Анализ инфекции эпителиальных клеток с помощью шигелл

Краткое содержание

В настоящем протоколе описаны тесты на инфекции для исследования приверженности шигелл , инвазии и внутриклеточной репликации с использованием эпителиальных клеточных линий in vitro .

Аннотация

Адаптированный к человеку кишечный бактериальный патоген шигелла вызывает миллионы инфекций каждый год, создает долгосрочные эффекты роста среди педиатрических пациентов и является основной причиной смерти от диареи во всем мире. Инфекция вызывает водянистую или кровавую диарею в результате того, что патоген проходит через желудочно-кишечный тракт и инфицирует эпителиальные клетки, выстилающие толстую кишку. В условиях ошеломляющего роста устойчивости к антибиотикам и отсутствия в настоящее время одобренных вакцин стандартизированные протоколы исследований имеют решающее значение для изучения этого грозного патогена. Представлены методики изучения молекулярного патогенеза шигелл с использованием in vitro анализа бактериальной адгезии, инвазии и внутриклеточной репликации в эпителиальных клетках толстой кишки. Перед проведением анализа инфекции фенотип вирулентности колоний шигелл был проверен путем поглощения красного красителя Конго на агаровых пластинах. Во время бактериального культивирования также можно рассмотреть возможность использования дополнительных лабораторных сред для имитации условий in vivo . Затем бактериальные клетки используются в стандартизированном протоколе для инфицирования эпителиальных клеток толстой кишки в тканевых культуральных планшетах при установленной множественности инфекции с адаптацией для анализа каждой стадии инфекции. Для анализа на адгезию клетки шигелл инкубируют с пониженными уровнями среды, чтобы способствовать контакту бактерий с эпителиальными клетками. Как для инвазий, так и для внутриклеточной репликации гентамицин применяется в течение различных временных интервалов для уничтожения внеклеточных бактерий и обеспечения возможности оценки инвазии и/или количественной оценки скорости внутриклеточной репликации. Во всех протоколах инфекции перечисляются адгезивные, инвазированные и/или внутриклеточные бактерии путем последовательного разбавления лизатов инфицированных эпителиальных клеток и нанесения бактериальных колониеобразующих единиц относительно титров инфекции на пластинах из конголезского красного агара. Вместе эти протоколы позволяют проводить независимые характеристики и сравнения для каждой стадии инфекции эпителиальных клеток шигеллами для успешного изучения этого патогена.

Введение

Диарейные заболевания, вызываемые кишечными бактериальными патогенами, представляют собой серьезное глобальное бремя для здравоохранения. В 2016 г. диарейные заболевания стали причиной 1,3 миллиона случаев смерти во всем мире и были четвертой по значимости причиной смерти детей в возрасте до пяти ^лет. Грамотрицательный кишечный бактериальный патоген шигелла является возбудителем шигеллеза, основной причины смерти от диареи во всем мире³. Шигеллез ежегодно вызывает значительную заболеваемость и смертность среди детей из стран с низким и средним уровнем дохода ^4,5, в то время как инфекции в странах с высоким уровнем дохода связаны со вспышками в детских садах, пищевых продуктах и водным путем ^6,7,8,9. Неэффективная разработка^{вакцин10} и растущие показатели устойчивости к противомикробным препаратам (УПП)^11,12 осложняют борьбу с крупномасштабными вспышками шигеллы. Последние данные Центров по контролю и профилактике заболеваний показывают, что почти 46% инфекций шигелл в Соединенных Штатах проявили лекарственную устойчивость в 2020 году^13,14, в то время как Всемирная организация здравоохранения объявила шигеллы приоритетным патогеном УПП, для которого срочно необходимы новые методы^{лечения15}.

Шигелла-инфекции легко передаются фекально-оральным путем при употреблении зараженной пищи или воды или при прямом контакте с человеком. Шигеллы эволюционировали, чтобы стать эффективным, адаптированным к человеку патогеном, с инфекционной дозой 10-100 бактерий, достаточной для того, чтобы вызвать заболевание¹⁶. Во время транзита в тонком кишечнике шигеллы подвергаются воздействию сигналов окружающей среды, таких как повышенная температура и желчь¹⁷. Обнаружение этих сигналов индуцирует транскрипционные изменения для экспрессии факторов вирулентности, которые усиливают способность бактерий инфицировать толстую кишку человека 17,18,19. Шигеллы не проникают в эпителий толстой кишки с апикальной поверхности, а проходят через эпителиальный слой после поглощения в специализированные антигенпрезентирующие микроскладчатые клетки (М-клетки) в фолликул-ассоциированном эпителии 20,21,22. После трансцитоза клетки шигелл фагоцитируются резидентными макрофагами. Шигеллы быстро ускользают из фагосомы и запускают гибель клеток макрофагов, что приводит к высвобождению провоспалительных цитокинов ^5,23,24. Затем шигеллы вторгаются в эпителиальные клетки толстой кишки с базолатеральной стороны, лизируют макропиноцитарную вакуоль и создают репликативную нишу в цитоплазме ^5,25. Провоспалительные цитокины, особенно интерлейкин-8 (IL-8), рекрутируют полиморфноядерные нейтрофильные лейкоциты (ПМН) к месту инфекции, что ослабляет эпителиальные плотные соединения и позволяет бактериальной инфильтрации эпителиальной выстилки усугублять базолатеральную инфекцию⁵. ПМН разрушают инфицированную эпителиальную выстилку, чтобы сдержать инфекцию, что приводит к характерным симптомам бациллярной (кровяной) дизентерии⁵. Несмотря на то, что механизмы инвазии и внутриклеточной репликации были тщательно охарактеризованы, новые исследования демонстрируют важные новые концепции в отношении инфекции шигелл, включая регуляцию вирулентности во время желудочно-кишечного транзита (ЖКТ)¹⁷, приверженность к лечению¹⁹, улучшенный базолатеральный доступ через барьерную проницаемость²⁶ и бессимптомное носительство у детей с недостаточностью питания²⁷.

Способность Shigella spp. вызывать диарейные заболевания ограничена людьми и нечеловекообразными приматами (NHP)²⁸. Были разработаны модели кишечных инфекций шигелл для рыбок данио²⁹, мышей³⁰, морских свинок³¹, кроликов 21,32,33 и свиней^34,35. Однако ни одна из этих модельных систем не может точно воспроизвести характеристики заболевания, наблюдаемые при инфицировании человека³⁶. Несмотря на то, что для изучения патогенеза шигелл были созданы NHP-модели, эти модельные системы являются дорогостоящими в реализации и требуют искусственно высоких инфекционных доз, на девять порядков превышающих инфекционную дозу человека 37,38,39,40,41,42. Таким образом, замечательная адаптация шигелл к инфекции человека-хозяина обусловливает необходимость использования культур клеток человеческого происхождения для воссоздания физиологически релевантных моделей для точного исследования патогенеза шигелл.

Здесь подробно описаны процедуры для измерения скорости адгезии шигелл , инвазии и репликации в эпителиальных клетках толстой кишки HT-29. Используя эти стандартизированные протоколы, можно исследовать молекулярные механизмы, с помощью которых гены вирулентности бактерий и сигналы окружающей среды влияют на каждый этап инфекции шигелл , чтобы лучше понять динамическую взаимосвязь между хозяином и патогеном.

Протокол

1. Подготовка реагентов и материалов

ПРИМЕЧАНИЕ: Все объемы соответствуют анализу с использованием двух 6-луночных планшетов.

