 минут до операции для анестезии или используйте любой подходящий протокол анестезии для достижения общей анестезии.
Кетамин-ксилазиновый анестетик, вводимый внутрибрюшинно крысам, обычно начинает действовать в течение 10-15 минут, достигая пика анестезии примерно через 35-40 минут после инъекции. Чтобы предотвратить переохлаждение во время наркоза, крыс лучше всего размещать на грелке. - Провести предоперационную подкожную инъекцию карпрофена в дозе 5 мг/кг для обеспечения обезболивания.
- Используйте «метод щипка пальца ноги», чтобы определить, находятся ли крысы в сознании и реагируют ли они.
2. Хирургический процесс
- Подготовка площадки
- Поместите крысу в положение лежа так, чтобы ее голова естественно вытянулась вертикально, не требуя специальных приспособлений или ограничителей для поддержания этой позы (рисунок 2A).
- Нанесите ветеринарную мазь, т.е. вазелин, на глаза крысы, чтобы предотвратить сухость роговицы.
- Удалите волосы с кожи головы между переносицей-переносицей и шейным суставом позвоночника с помощью электробритвы (рисунок 2B). Продезинфицируйте операционную область круговыми движениями, исходящими от центра, 2% раствором йодофора с последующим добавлением 75% этанола. Используйте хирургическую простыню, чтобы закрыть спинную поверхность животного и шерсть вокруг разреза.
- Вскрытие области хирургического вмешательства
- Начиная с середины носовой кости, сделайте продольный разрез кожи на 2 см одноразовым скальпелем по средней линии черепа (рисунок 2В).
- Сделайте надкостничный разрез по средней линии, отражающий начальную точку и протяженность слоя кожи с помощью скальпеля (рисунок 2D). Затем осторожно приподнимите надкостницу с обеих сторон разреза с помощью надкостничного элеватора (Рисунок 2E1), чтобы обнажить теменные кости, лобные кости и корональные швы (Рисунок 2E2).
ПРИМЕЧАНИЕ: При надрезе надкостницы следите за тем, чтобы не повредить черепные швы, чтобы предотвратить чрезмерное кровотечение при разрезании. Адекватное обнажение коронарного шва имеет первостепенное значение для следующих процедур. - Промойте рану солевым раствором и высушите операционную область ватными шариками.
- Создание модели дефектов шовно-костного композита
- Установите хирургический двигатель на 35 000 об/мин, вращая ручку (Рисунок 1A, желтая стрелка), затем включите переключатель (Рисунок 1A, белая стрелка).
- Начиная с любой точки на коронковом шве, прикладывайте вертикальную силу с помощью круглого бора диаметром 1,2 мм до тех пор, пока не почувствуете ощущение прорыва.
ПРИМЕЧАНИЕ: Рекомендуйте среднюю точку коронкового шва (обозначенную желтыми стрелками на рисунке 2E2) в качестве отправной точки для проникновения. При шлифовке бормашины следует держать перпендикулярно поверхности черепа. Соблюдайте осторожность, чтобы не продолжать сверление после проникновения во всю толщину черепа, чтобы предотвратить любой дальнейший вред крысам, включая повреждение мозга или кровоизлияние в мозг. - От точки проникновения переместите бор в поперечном направлении вдоль коронкового шва, чтобы создать позиционирующую борозду длиной около 4 мм (Рисунок 2F1). Удалите костную ткань бором с обеих сторон позиционирующей бороздки, чтобы первоначально сформировать прямоугольный дефект на всю толщину (Рисунок 2F2).
- Используйте круглый бор диаметром 0,8 мм для уточнения деталей (Рисунок 2G1), включая шлифовку прямых углов и сглаживание краев дефектов, в конечном итоге достигая стандартного прямоугольного дефекта размером 2 мм в ширину и 4,5 мм в длину (Рисунок 2G2).
ПРИМЕЧАНИЕ: Для достижения полного удаления коронарного шва с сохранением сагиттального и лобного швов у крыс с массой 300 г SD максимально возможная длина дефекта составляет примерно 4,5 мм. Учитывая ширину коронального шва в передне-заднем направлении (дополнительный рисунок S1), ширину дефекта устанавливали равной 2 мм. - Создайте два дефекта на левой и правой половинах коронкового шва для самостоятельного сравнения.