1. Среда TSB: Добавьте 0,5 л деионизированной (DI) воды к 15 г среды триптического соевого бульона (TSB, см. Таблицу материалов) и автоклав. Хранить при комнатной температуре.
2. Среда желчных солей (БСЭ + БС): Для приготовления БСЭ, содержащего 0,4% (по массе) желчных солей, ресуспендировать 0,06 г желчных солей (БС, см. Таблицу материалов) в 15 мл автоклавного БСЭ. Фильтр стерилизовать с помощью фильтра PES 0,22 мкм.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Желчные соли состоят из смеси холата натрия и дезоксихолата натрия в соотношении 1:1. Готовьте свежие средства непосредственно перед использованием.
3. DMEM + 10% (v/v) FBS: добавьте 5 мл фетальной бычьей сыворотки (FBS) к 45 мл модифицированной орлиной среды (DMEM) Dulbecco. Хранить при температуре 4 °C.
4. ДМЕМ + гентамицин: В пробирку объемом 50 мл добавьте 50 мл ДМЕМ и 50 мкл гентамицина 50 мг/мл (см. Таблицу материалов).
   ПРИМЕЧАНИЕ: Перед каждым экспериментом готовьте свежую, аликвотную и теплую на водяной бане с температурой 37 °C.
5. PBS + 1% (v/v) Triton X-100: добавьте 150 мкл Triton X-100 к 15 мл фосфатно-солевого буфера (PBS).
   ПРИМЕЧАНИЕ: Перед каждым экспериментом готовьте свежую, аликвотную и теплую на водяной бане с температурой 37 °C.
6. Красные индикаторные пластины TSB + Congo: Добавьте в бутылку объемом 1 л 15 г TSB, 7,5 г отборного агара и 0,125 г красного красителя Congo (см. Таблицу материалов). Добавьте 0,5 л деионизированной воды и автоклав. Налейте 10-20 мл среды в отдельные стерильные чашки Петри (100 мм x 15 мм) и дайте застыть.
   ВНИМАНИЕ: Конголезский красный является канцерогеном и репродуктивным токсином. Убедитесь, что обращение с конголезским красным осуществляется с использованием соответствующих средств индивидуальной защиты. Дополнительную информацию см. в паспорте безопасности продукта.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Около 20 пластин изготовлены из 0,5 л красной среды Конго. Тарелки можно подготовить за 2-3 дня и оставить перевернутыми при комнатной температуре до использования. Для длительного хранения поместите перевернутые пластины в пластиковые гильзы при температуре 4 °C на срок до 3 месяцев.
7. DMEM + 10% (v/v) FBS и 5% (v/v) диметилсульфоксида (DMSO): добавьте 42,5 мл DMEM, 5 мл FBS и 2,5 мл DMSO в пробирку объемом 50 мл. Хранить при температуре 4 °C.

2. Подготовка бактерий

ПРИМЕЧАНИЕ: Все протоколы лабораторного культивирования и хранения шигелл адаптированы из Payne, S. ^M.43.

ВНИМАНИЕ: Shigella spp. относятся к группе риска^{2 44}. Выполняйте все лабораторные работы в среде BSL-2 с принятием дополнительных мер безопасности для ограничения случайного воздействия из-за низкой инфекционной дозы Shigella spp.

1. Рост шигелл из замороженных запасов
   1. Переложите небольшое количество замороженной культуры из криогенного флакона на планшет с красным агаром TSB + Congo с помощью стерильного аппликатора.
   2. Пламенем простерилизуйте инокуляционный контур и дайте ему остыть. Проведите посевной материалом вперед и назад по одному квадранту пластины. Зажгите петлю, дайте ей остыть, затем проведите из первого квадранта во второй квадрант пластины. Повторите то же самое, чтобы распределить посевной материал по третьему и четвертому квадрантам пластины.
      ПРИМЕЧАНИЕ: В качестве альтернативы можно прорисовать посевной материал с помощью свежего стерильного аппликатора между каждым квадрантом.
   3. Переверните планшет и инкубируйте при температуре 37 °C в течение ночи.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Инкубация при температуре ≥37 °C необходима для экспрессии факторов вирулентности шигелл , необходимых для наблюдения конголезского красноположительного (CR⁺) фенотипа⁴⁵. Колонии авирулентов будут иметь белый вид и не будут инвазивными.
   4. Закройте пластину парафиновой пленкой и храните в холодильнике при температуре 4 °C.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Колонии бактерий остаются жизнеспособными на агаровых пластинах в течение 1-2 недель.
2. Ночное выращивание шигелл в жидкой культуре
   1. Аликвоту 3 мл среды TSB в стерильные культуральные пробирки по 14 мл.
   2. Выберите одиночную, хорошо изолированную красную (CR+) колонию с помощью стерильного аппликатора и ресуспендируйте в жидкой среде.
   3. Инкубируют культуры в течение ночи (16-18 ч) при 37 °C при встряхивании со скоростью 250 оборотов в минуту (об/мин).

3. Подготовка эукариотических клеток HT-29

ПРИМЕЧАНИЕ: Все объемы соответствуют анализу с использованием двух 6-луночных планшетов. Клеточные линии HT-29 были получены из Американской коллекции типовых культур (ATCC). Протоколы технического обслуживания HT-29 адаптированы из рекомендаций⁴⁶ ATCC. Перед использованием все среды должны быть предварительно прогреты на водяной бане при температуре 37 °C. Все протоколы технического обслуживания HT-29 должны выполняться в шкафу биобезопасности. Воздерживайтесь от образования пузырьков при смешивании/работе с клетками HT-29 в среде, чтобы избежать резких изменений pH.

1. Размораживание ячеек HT-29 из замороженного сырья
   1. Разморозьте флакон с ячейками HT-29 на водяной бане с температурой 37 °C.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Убедитесь, что колпачок полностью находится над водой, чтобы избежать загрязнения. Размораживание должно занять не более 2 минут.
   2. Выньте флакон из воды сразу после того, как культура полностью оттает, и обеззаражьте 70% этиловым спиртом. Убедитесь, что все шаги, начиная с этого момента, выполняются с использованием асептических методов.
   3. Добавьте все содержимое флакона в центрифужную пробирку объемом 15 мл, содержащую 9 мл DMEM + 10% FBS. Центрифуга при 125 x g в течение 5 мин при комнатной температуре.
   4. Сцедите надосадочную жидкость в контейнер для отходов и повторно суспендируйте гранулу в 10 мл теплого DMEM + 10% FBS. Переносят ресуспендированные клетки в колбу для тканевой культуры 75^см2 (Т75), содержащую 10 мл теплого ДМЭМ + 10% FBS (общий объем 20 мл).
   5. Инкубируют клетки при 37 °C с 5% CO₂ до тех пор, пока клетки не достигнут 90% слияния (примерно 6-7 дней).
      ПРИМЕЧАНИЕ: Слияние оценивается с помощью визуальной аппроксимации.
2. Посев ячеек HT-29
   1. Предварительно нагрейте 20 мл PBS и 50 мл DMEM + 10% FBS на водяной бане с температурой 37 °C и предварительно подогрейте 3 мл 0,25% (w/v) трипсина-ЭДТА до комнатной температуры.
   2. После того, как клетки HT-29 (из шага 3.1) достигнут 90% слияния, сцедите питательную среду для клеток HT-29 из колбы T75 в контейнер для отходов. Налейте ~10 мл теплого PBS в колбу и осторожно перемешайте, чтобы промыть. Слейте PBS в контейнер для отходов. Еще раз промойте теплым PBS и сцедите.
   3. Добавьте 2-3 мл 0,25% (по массе) трипсина-ЭДТА и аккуратно взболтайте по всей площади поверхности. Инкубировать при 37 °C с 5%_СО2 в течение 4 мин.
   4. Извлеките колбу из инкубатора и аккуратно взболтайте Трипсин-ЭДТА, визуально убедившись, что все клетки отделились от поверхности.
   5. Немедленно добавьте 6 мл теплого DMEM + 10% FBS, чтобы деактивировать трипсин. Пипеткой вверх и вниз тщательно перемешать.
   6. Переложите все содержимое в центрифужную пробирку объемом 15 мл и вращайте ее при 500 x g в течение 5 минут при комнатной температуре.
   7. Аккуратно сцедите надосадочную жидкость в контейнер для отходов и повторно суспендируйте гранулу в 6 мл теплого DMEM + 10% FBS.
   8. Сразу после ресуспензии переносят 10 мкл взвешенных клеток HT-29 из середины культуры в ПЦР-пробирку объемом 0,2 мл. Добавьте в ПЦР-пробирку 10 мкл красителя трипанового синего и перемешайте.
   9. Добавьте 10 мкл смеси клеток HT-29 и трипанового синего в одноразовое предметное стекло камеры счетчика клеток Countess (см. Таблицу материалов). Перечислите количество живых клеток и рассчитайте жизнеспособность клеток.
      ПРИМЕЧАНИЕ: При документировании количества клеток в образце считывайте число под «живым» количеством клеток, а не общее количество клеток. В качестве альтернативы подсчет клеток может быть выполнен вручную с помощью гемоцитометра.
   10. Семена ресуспендировали клетки HT-29 в свежую колбу Т75 или 6-луночную пластину.
       1. Для колбы Т75:
          1. Пипетку аккуратно перемешать, затем переложить 2,5 x 10⁶ ячеек в свежую колбу Т75 в соответствии с приведенным ниже уравнением:
             
          2. Добавьте теплую среду DMEM + 10% FBS до конечного объема 20 мл (конечная концентрация 1,25 x 10⁵ клеток/мл).
          3. Равномерно распределите клетки по колбе, осторожно покачивая вперед и назад.
          4. Инкубируют при 37 °C с 5%_CO2 до тех пор, пока клетки не достигнут 80% слияния.
             ПРИМЕЧАНИЕ: Для оптимального роста заменяйте фильтрующий материал DMEM + 10% FBS в колбе T75 каждые ~3 дня. Сцедите среду в контейнер для отходов и добавьте в колбу 10 мл теплого PBS. Осторожно перемешайте PBS и слейте его в контейнер для отходов. Затем добавьте в колбу 20 мл свежего теплого ДМЕМ + 10% FBS и верните в инкубатор с температурой 37 °C, 5% CO₂ .
       2. Для 6-луночного планшета:
          1. Пипетку аккуратно перемешать, затем переложить 5,85 x 10⁶ клеток в свежую коническую пробирку объемом 50 мл в соответствии с приведенным ниже уравнением:
             
          2. Добавьте теплую среду DMEM + 10% FBS до конечного объема 26 мл (конечная концентрация 2,25 x 10⁵ клеток/мл).
          3. Пипетку осторожно перемешать, затем дозировать 2 мл (4,5 x 10⁵ ячеек) в отдельные лунки 6-луночных планшетов.
          4. Равномерно распределите клетки по лунке, осторожно покачивая вверх/вниз и влево/вправо 2-3 раза.
          5. Инкубируют при 37 °C с 5% CO₂ до тех пор, пока клетки не достигнут слияния 80%-95% (примерно 3-4 дня).
             ПРИМЕЧАНИЕ: 85% конфлюэнтность рекомендуется для инвазий и внутриклеточной репликации, в то время как 90%-95% конфлюэнтность рекомендуется для анализов адгезии. Клетки должны достичь ~85% слияния после 48 ч инкубации с конечной концентрацией примерно 1 x 10⁶ клеток/лунку. Может потребоваться корректировка количества засеянных клеток и продолжительности инкубации.
3. Изготовление замороженных бульонов HT-29
   1. Аликвоту 1 мл ДМЭМ + 10% ФБС + 5% ДМСО среды в индивидуальные криогенные флаконы.
   2. Добавьте 1 x 10⁶ клеток HT-29 из шага 3.2.7 в каждый флакон. Рассчитайте объем ячеек по следующей формуле:
      
   3. Храните ячейки HT-29 при температуре ниже -130 °C в морозильной камере для хранения паров жидкого азота.

4. Анализ на адгезию

ПРИМЕЧАНИЕ: Все объемы соответствуют анализу с использованием двух 6-луночных планшетов.

1. Субкультурные культуры с однодневным разведением шигелл в соотношении 1:50 в свежих средах.
   1. Встряхните, затем добавьте 100 мкл каждой ночной культуры к 5 мл свежего БСЭ или БСЭ + БС в пробирку для культивирования подходящего размера.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Ограничьте объем культуры до <20% от объема колбы или пробирки для культуры, чтобы обеспечить надлежащую аэрацию.
   2. Инкубируют при 37 °C при встряхивании при 250 об/мин до тех пор, пока клетки не достигнут оптической плотности (OD₆₀₀) 0,7 (средняя логарифмическая фаза роста шигеллы ); около 2-2,5 ч.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Во время субкультивирования прибавьте 50 мл DMEM и достаточный объем PBS для всех этапов стирки и поместите на водяную баню с температурой 37 °C. Перед использованием дайте среде нагреться до 37 °C.
2. Переложите 2 x 10 колониеобразующих единиц (КОЕ) субкультивируемых шигелл в отдельные микроцентрифужные пробирки объемом 2 мл.
   ПРИМЕЧАНИЕ: 2 x 10⁸ КОЕ соответствует примерно 1 мл бактериальных клеток при наружном диаметре₆₀₀ 0,7. Используйте показания OD₆₀₀ для аппроксимации КОЕ/мл в соответствии с калибровкой каждого отдельного спектрофотометра.
3. Промойте каждый образец шигеллы 2 раза PBS.
   1. Грануляторы центрифугируют при 17 000 x g в течение 2 мин при комнатной температуре. Отсасывайте надосадочную жидкость, затем добавьте 1 мл теплого PBS и хорошо ресуспендируйте гранулы, осторожно пипетируя образец вверх и вниз до тех пор, пока смесь не станет полностью однородной (8-10x).
   2. Повторите шаг 4.3.1 1 дополнительное время.
   3. Гранулированные клетки центрифугируют при 17 000 x g в течение 2 мин при комнатной температуре, аспирируют надосадочную жидкость и ресуспендируют гранулы в 2 мл теплого DMEM.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Конечная концентрация ресуспендированных бактерий составляет 1 x 10⁸ КОЕ/мл.
4. Затем добавьте 1 мл (1 x 10,⁸ КОЕ) ресуспендированной шигеллы в каждую лунку подготовленных монослоев эпителия толстой кишки HT-29 в 6-луночных планшетах (начиная с шага 3.2.10.2).
   ПРИМЕЧАНИЕ: Инфекции обычно проводятся при кратности инфекции (MOI; соотношение бактериальных и эпителиальных клеток) равной 100. Чтобы протестировать различные MOI, разбавьте ресуспендированную шигеллу в теплом DMEM до желаемой концентрации, затем добавьте 1 мл разбавленных бактерий к монослоям HT-29. Например, чтобы проверить MOI, равный 10, разбавьте бактерии в соотношении 1:10, добавив 150 мкл бактерий 1 x 10⁸ КОЕ/мл к 1,35 мл теплого DMEM, затем нанесите 1 мл (1 x 10⁷ КОЕ) на клетки HT-29.
5. Инкубируйте 6-луночные планшеты при 37 °C с 5%_CO2 в течение 3 ч.
6. Во время инкубации определяют титр бактериальной инфекции.
   1. Приготовьте 10-кратные серийные разведения ресуспендированных клеток шигелл (из шага 4.3.3) в PBS.
   2. Распределите 100 мкл разведения 1 x ^10-5 и 1 x ^10-6 на красные планшеты TSB + Congo и инкубируйте в течение ночи при 37 °C.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Нанесение 100 мкл из разведений 1 x ^10-5 и 1 x ^10-6 соответствует конечному коэффициенту разбавления 1 x ^10-6 и 1 x ^10-7 соответственно.
7. После инкубации промыть монослои 4-5 раз ПБС.
   1. Отсасывайте среду из каждой лунки.
      ПРИМЕЧАНИЕ: При аспирации среды из 6-луночных планшетов направляйте наконечник аспиратора вдоль нижней стороны лунок, стараясь избегать контакта с ячейками HT-29.
   2. Добавьте 1 мл теплого PBS в каждую лунку и аккуратно промойте.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Чтобы аккуратно промыть 6-луночные монослои с помощью PBS, перемещайте пластину вверх-вниз и из стороны в сторону на столешнице. Мытье пластин круговыми движениями и/или снятие пластины с поверхности стола может привести к механическому удалению ячеек из пластика.
   3. Повторите шаги 4.7.1 и 4.7.2 еще 4 раза.
8. Удалить PBS путем аспирации и лизировать клетки HT-29, добавив 1 мл PBS + 1% Triton X-100 в каждую лунку.
9. Инкубируйте 6-луночные планшеты при температуре 37 °C в течение 5 минут.
10. Используйте скребок для клеток или изогнутый наконечник пипетки, чтобы соскоблить лизированные клетки со дна лунки и переложить полный 1 мл в свежую пробирку микроцентрифуги объемом 1,7 мл.
11. Определите количество клеточно-ассоциированных бактерий.
    1. Встряхивайте каждую пробирку (начиная с шага 4.10) в течение не менее 30 с, чтобы еще больше вытеснить шигеллы из лизированных эукариотических клеток.
    2. Готовят 10-кратные последовательные разведения лизатов в ПБС.
    3. Проложите 100 мкл разведения 1 x ^10-2, 1 x ^10-3 и 1 x ^10-4 на красные планшеты TSB + Congo и инкубируйте в течение ночи при 37 °C.
       ПРИМЕЧАНИЕ: Нанесение 100 мкл из разведения 1 x ^10-2, 1 x ^10-3 и 1 x ^10-4 соответствует конечному коэффициенту разбавления 1 x ^10-3, 1 x ^10-4 и 1 x ^10-5 соответственно.