- Поддерживайте непрерывное орошение солевым раствором во время процедуры сверления для защиты от термических повреждений черепа и головного мозга. Тем временем используйте ватные тампоны, чтобы высушить рабочую зону.
- Проверка размеров образца
- Регулярно проверяйте длину и ширину дефектов с помощью штангенциркуля (рис. 2H1, H2), чтобы обеспечить однородность всех образцов.
- Закрытие области хирургического вмешательства
- Закройте кожу 3-0 монофиламентными нитями (Рисунок 2I).
- Непосредственная послеоперационная микрокомпьютерная томография (μКТ) in vivo
- Если это возможно, проведите компьютерную томографию in vivo на всех крысах сразу после операции, чтобы подтвердить успех хирургической процедуры и отслеживать тенденции восстановления дефектов у каждого человека.
3. Послеоперационный уход
- В соответствии с протоколами ухода за животными после операции при необходимости вводите установленные анальгетики, например, карпрофен (5 мг/кг, подкожное применение).
- Переложите крыс на постоянную грелку (37 °C) для послеоперационного восстановления.
- Когда крысы придут в сознание, переместите их в клетку с чистой подстилкой.
ПРИМЕЧАНИЕ: Постоянно наблюдайте за крысами после операции. Не оставляйте их без присмотра, пока они не смогут поддерживать лежачее положение за грудиной. Держите прооперированных крыс в изоляции от других до полного выздоровления. - Проводите обезболивание и послеоперационный мониторинг в течение 24 часов, а затем ежедневно оценивайте в течение первой недели после операции. После этого наблюдайте за крысами не реже 1-2 раз в неделю.
4. Сбор образцов и анализ данных
- Подготовка образцов
- Соберите образцы черепа на 0-й день после операции, на 2-й неделе, на 6-й и 12-й неделях. Усыпьте крыс с помощью ингаляцииCO2 .
- Перед дальнейшим анализом зафиксируйте образцы в 4% параформальдегиде при температуре 4 °C в течение 24 часов.
- Оценка μКТ
- Выполнять КТ костей черепа 0-го дня послеоперационного периода, 6-й недели, 12-й недели со следующими параметрами сканирования: потенциал рентгеновской трубки, 70 кВ; Интенсивность рентгеновского излучения, 0,2 мА; фильтр, AL 0,5 мм; время интегрирования, 1 х 300 мс; и размер вокселя 10 мкм.
- Получение 3D-реконструкции и изображений поперечного сечения с помощью программного обеспечения для обработки изображений (см. Таблицу материалов).
- Измерьте объем остаточных дефектов и выполните статистический анализ с помощью соответствующего программного обеспечения (см. Таблицу материалов).
- Гистологическое окрашивание
- Декальцинируйте кости черепа в 12% (масс./об.) растворе этилендиамина тетрауксусной кислоты (pH = 7,2) при 4 °C в течение 6 недель.
ПРИМЕЧАНИЕ: Декальцинируйте образцы с помощью изменений раствора каждые 3 дня. Используйте шейкер для ускорения процесса. Окончание обозначается, когда игла 25 G легко проникает в образец. - Приступайте к обезвоживанию, заделке парафина и подготовке срезов 6 мкм по стандартным протоколам18.
- Провести гистологический анализ с использованием гематоксилина и эозина (H&E) и трихромного окрашивания по Массону в соответствии с протоколом набора18.
- Декальцинируйте кости черепа в 12% (масс./об.) растворе этилендиамина тетрауксусной кислоты (pH = 7,2) при 4 °C в течение 6 недель.
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Результаты
В этом исследовании дефект кальвариального шовного материала крысы был установлен путем сверления прямоугольного отверстия размером 4,5 мм x 2 мм поперек коронального шва. Хирургическая схема и технологическая схема исследования представлены на рисунке 3. 3D-изображение и поперечное сечение послеоперационных образцов 0-day Samples, а именно образцов, собранных сразу после операции, подтвердили успешное создание полнослойного дефекта известкового дефекта, включающего полное удаление коронково...