5. Инвазионный анализ

ПРИМЕЧАНИЕ: Все объемы соответствуют анализу с использованием двух 6-луночных планшетов.

1. Субкультурные культуры с однодневным разведением шигелл в соотношении 1:50 в свежих средах.
   1. Встряхните, затем добавьте 100 мкл каждой ночной культуры к 5 мл свежего БСЭ или БСЭ + БС в пробирку для культивирования подходящего размера.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Ограничьте объем культуры до <20% от объема колбы или пробирки для культуры, чтобы обеспечить надлежащую аэрацию.
   2. Инкубируют при 37 °C при встряхивании при 250 об/мин до тех пор, пока клетки не достигнут наружного диаметра₆₀₀ 0,7 (средняя логарифмическая фаза роста шигеллы ); около 2-2,5 ч.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Во время субкультивирования прибавьте 50 мл DMEM + 50 мг/мл гентамицина и достаточный объем PBS для всех этапов промывки и поместите на водяную баню с температурой 37 °C. Перед использованием дайте среде нагреться до 37 °C.
2. Переложите 2 x 10^{8 КОЕ} субкультивированных шигелл в отдельные микроцентрифужные пробирки объемом 2 мл.
   ПРИМЕЧАНИЕ: 2 x 10⁸ КОЕ соответствует примерно 1 мл бактериальных клеток при наружном диаметре₆₀₀ 0,7. Используйте показания OD₆₀₀ для аппроксимации КОЕ/мл в соответствии с калибровкой каждого отдельного спектрофотометра.
3. Промыть образцы шигелл 1 раз с помощью PBS.
   1. Грануляторы центрифугируют при 17 000 x g в течение 2 мин при комнатной температуре. Отсасывайте надосадочную жидкость, затем добавьте 1 мл теплого PBS и хорошо ресуспендируйте гранулы, осторожно пипетируя образец вверх и вниз до тех пор, пока смесь не станет полностью однородной (8-10x).
   2. Повторите шаг 5.3.1. 1x дополнительное время.
   3. Гранулированные клетки центрифугируют при 17 000 x g в течение 2 мин при комнатной температуре, аспирируют надосадочную жидкость и ресуспендируют гранулы в 2 мл теплого DMEM.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Конечная концентрация ресуспендированных бактерий составляет 1 x 10⁸ КОЕ/мл.
4. Затем добавьте 1 мл (1 x 10⁸ КОЕ) ресуспендированной шигеллы плюс 1 мл DMEM в каждую лунку подготовленных монослоев эпителия толстой кишки HT-29 в 6-луночных планшетах (начиная с шага 3.2.10.2).
   ПРИМЕЧАНИЕ: Инфекции обычно проводятся при кратности инфекции (MOI; соотношение бактериальных и эпителиальных клеток) равной 100. Чтобы протестировать различные MOI, разбавьте ресуспендированную шигеллу в DMEM до желаемой концентрации, затем добавьте 1 мл разбавленных бактерий к монослоям HT-29. Например, чтобы проверить MOI 10, разбавьте бактерии в соотношении 1:10, добавив 150 мкл бактерий 1 x 10⁸ КОЕ/мл к 1,35 мл DMEM, а затем добавьте 1 мл (1 x 10⁷ КОЕ) к клеткам HT-29.
5. Чтобы способствовать контакту бактерий с клетками HT-29, центрифугируйте 6-луночные планшеты при 2 000 x g в течение 10 минут при комнатной температуре или 37 °C, если настройка температуры может быть отрегулирована.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Центрифугирование способствует контакту бактерий с клетками HT-29, что позволяет избежать необходимости в факторах адгезии и позволяет бактериям быстро проникать в клетки.
6. Инкубируют 6-луночные планшеты при 37 °C с 5%_CO2 в течение 45 мин.
7. Во время инкубации определяют титр бактериальной инфекции.
   1. Приготовьте 10-кратные серийные разведения ресуспендированных клеток шигелл (из шага 5.3.3) в PBS.
   2. Распределите 100 мкл разведения 1 x ^10-5 и 1 x ^10-6 на красные планшеты TSB + Congo и инкубируйте в течение ночи при 37 °C.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Нанесение 100 мкл из разведений 1 x ^10-5 и 1 x ^10-6 соответствует конечному коэффициенту разбавления 1 x ^10-6 и 1 x ^10-7 соответственно.
8. Тщательно промыть инфицированные клетки HT-29 3 раза 1 мл PBS.
   1. Отсасывайте среду из каждой лунки.
      ПРИМЕЧАНИЕ: При аспирации среды из 6-луночных планшетов направляйте наконечник аспиратора вдоль нижней стороны лунок, стараясь избегать контакта с ячейками HT-29.
   2. Добавьте 1 мл теплого PBS в каждую лунку и аккуратно промойте.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Чтобы аккуратно промыть 6-луночные монослои с помощью PBS, перемещайте пластину вверх-вниз и из стороны в сторону на столешнице. Мытье пластин круговыми движениями и/или снятие пластины с поверхности стола может привести к механическому удалению ячеек из пластика.
   3. Повторите шаги 5.8.1 и 5.8.2 еще 2 раза.
9. Удалите PBS путем аспирации, затем добавьте 2 мл теплого DMEM с добавлением 50 мкг/мл гентамицина в каждую лунку и инкубируйте в течение 30 мин при 37 °C с 5%_CO2.
10. Тщательно промыть инфицированные клетки HT-29 3 раза 1 мл PBS.
    1. Повторите шаг стирки 5.8.
11. Удалить PBS путем аспирации, затем добавить 2 мл теплого DMEM с добавлением 50 мкг/мл гентамицина в каждую лунку и инкубировать в течение 60 мин при 37 °C с 5% CO₂.
12. Тщательно промыть инфицированные клетки HT-29 3 раза 1 мл PBS.
    1. Повторите шаг стирки 5.8.
13. Удалить PBS путем аспирации и лизировать клетки HT-29, добавив 1 мл PBS + 1% Triton X-100 в каждую лунку.
14. Инкубируйте 6-луночные планшеты при температуре 37 °C в течение 5 минут.
15. Используйте скребок для клеток или изогнутый наконечник пипетки, чтобы соскоблить лизированные клетки со дна лунки и переложить полный 1 мл в свежую пробирку микроцентрифуги объемом 1,7 мл.
16. Определяют количество внутриклеточных бактерий.
    1. Встряхивайте каждую пробирку (начиная с шага 5.15) в течение не менее 30 с для дальнейшего вытеснения шигелл из лизированных эукариотических клеток.
    2. Готовят 10-кратные последовательные разведения лизатов в ПБС.
    3. Проложите 100 мкл разведения 1 x ^10-2 и 1 x ^10-3 на красные планшеты TSB + Congo и инкубируйте в течение ночи при 37 °C.
       ПРИМЕЧАНИЕ: Нанесение 100 мкл из разведений 1 x ^10-2 и 1 x ^10-3 соответствует конечному коэффициенту разбавления 1 x ^10-3 и 1 x ^10-4 соответственно.

6. Анализ внутриклеточной репликации

ПРИМЕЧАНИЕ: Все объемы соответствуют анализу с использованием двух 6-луночных планшетов.

1. Субкультурные культуры с однодневным разведением шигелл в соотношении 1:50 в свежих средах.
   1. Встряхните, затем добавьте 100 мкл каждой ночной культуры к 5 мл свежего БСЭ или БСЭ + БС в пробирку для культивирования подходящего размера.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Ограничьте объем культуры до <20% от объема колбы или пробирки для культуры, чтобы обеспечить надлежащую аэрацию.
   2. Инкубируют при 37 °C при встряхивании при 250 об/мин до тех пор, пока клетки не достигнут наружного диаметра₆₀₀ 0,7 (средняя логарифмическая фаза роста шигеллы ); около 2-2,5 ч.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Во время субкультивирования прибавьте 50 мл DMEM + 50 мг/мл гентамицина и достаточный объем PBS для всех этапов промывки и поместите на водяную баню с температурой 37 °C. Перед использованием дайте среде нагреться до 37 °C.
2. Переложите 2 x 10^{8 КОЕ} субкультивированных шигелл в отдельные микроцентрифужные пробирки объемом 2 мл.
   ПРИМЕЧАНИЕ: 2 x 10⁸ КОЕ соответствует примерно 1 мл бактериальных клеток при наружном диаметре₆₀₀ 0,7. Используйте показания OD₆₀₀ для аппроксимации КОЕ/мл в соответствии с калибровкой каждого отдельного спектрофотометра.
3. Промыть образцы шигелл 1 раз с помощью PBS.
   1. Грануляторы центрифугируют при 17 000 x g в течение 2 мин при комнатной температуре. Отсасывайте надосадочную жидкость, затем добавьте 1 мл теплого PBS и хорошо ресуспендируйте гранулы, осторожно пипетируя образец вверх и вниз до тех пор, пока смесь не станет полностью однородной (8-10x).
   2. Повторите шаг 6.3.1. 1x дополнительное время.
   3. Гранулированные клетки центрифугируют при 17 000 x g в течение 2 мин при комнатной температуре, аспирируют надосадочную жидкость и ресуспендируют гранулы в 2 мл теплого DMEM.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Конечная концентрация ресуспендированных бактерий составляет 1 x 10⁸ КОЕ/мл.
4. Затем добавьте 1 мл (1 x 10,⁸ КОЕ) ресуспендированной шигеллы плюс 1 мл DMEM в каждую лунку подготовленных монослоев эпителия толстой кишки HT-29 в 6-луночных планшетах (начиная с шага 3.2.10.2).
   ПРИМЕЧАНИЕ: Инфекции обычно проводятся при кратности инфекции (MOI; соотношение бактериальных и эпителиальных клеток) равной 100. Чтобы протестировать различные MOI, разбавьте ресуспендированную шигеллу в DMEM до желаемой концентрации, затем добавьте 1 мл разбавленных бактерий к монослоям HT-29. Например, чтобы протестировать MOI 10, разбавьте бактерии в соотношении 1:10, добавив 150 мкл бактерий 1 x 10⁸ КОЕ/мл к 1,35 мл DMEM, затем нанесите 1 мл (1 x 10⁷ КОЕ) на клетки HT-29.
5. Чтобы способствовать контакту бактерий с клетками HT-29, центрифугируйте 6-луночные планшеты при 2 000 x g в течение 10 минут при комнатной температуре или 37 °C, если настройка температуры может быть отрегулирована.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Центрифугирование способствует контакту бактерий с клетками HT-29, что позволяет избежать необходимости в факторах адгезии и позволяет бактериям быстро проникать в клетки.
6. Инкубируют 6-луночные планшеты при 37 °C с 5%_CO2 в течение 45 мин.
7. Во время инкубации определяют титр бактериальной инфекции.
   1. Приготовьте 10-кратные серийные разведения ресуспендированных клеток шигелл (из шага 6.3.3) в PBS.
   2. Распределите 100 мкл разведения 1 x ^10-5 и 1 x ^10-6 на красные планшеты TSB + Congo и инкубируйте в течение ночи при 37 °C.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Нанесение 100 мкл из разведений 1 x ^10-5 и 1 x ^10-6 соответствует конечному коэффициенту разбавления 1 x ^10-6 и 1 x ^10-7 соответственно.
8. Тщательно промыть инфицированные клетки HT-29 3 раза 1 мл PBS.
   1. Отсасывайте среду из каждой лунки.
      ПРИМЕЧАНИЕ: При аспирации среды из 6-луночных планшетов направляйте наконечник аспиратора вдоль нижней стороны лунок, стараясь избегать контакта с ячейками HT-29.
   2. Добавьте 1 мл теплого PBS в каждую лунку и аккуратно промойте.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Чтобы аккуратно промыть 6-луночные монослои с помощью PBS, перемещайте пластину вверх-вниз и из стороны в сторону на столешнице. Мытье пластин круговыми движениями и/или снятие пластины с поверхности стола может привести к механическому удалению ячеек из пластика.
   3. Повторите шаги 6.8.1 и 6.8.2 еще 2 раза.
9. Удалите PBS путем аспирации, затем добавьте 2 мл теплого DMEM с добавлением 50 мкг/мл гентамицина в каждую лунку и инкубируйте в течение 30 мин при 37 °C с 5%_CO2.
10. Тщательно промыть инфицированные клетки HT-29 3 раза 1 мл PBS.
    1. Повторите шаг стирки 6.8.
11. Удаляют PBS путем аспирации, затем добавляют 2 мл теплого ДМЭМ с 50 мкг/мл гентамицина в каждую лунку 6-луночных планшетов и инкубируют при 37 °C с 5%_CO2 в течение желаемого периода времени, чтобы обеспечить внутриклеточную репликацию (до 24 ч).
12. Тщательно промойте клетки 2 раза 1 мл PBS.
    1. Повторите шаг стирки 6.8.
13. Удалить PBS путем аспирации и лизировать клетки HT-29, добавив 1 мл PBS + 1% Triton X-100 в каждую лунку.
14. Инкубируйте 6-луночные планшеты при температуре 37 °C в течение 5 минут.
15. Используйте скребок для клеток или изогнутый наконечник пипетки, чтобы соскоблить лизированные клетки со дна лунки и переложить полный 1 мл в свежую пробирку микроцентрифуги объемом 1,7 мл.
16. Определяют количество внутриклеточных бактерий.
    1. Встряхивайте каждую пробирку (начиная с шага 6.15) в течение не менее 30 с для дальнейшего вытеснения шигелл из лизированных эукариотических клеток.
    2. Готовят 10-кратные последовательные разведения лизатов в ПБС.
    3. Протаплируйте 100 мкл разведений 1 x ^10-2, 1 x ^10-3 и 1 x ^10-4 на тарелки TSB + Congo Red и инкубируйте в течение ночи при 37 °C.
       ПРИМЕЧАНИЕ: Нанесение 100 мкл из разведения 1 x ^10-2, 1 x ^10-3 и 1 x ^10-4 соответствует конечному коэффициенту разбавления 1 x ^10-3, 1 x ^10-4 и 1 x ^10-5 соответственно.