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Обсуждение
Традиционные модели черепных дефектов, независимо от того, включают ли они черепные швы или нет, в первую очередь концентрируются на восстановлении твердых тканей, часто пренебрегая жизненно важной регенерацией мезенхимы шовной нити19,20. В исследованиях по регенерации швов предыдущие модели, такие как модели Mardas et al.15,16, использующие трепанный бор для создания 5-м...
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Раскрытие информации
У авторов нет конфликта интересов, о котором можно было бы заявить.
Благодарности
Это исследование было поддержано Национальным фондом естественных наук Китая 82100982 (F.L.), 82101000 (H.W.), 82001019 (B.Y.), Департаментом науки и технологий провинции Сычуань 2022NSFSC0598 (B.Y.), 2023NSFSC1499 (H.W.) и финансированием исследований от Западно-Китайской школы/больницы стоматологии Сычуаньского университета (RCDWJS2021-5). Рисунок 3 был создан с помощью Biorender.com.
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Материалы
| Имя | Компания | Каталожный номер | Комментарии |
|---|---|---|---|
| 4% параформальдегид | Biosharp | BL539A | |
| 2% раствор йодофора | Chengdu Jinshan Chemical Reagent Co., Ltd. | Не содержит | |
| 75% этанола | Chengdu Jinshan Chemical Reagent Co., Ltd. | Нет | |
| хлопковых шариков | Haishi Hainuo Group Co., Ltd. | Нет | |
| ватных палочек | Lakong Medical Devices Co., | Нет | |
| изогнутых щипцов | Chengdu Shifeng Co., Ltd. | Программное обеспечение None | |
| Dataviewer и Ctan для оценки объема остаточных дефектов | Bruker | None | |
| Dental низкоскоростные круглые боры | Dreybird Medical Equipment Co., Ltd. | RA3-012 RA1-008 | |
| Одноразовый стерильный скальпель | Hangzhou Huawei Medical Supplies Co., Ltd. | Нет | |
| одноразовых шприцев (22 г) | Chengdu Shifeng Co., Ltd. | SB1-089(IX) | |
| Электробритва | JASE | BM320210 | |
| этилендиаминтетрауксусной кислотой (ЭДТА) | BioFroxx | 1340GR500 | |
| Набор для окрашивания гематоксилина и эозина | Biosharp | BL700B | |
| Ирригационная игла (23 г) | Sichuan New Century Medical Polymer Products Co., Ltd. | Нет | |
| Низкоскоростной наконечник | Guangzhou Dental Guard Technology Co., Ltd. | Нет | |
| Массона s Набор для морилки Trichrome Solarbio | G1340 | ||
| Медицинские нетканые материалы | Henan Yadu Industrial Co., Ltd. | Нет | |
| Микрокомпьютерная томография (µ CT) | Scanco Medical AG | µ CT45 | |
| Mimics 20.0 для изображений поперечного сечения | Materialise | None | |
| Иглодержатели | Chengdu Shifeng Co., Ltd. | Нет | |
| периостального элеватора | Chengdu Shifeng Co., Ltd. | Нет | |
| солевого раствора | Sichuan Kelun Pharmaceutical Co., Ltd. | None | |
| Scanco программа для визуализации медицинских изображений для реконструкции 3D-изображений | Scanco Medical AG | None | |
| SPSS Statistics 20.0 для статистического анализа | IBM | None | |
| Sprague-Dawley rats | Byrness Weil Biotech Ltd | Без | |
| прямых ножниц | Chengdu Shifeng Co., Ltd. | Нет | |
| Хирургический мотор | MARATHON | N3-140232 | |
| Хирургические шовные материалы (3-0 мононить) | Hangzhou Huawei Medical Supplies Co., Ltd. | никакой |
Ссылки
- Li, B., et al. Cranial suture mesenchymal stem cells: insights and advances. Biomolecules. 11 (8), 1129(2021).
- Opperman, L. A. Cranial sutures as intramembranous bone growth sites. Dev Dyn. 219 (4), 472-485 (2000).