Результаты

Анализы приверженности, инвазии и внутриклеточной репликации были проведены, сравнивая S. flexneri 2457T дикого типа (WT) с S. flexneri ΔVF (ΔVF), мутантом, который, как предполагается, отрицательно регулирует вирулентность шигелл. Поскольку шигеллы используют желчные соли в качестве сигнала для регуляции вирулентности 17,18,47, эксперименты проводили после бактериальной субкультуры в средах БСЭ, а также БСЭ с добавлением 0,4% (по массе) желчных солей¹⁸. Воздействие желчных солей на этапе субкультуры действует как предварительная обработка для воспроизведения транзита в тонком кишечнике до инфекции толстой кишки 17,18,47. На рисунке 1 проанализировано влияние мутации ΔVF на способность S. flexneri прикрепляться к эпителиальным клеткам толстой кишки HT-29. Процент адгезии отображается на оси Y и представляет собой отношение выздоровевших бактерий после стандартизированного лизиса HT-29 к количеству входных бактерий. Как и ожидалось, у штаммов S. flexneri WT и ΔVF наблюдалось значительное повышение приверженности при субкультивировании с добавкой желчных солей по сравнению с БСЭ без добавок желчных солей¹⁸. Тем не менее, не было выявлено различий в приверженности к клеткам HT-29 между мутантными штаммами WT и ΔVF в каждом субкультурном состоянии. Эти данные указывают на то, что мутация ΔVF не влияет на способность S. flexneri прикрепляться к эпителиальным клеткам HT-29 с предварительной обработкой желчными солями или без нее.

На рисунке 2 было проанализировано влияние мутации ΔVF на способность S. flexneri проникать (рис. 2A) и реплицироваться (рис. 2B) внутрь эпителиальных клеток толстой кишки HT-29 с предварительной обработкой желчными солями или без нее. Процент восстановления построен на оси Y и представляет собой отношение восстановленных бактериальных клеток после лизиса клеток HT-29, стандартизированное к количеству входных бактерий. На рисунке 2A было отмечено ожидаемое значительное увеличение способности WT S. flexneri 2457T проникать в клетки HT-29 после предварительного воздействия желчных солей⁴⁸, в то время как мутант S. flexneri ΔVF продемонстрировал меньшее увеличение инвазии после предварительного воздействия желчных солей по сравнению со штаммом WT. Мутант ΔVF имел повышенную частоту инвазии клеток HT-29 по сравнению с WT, субкультивируемым в TSB, но имел такие же частоты инвазии, как и WT, при субкультивировании в TSB с добавлением желчных солей (рис. 2A). Эти результаты свидетельствуют о том, что мутация ΔVF усиливает способность S. flexneri проникать в клетки HT-29, что уменьшает эффект предварительного воздействия желчных солей, даже несмотря на то, что инвазионная способность мутанта ΔVF еще больше увеличилась после субкультуры желчных солей.

В целом, после ночной инкубации было обнаружено в 10 раз больше бактерий (рис. 2B) по сравнению с 90-минутной инкубацией (рис. 2A), что демонстрирует различия в мониторинге внутриклеточного роста и инвазии соответственно. Когда инфицированные клетки HT-29 инкубировали в течение 18 ч, чтобы обеспечить внутриклеточную репликацию бактерий (рис. 2B), влияние предварительной обработки желчными солями уменьшалось как для штаммов WT, так и для штаммов ΔVF . Однако снижение эффекта предварительной обработки желчными солями во время внутриклеточной репликации было более драматичным для мутанта ΔVF . Поскольку увеличение внутриклеточной репликации обоих штаммов при предварительном воздействии желчных солей было меньше, чем увеличение частоты инвазии в тех же условиях, мы предполагаем, что желчные соли оказывают большее влияние на ранние стадии патогенеза S. flexneri . Мутант ΔVF продемонстрировал увеличение процента восстановления после ночной репликации внутри клеток HT-29 по сравнению с WT (рис. 2B) после обоих условий субкультуры. Тем не менее, процент выздоровления мутанта ΔVF был одинаковым независимо от предварительного воздействия желчных солей. Эти тенденции данных свидетельствуют о том, что мутант ΔVF более эффективно реплицируется внутри клеток HT-29 по сравнению с WT, и что предварительное воздействие желчных солей не влияет на способность мутанта ΔVF реплицироваться внутриклеточно, как это наблюдается для WT (рис. 2B). Поскольку при 90-минутном анализе инвазии не наблюдалось различий между мутантными и WT-штаммами в условиях доэкспозиционной инвазии желчных солей, мы предполагаем, что продукт, кодируемый удаленным геном VF , может также регулировать репликацию S. flexneri внутри клеток HT-29. В совокупности оба анализа показывают, что мутант ΔVF более вирулентен по отношению к WT, что позволяет предположить, что продукт гена VF является отрицательным регулятором вирулентности S. flexneri .

Рисунок 1: Доэкспозиционная адгезия S. flexneri к клеткам HT-29 индуцирована желчными солями. Мутантные клетки S. flexneri 2457T WT и ΔVF субкультивировали либо в БСЭ, либо в БСЭ с добавлением 0,4% (по массе) желчных солей (TSB+BS). Затем бактерии наносили на клетки HT-29 при кратности инфекции (MOI) 100 и инкубировали в течение 3 ч для изучения адгезии. После инкубации инфицированные клетки HT-29 промывали и лизировали, а серийные разведения выздоровевших бактерий покрывали для подсчета колониеобразующих единиц на мл (КОЕ/мл). Количество адгезивных бактерий строится относительно титров входных бактерий для установления процента адгезии. Данные репрезентативны для одного биологического репликанта с тремя техническими репликатами (отдельными точками). Столбцы погрешности показывают стандартную ошибку среднего значения (SEM). Статистическую значимость определяли по t-критерию Стьюдента (*p < 0,05; ***p < 0,001). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этого рисунка.

Рисунок 2: Предварительное воздействие желчных солей увеличивало инвазию WT S. flexneri и внутриклеточную репликацию. Мутантные клетки S. flexneri 2457T WT и ΔVF субкультивировали в БСЭ или БСЭ с добавлением сред желчных солей (TSB+BS). Затем бактерии наносили на клетки HT-29 при MOI 100, центрифугировали на клетках и инкубировали при 37 °C с 5%_CO2 в течение 45 мин. Клетки промывали PBS, а внеклеточные бактерии лизировали путем добавления гентамицина в DMEM для исключительного восстановления внутриклеточных бактерий. После 90-минутной (А, бактериальная инвазия) или 18-часовой (В, внутриклеточная репликация) инкубации инфицированные клетки HT-29 промывали и лизировали, а также проводили последовательные разведения восстановленных бактерий для подсчета колониеобразующих единиц на мл (КОЕ/мл). Количество внутриклеточных бактерий строится относительно входных титров бактерий для установления процента восстановления. Данные репрезентативны для одного биологического репликата, каждый из которых имеет три технических репликата (отдельные точки). Полосы погрешности указывают на SEM. Статистическая значимость определялась с помощью t-критерия Стьюдента (*p < 0,05). Обратите внимание на различия в масштабах оси Y между панелями (A) и (B). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этого рисунка.

Обсуждение

Этот протокол описывает набор из трех стандартизированных анализов для изучения адгезии шигелл, инвазии и внутриклеточной репликации эпителиальных клеток кишечника. Несмотря на то, что эти методы являются всего лишь модифицированными версиями классических гентамициновых анализов, используемых для изучения инвазии и внутриклеточной репликации различных бактериальных патогенов в клетках хозяина 49,50,51, при изучении шигелл необходимо учитывать особые соображения.

Шигеллы являются факультативными анаэробами, которые оптимально растут при 37 °C в богатой среде с аэрацией⁴³. При проведении этих тестов для изучения влияния различных сигналов окружающей среды или метаболитов на инфекции шигелл, рекомендуется выращивать шигеллы в богатых средах в течение ночи, а затем субкультивировать в определенные или дополненные среды до середины логарифмической фазы до инфекции. Максимальная экспрессия гена вирулентности происходит во время логарифмической фазы роста ^52,53. Таким образом, субкультивирование ночных культур шигелл и доведение бактериального роста до экспоненциальной фазы (OD₆₀₀ ~ 0,7) являются необходимыми шагами для правильной оценки вирулентности шигелл. Кроме того, экспрессия гена вирулентности зависит от температуры. Для обеспечения специфичности экспрессии только во время инфекции хозяина гены вирулентности индуцируются при физиологических температурах хозяина (37 °C) и строго подавляются при более низких температурах (например, 30 °C)⁵⁴. Чтобы обеспечить экспрессию генов вирулентности, бактериальное субкультивирование и инфекции должны проводиться при 37 °C, с надлежащей осторожностью, чтобы температура не опускалась ниже 37 °C. Крупная вирулентная плазмида с 220 килооснованиями, которая кодирует молекулярный механизм, необходимый для инвазии и инфекции эпителиальных клеток, является важным детерминантом вирулентности для всех Shigella ^{spp 5}. Повторное пассажирование и длительный рост при 37 °C способствуют нестабильности плазмиды вирулентности, что приводит к потере плазмиды и превращению клеток шигелл в авирулентный⁵⁵. Чтобы обеспечить поддержание вирулентности плазмиды и экспрессию важнейших генов вирулентности, рекомендуется каждые две недели выводить бактерии непосредственно из морозильных камер на свежие красные индикаторные пластины TSB + Congo. Конголезский красный агар может быть использован для дифференциации вирулентных колоний дикого типа (красный, CR⁺) и авирулентных (белый, CR^-) колоний, утративших плазмиду вирулентности⁴⁵. Если нестабильность вирулентной плазмиды наблюдается неоднократно, ночные культуры шигелл можно инкубировать при 30 °C для предотвращения потери вирулентной плазмиды с последующим субкультивированием при 37 °C для стимулирования экспрессии гена вирулентности⁴³. Наконец, если проводятся анализы с мутантами и/или комплементарными штаммами, в которых маркеры антибиотиков присутствуют в этих бактериальных штаммах, рекомендуется использовать соответствующий выбор антибиотиков на этапах бактериальной ночи и субкультивирования.

Использование эпителиальных монослоев HT-29 имеет много преимуществ для изучения молекулярных механизмов патогенеза шигелл in vitro. Поскольку шигеллы являются патогеном, адаптированным к человеку, модели мелких животных не совсем точно отражают характерный патогенез шигеллеза, наблюдаемый у человека³⁶. Таким образом, использование стандартизированных протоколов инфицирования клеточных линий человеческого происхождения позволяет количественно исследовать отдельные этапы бактериального патогенеза для характеристики молекулярного взаимодействия между этим патогеном и его нативным хозяином. Исторически сложилось так, что клетки HeLa преимущественно использовались для изучения взаимодействий хозяина и патогена in vitro 25,56,57. Тем не менее, клетки HeLa представляют собой иммортализированную клеточную линию рака шейки матки, которая является ненативными клетками-хозяевами для патогенов кишечных бактерий. Таким образом, исследования in vitro кишечного патогенеза сместились в сторону использования клеточных линий аденокарциномы толстой кишки (например, HT-29, Caco-2 и T84), которые более точно повторяют морфологию кишечного эпителия и могут быть выращены на трансвеллах в виде эпителиальных монослоев с дифференцированными апикальными и базолатеральными поверхностями 58,59,60 . Несмотря на то, что каждая клеточная линия имеет свои сильные и слабые стороны, клетки HT-29 используются в описанных здесь анализах из-за фенотипического сходства с кишечными энтероцитами и сильной экспрессии рецепторов клеточной поверхности и провоспалительных цитокинов 58,59,61. Тем не менее, каждая из этих обсуждаемых моделей представляет собой клеточные линии ракового происхождения с аберрантными метаболическими и ростовыми фенотипами, которые неточно отражают естественное физиологическое состояние эпителия толстой кишки in vivo⁵⁸. Недавние достижения в области методов культивирования тканей человека позволили культивировать стволовые клетки кишечника человека, полученные в результате биопсии тканей, в органоиды или отдельные двумерные клеточные монослои, которые повторяют различные типы клеток, присутствующих в желудочно-кишечном тракте человека 62,63,64. Кишечные органоиды могут быть дифференцированы, включая энтероциты, бокаловидные клетки, продуцирующие слизь, М-клетки и другие тканеспецифичные типы клеток. Недавние исследования подтвердили использование этих органоидных моделей для изучения кишечных патогенов, включая различные Shigella spp., Salmonella enterica и Escherichia coli pathovars 62,63,64. Несмотря на то, что органоиды являются более точными моделями эпителия желудочно-кишечного тракта человека и могут даже культивироваться в различных питательных условиях, чтобы представлять глобальную популяцию⁶⁵, их относительная сложность требует значительной подготовки и технических знаний, что приводит к более высоким затратам и более длительному времени культивирования по сравнению с традиционными линиями раковых клеток⁵⁸.

Этот протокол описывает методы средней пропускной способности, при которых используются две 6-луночные планшеты для получения в общей сложности 12 монослоев, доступных для тестирования. Тем не менее, эксперименты могут быть легко масштабированы, чтобы увеличить количество монослоев, засеянных для размещения дополнительных технических репликаций или тестирования дополнительных мутантов шигелл и сигналов окружающей среды. Планшеты для культивирования тканей с большим количеством лунок (например, 12-луночные или 24-луночные планшеты) также могут использоваться с соответствующей регулировкой для учета лунок с меньшим диаметром. В условиях выращивания HT-29, описанных в шаге 3.2, титров HT-29 достаточно для посева около шести 6-луночных планшетов после культивирования из одной колбы T75 с достаточным количеством оставшихся клеток для поддержания культуры клеток HT-29. Кроме того, посев монослоев HT-29 и подготовка инокуляционных бактерий идентичны для анализов на адгезию, инвазию и внутриклеточную репликацию. Таким образом, анализы, тестирующие одни и те же штаммы шигелл или условия субкультивирования, могут быть легко выполнены параллельно, чтобы одновременно изучить роль каждого экспериментального состояния в различных стадиях инфекции шигелл .

Титры восстановления адгезивных (шаг 4), инвазированных (шаг 5) и внутриклеточных бактерий (шаг 6) определяют путем нанесения покрытий на последовательные разведения инфицированных клеток HT-29 после лизиса, что позволяет количественно оценить эффективность каждой стадии заражения шигеллами. Этапы центрифугирования в анализах инвазии и внутриклеточной репликации, основанные на классических анализах 49,50,51, способствуют бактериальному контакту с клетками-хозяевами для немедленной инвазии и повышения скорости инвазии. Таким образом, центрифугирование «пропускает» стадию адгезии, которая, как выяснилось позже, является важным аспектом инфекции шигелл 17,18,19,66. Важно отметить, что стадия центрифуги не может быть выполнена с поляризованными эпителиальными клетками, засеянными в трансвеллы. Однако при анализе на адгезию прилипание не принудительно центрифугируется, и гентамицин не добавляется к инфицированным клеткам HT-29 перед лизисом, что позволяет перечислить адгезивные бактериальные клетки. Объем питательной среды для тканевых культур уменьшается до 1 мл (в отличие от 2 мл для инвазий и внутриклеточной репликации), чтобы обеспечить более эффективный контакт бактерий с клетками HT-29. Кроме того, в зависимости от скорости адгезии, в течение 3 ч инкубации может произойти некоторая инвазия и внутриклеточная репликация, но их количество, как правило, незначительно (например, только 0,05% выздоровевшей бактериальной популяции после лизиса клеток хозяина). Тем не менее, для правильного учета адгезивных и внутриклеточных бактерий во время 3-часовой инкубации рекомендуется проводить параллельные анализы, где, в дополнение к указанному протоколу, вторую планшет инкубируют с 50 мкг/мл гентамицина в 2 мл ДМЭМ на лунку в общей сложности в течение 45 мин (15 мин инкубация, промывка, свежий ДМЭМ + гентамицин в течение 30 мин) для тщательного лизиса внеклеточных бактерий. После лизиса клеток HT-29, как указано в протоколе, внутриклеточные бактерии могут быть перечислены, как указано выше, и будут представлять собой количество бактерий, которые вторглись. Затем это значение может быть вычтено из бактерий, перечисленных на планшете, без обработки гентамицином, чтобы правильно определить адгезивные и инвазивные бактерии. Параллельный анализ также может быть выполнен для получения более полного представления о внутриклеточной репликации шигелл внутри клеток HT-29 после инвазии, например, используя несколько временных точек для выполнения кривых внутриклеточного роста. Наконец, наряду с подсчетом внутриклеточных бактерий после 18-часовой инкубации гентамицина, надосадочные жидкости культуры могут быть собраны и проанализированы на секрецию цитокинов инфицированных клеток HT-29. Например, IL-8 представляет собой хемокин, секретируемый эпителиальными клетками, который в значительной степени функционирует для рекрутирования PMN к месту инфекции. Количество IL-8, секретируемого в питательной среде инфицированных клеток HT-29, может быть проанализировано с помощью IL-8 ELISA^{анализа 67}.