- Lenton, K. A., Nacamuli, R. P., Wan, D. C., Helms, J. A., Longaker, M. T. Cranial suture biology. Curr Top Dev Biol. 66 (4), 287-328 (2005).
- Slater, B. J., et al. Cranial sutures: A brief review. Plast Reconstr Surg. 121 (4), 170-178 (2008).
- Zhao, H., et al. The suture provides a niche for mesenchymal stem cells of craniofacial bones. Nat Cell Biol. 17 (4), 386-396 (2015).
- Maruyama, T., Jeong, J., Sheu, T. -J., Hsu, W. Stem cells of the suture mesenchyme in craniofacial bone development, repair and regeneration. Nat Commun. 7 (1), 10526(2016).
- Wilk, K., et al. Postnatal calvarial skeletal stem cells expressing PRX1 reside exclusively in the calvarial sutures and are required for bone regeneration. Stem Cell Reports. 8 (4), 933-946 (2017).
- Doro, D. H., Grigoriadis, A. E., Liu, K. J. Calvarial suture-derived stem cells and their contribution to cranial bone repair. Front Physiol. 8, 956(2017).
- Kajdic, N., Spazzapan, P., Velnar, T. Craniosynostosis-recognition, clinical characteristics, and treatment. Bosn J Basic Med Sci. 18 (2), 110-116 (2018).
- Park, S., Zhao, H., Urata, M., Chai, Y. Sutures possess strong regenerative capacity for calvarial bone injury. Stem Cells Dev. 25 (23), 1801-1807 (2016).
- Quarto, N., Behr, B., Longaker, M. T. Opposite spectrum of activity of canonical Wnt signaling in the osteogenic context of undifferentiated and differentiated mesenchymal cells: Implications for tissue engineering. Tissue Eng Part A. 16 (10), 3185-3197 (2010).
- Kaku, M., et al. Mesenchymal Stem Cell-Induced Cranial Suture-Like Gap in Rats. Plast Reconstr Surg. 127 (1), 69-77 (2011).
- Yu, M., et al. Cranial suture regeneration mitigates skull and neurocognitive defects in craniosynostosis. Cell. 184 (1), e18 243-256 (2021).
- Koons, G. L., Diba, M., Mikos, A. G. Materials design for bone-tissue engineering. Nat Rev Mater. 5 (8), 584-603 (2020).
- Mardas, N., Kostopoulos, L., Karring, T. Bone and suture regeneration in calvarial defects by e-PTFE-membranes and demineralized bone matrix and the impact on calvarial growth: an experimental study in the rat. J Craniofac Surg. 13 (3), 453-462 (2002).
- Kostopoulos, L., Karring, T. Regeneration of the sagittal suture by GTR and its impact on growth of the cranial vault. J Craniofac Surg. 11 (6), 553-561 (2000).
- Mosaddad, S. A., Hussain, A., Tebyaniyan, H. Exploring the use of animal models in craniofacial regenerative medicine: A narrative review. Tissue Eng Part B Rev. , (2023).
- Tan, X., et al. PgC3Mg metal-organic cages functionalized hydrogels with enhanced bioactive and ROS scavenging capabilities for accelerated bone regeneration. J Mater Chem B. 10 (28), 5375-5387 (2022).
- Yazdanian, M., et al. Fabrication and properties of βTCP/Zeolite/Gelatin scaffold as developed scaffold in bone regeneration: in vitro and in vivo studies. Biocybern Biomed Eng. 40 (4), 1626-1637 (2020).
- Soufdoost, R. S., et al. In vitro and in vivo evaluation of novel Tadalafil/β-TCP/Collagen scaffold for bone regeneration: A rabbit critical-size calvarial defect study. Biocybern Biomed Eng. 39 (3), 789-796 (2019).
- Russell, W. P., Russell, M. R. Anatomy, head and neck, coronal suture. StatPearls. , (2022).
- Menon, S., et al. Skeletal stem and progenitor cells maintain cranial suture patency and prevent craniosynostosis. Nat Commun. 12 (1), 4640(2021).
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Перепечатки и разрешения