Желчные соли оказались важным сигналом вирулентности для шигелл во время транзита через желудочно-кишечный тракт человека и могут быть использованы в качестве дополнения питательных сред бактерий в этих протоколах для воспроизведения типичных состояний желудочно-кишечного тракта. Естественно, желчные соли вводятся в двенадцатиперстную кишку или верхнюю часть тонкой кишки, чтобы помочь пищеварению; А в терминальном отделе подвздошной кишки или конце тонкой кишки 95% желчных солей удаляются и возвращаются в кровоток для окончательного отложения в желчном пузыре⁶⁸. Желчные соли обычно имеют концентрацию в тонком кишечнике от 0,2% до 2,0% и обладают естественным бактерицидным действием. Тем не менее, шигеллы, наряду с большинством кишечных бактерий, устойчивы к желчным солям и используют сигналы для^{усиления инфекции}. Несколько исследований документально подтвердили, что воздействие желчных солей, иногда в сочетании с другими сигналами тонкого кишечника, такими как глюкоза, влияет на выживаемость шигелл и регуляцию вирулентности до заражения. Было показано, что шигеллы устойчивы к желчным солям, изменяют экспрессию генов, а также образуют и рассеивают биопленку в условиях, которые воспроизводят транзит в тонком кишечнике^17,69. Исследования показали, что эти изменения приводят к гипервирулентному фенотипу, при котором адгезия и инвазия индуцируются при последующей инфекции толстой кишки шигеллами 17,18,19,48,66. Таким образом, условия, описанные выше, документируют, как субкультивировать шигеллы в желчных солях для имитации транзита в тонком кишечнике перед выполнением анализов на адгезию, инвазию или внутриклеточную репликацию. Указанная форма БСЭ содержит добавленную глюкозу по сравнению с типичным бульоном Лурия (LB)¹⁷. Таким образом, если используется ЛБ, важно также дополнить среду глюкозой (0,5%-2,0% [по массе]), чтобы надлежащим образом учитывать сигналы глюкозы в тонкой кишке¹⁷. Кроме того, как упоминалось выше, все субкультуры шигелл промывают для удаления желчных солей и имитации перехода в толстую кишку для анализа инфекции.

Традиционно, как показано в приведенных выше результатах (Рисунок 1 и Рисунок 2), анализы на инфекции полезны для определения роли конкретного гена в инфекции шигелл . Фенотип различных мутантов, однако, не может быть по-настоящему оценен без надлежащего добавления бактериальных питательных сред. Как показали предыдущие исследования, желчные соли значительно изменяют экспрессию генов S. flexneri , включая гены центрального метаболизма, транскрипционных факторов, транспортеров сахара, лекарственной устойчивости и генов вирулентности, кодируемых либо в хромосоме, либо в вирулентной плазмиде¹⁷. Эти гены дают представление о том, как шигеллы используют желчные соли в качестве сигнала для изменения экспрессии генов и подготовки к возможной инфекции толстой кишки, и, таким образом, последующие мутационные анализы должны быть выполнены в соответствующей дополненной питательной среде для бактериального роста, прежде чем изучать влияние на вирулентность в анализах адгезии, инвазии и внутриклеточной репликации. Как видно выше на рисунке 1 и рисунке 2, мутация ΔVF не влияла на адгезию, но влияла на инвазию и внутриклеточную репликацию. Поскольку мутация усилила инвазию и внутриклеточную репликацию, в настоящее время проводятся эксперименты, чтобы определить, как генный продукт регулирует инфекцию. Мутантные анализы служат примером того, как можно изучать новые представления о патогенезе шигелл , особенно в условиях, которые лучше воспроизводят желудочно-кишечный тракт человека. Для валидации фенотипов различных мутантов рекомендуется проводить надлежащие анализы комплементации.

В сочетании эти процедуры описывают количественные эксперименты, которые позволят получить важное представление о молекулярных механизмах прилипания, инвазии и репликации шигелл внутри эпителиальных клеток толстой кишки путем наилучшей имитации естественной среды желудочно-кишечного тракта человека во время инфекции. Будущие исследования могут расширить изучение мутантов и экспериментальных условий, чтобы лучше понять, как шигеллы подготавливают и эффективно заражают людей-хозяев. Несмотря на десятилетия исследований, еще многое предстоит узнать об инфекции шигелл.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье

Имя	Компания	Каталожный номер	Комментарии
0,22 μ m PES фильтр	Millipore-Sigma	SCGP00525	Стерильный, полиэфирсульфоновый фильтр для стерилизации до 50 мл сред
14 мл пробирок для культур	Corning	352059	17 мм x 100 мм полипропиленовые пробирки с крышкой
50 мл конические пробирки	Corning	430829	50 мл прозрачные полипропиленовые конические донные центрифуги с герметичной крышкой
6-луночные планшеты для тканевых культур	Corning	3516	Пластины обработаны для оптимального прикрепления клеток
Соли желчных кислот	Sigma-Aldrich	B8756	соотношение холата к дезоксихолату
Конго красный краситель	Sigma-Aldrich	C6277	Анионный диазокраситель на основе бензидина, чистота >85%
Предметное стекло камеры для подсчета клеток Countess	Invitrogen	C10283	Для использования с автоматическим счетчиком клеток Countess
Диметилсульфоксид (ДМСО)	Sigma-Aldrich	D8418	A высокополярный органический реагент
Dulbecco' Модифицированная среда Eagle Medium (DMEM)	Gibco	10569-010	DMEM дополнена высоким содержанием глюкозы, пирувата натрия, GlutaMAX и фенола Красная
фетальная бычья сыворотка (FBS)	Sigma-Aldrich	F4135	Термоинактивированный, стерильный
гентамицин	Sigma-Aldrich	G3632	Стоковая концентрация составляет 50 мг/мл
HT-29 клеточная линия	ATCC	HTB-38	Аденокарцинома клеточная линия; колоректальная в
происхождение Парафиновая пленка	Bemis	PM999	Лабораторная герметизирующая пленка
Чашки Петри Thermo Fisher Scientific	FB0875713	100 мм x 15 мм Чашки Петри для твердых сред
Фосфатно-солевой буфер (PBS)	Thermo Fisher Scientific	10010049	1x концентрация; pH 7,4
Select Agar	Invitrogen	30391023	Смесь полисахаридов, извлеченных из клеточных стенок красных водорослей для изготовления бактериальных гальванических сред
T75 колбы	Corning	430641U	Колбы для культуры тканей
Triton X-100	Sigma-Aldrich	T8787	Распространенное неионогенное поверхностно-активное вещество и эмульгатор
Трипановый синий краситель	Invitrogen	T10282	Краситель для обнаружения мертвых тканей культивируемых клеток; только живые клетки могут исключить краситель
Trypsin-EDTA	Gibco	25200-056	Реагент для диссоциации клеток для поддержания клеточной линии и пропускания
Триптический соевый бульон (TSB)	Sigma-Aldrich	T8907	Бактериальные питательные среды